وهنا يقدم تقنية حقن intrathecal مباشرة باستخدام 1% ليدوكائين هيدروكلوريد في حل فيروسية لضمان تسليم الفيروسات الكفاءة المرتبطة بالغدد للحيوانات الصغيرة، وإنشاء نظام لتسجيل النقاط للتنبؤ بكفاءة توصيل في وسط الجهاز العصبي وفقا لدرجة ضعف عابرة الناجمة عن ليدوكائين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
حقن Intrathecal (IT) من الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) لفت اهتمام كبير في العلاج الجيني CNS حكم السلامة، نونينفاسيفينيس، وكفاءة توصيل ممتازة في الجهاز العصبي المركزي. أظهرت الدراسات السابقة فاعلية علاجية للعلاج الجيني تسليم إف في اضطرابات الأعصاب به الإدارة. ومع ذلك، سجلت معدلات عالية من الفشل لا يمكن التنبؤ بها بسبب التقادم التقني لإدارة تكنولوجيا المعلومات في الحيوانات الصغيرة. هنا، قمنا بإنشاء نظام لتسجيل النقاط للإشارة إلى مدى نجاح البزل القطني في الحيوانات الصغيرة عن طريق إضافة 1% ليدوكائين هيدروكلوريد في حقن المحلول. نعرض كذلك أنه يمكن التنبؤ بمدى ضعف عابرة بعد حقن كفاءة توصيل إف. وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب أنه حقن لتحسين التجارب العلاجية في نماذج الماوس من أمراض الجهاز العصبي المركزي التي تصيب مناطق واسعة من الجهاز العصبي المركزي.
المقدمة
إف يمكن التوسط في التعبير الجيني طويلة الأجل وواسعة النطاق في توصيل الجهاز العصبي المركزي مع عدد قليل من الآثار الجانبية، ولذلك أصبحت واحدة من السيارات الأكثر تبشيرا بالنجاح للعلاج الجيني لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك التصلب العضلي الجانبي (المرض)، هنتنغتون المرض (HD) ومرض الزهايمر (AD)، وأمراض التخزين الليزوزومية (LSD)، المرض Gaucher (المدير العام)، والخلايا العصبية سيرويد ليبوفوسسينوسيس (نكل)1. حاليا، أكثر من 100 إف اللقاح تم عزلها من البشر والحيوانات. ومن بين هذه استخدمت على الأقل 12 في السريرية والتجارب السريرية، بما في ذلك الأكثر شيوعاً استخدام ناقلات الجينات مثل AAV1، 2، 4، 5، 6، 8، 9، rAAVrh.8، و rAAVrh.10
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
كانت ولدت الفئران ففب/نيو جيرسي في منشأة الحيوان من "المختبرات الرئيسية للأعصاب خبي". جميع الماوس التجارب كانت وافقت "المستشفى من خبي الطبية جامعة أخلاقيات اللجنة الثانية" ونفذت وفقا للوائح إدارة الحيوانات المختبرية أصدرت وزارة العلوم والتكنولوجيا في الجمهورية الشعبية الصين.
1-إعداد 20% ليدوكائين هيدروكلوريد الأسهم الحل
- وزن 2 غ ليدوكائين هيدروكلوريد. إضافة 5 – 6 مل من الماء المعقم ودوامه بلطف. زيادة مستوى الصوت إلى ما مجموعة 10 مل بالماء المعقم.
- 1.2 تصفية الحل الأسهم من خلال مرشحات 0.2 ميكرون. قاسمة الحل الأسهم، 1 مل كل 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة، وختم ذلك بفيلم ختم. مخزن في 4 درجات مئوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وأظهرت الفئران درجات مختلفة من الضعف عابر الحق بعد ذلك حقن إف الحل في 1% ليدوكائين هيدروكلوريد نظراً لنوعية مختلفة من حقن intrathecal. وفقا لشبه كمي نظام التهديف الصف 5 وقد أنشأنا، اختبرنا أنماط توصيل إف في الفئران بدرجات مختلفة من الضعف الناجم عن ليدوكائين أطرافهم (نقاط 0، ن = 2؛ ونقاط 1، n = 1؛ ونقاط 4، ن = 4؛ ونقاط 5، n = 3). أظهرت immunostaining اجفب من الحبال الشوكي أما لا يوجد أو قليل توصيل في الحبل الشوكي القطني من الفئران التهديف 0 وتوصيل زيادة طفيفة في الفئران التهديف 1 وترانسدوك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
من الناحية الفنية، هناك العديد من الخطوات الحاسمة خلال تكنولوجيا الحقن في الفئران مستيقظا. أولاً، سليم لفتة وشركة مراقبة الفئران طوال العملية برمتها شرط مسبق للنجاح في إيصال. ثانيا، النقطة الأكثر صعوبة هو شعور المسافة الفقرية بطرف الإبرة، أنه من الضروري عدم إدراج عميقا جداً دون مقاومة أو إدراج عنوة تحت مقاومة قوية في حالة إصابة الحيوانات أو ثني طرف الإبرة. ثالثا، رغم الشلل عابر بسبب ليدوكائين يوفر مؤشر موضوعي لأنها نوعية الحقن، مطلوب مزيد من الممارسة لتحقيق نتائج متسقة وناجحة.
وفي هذا التقرير،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل بمنحه مقدمة من إدارة مقاطعة خبي من الموارد البشرية والضمان الاجتماعي (CY201605)، ومنحة من "مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة خبي" (H2017206101)، ونحن ممتنون جداً للدكتور قاو شوانغبينغ، الذين قدموا إف هذه الدراسة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الفئران FVB / NJ | مختبرات نهر تشارلز الصين | ||
| هيدروكلوريد ليدوكائين أحادي الهيدرات | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | نواقل الفيروس الأساسية لمركز العلاج الجيني في كلية | ||
| 25 & L حقنة هاميلتون / 27-30 جم إبرة | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2< / sub>O 2< / sub> | SHUI HUAN PAI | ||
| مصل الماعز | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| أرنب مضاد للجنيه | Life tech | G10362 | 1:333 التخفيف |
| الجسم المضاد الثاني (مضاد للأرانب الماعز) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1: 1,000 التخفيف |
| VECTASTAIN ABC RECODE | مختبر ناقلات | المختبر PK-6100 | |
| ImmPACT DAB بيروكسيداز الركيزة كيت | ناقلات المختبر | SK-4105 | |
| وسط تركيب للتألق مع DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | يونغ دا الكيميائية | ||
| NaH 2< / sub >PO 4 < / sub > & middot ؛ 2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4· 12H2< / sub>O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| التصاق المجهر الشرائح | CITOGLAS | 17083 | 25 مم × 75 مم |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | الفحص المجهري الكهربائي Siences | 72236-60 | 24 مم × 60 مم |
| 15 مل أنبوب الطرد المركزي | CORNING | 430790 | |
| 96 جيدا مجموعة زراعة الخلايا | Coster | 3599 | |
| 24 مجموعة ثقافة خلايا البئر | Coster | 3524 | |
| 70٪ Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8 سم × 10 سم × 12 سم |
| 1 مل حقنة | هونغ دا | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| مرشح | MILLEX GP | مضخة R4PA42342 | |
| LongerPump | BT-100-2J / YZ1515X | ||
| مجهر | أوليمبوس | BX53 | |
| تجميد ميكروتوم | لايكا | CM1520 |
المراجع
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
