مقالة منهجية

تحليل ديناميات Actomyosin في جداول الخلوية والأنسجة المحلية باستخدام أفلام الفاصل الزمني من غرف البيض Drosophila المستزرعة

DOI:

10.3791/58587

⸱

يونيو 3, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2Center for Systems Biology Dresden

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول منهجية قائمة على فيجي وسهلة الاستخدام إلى جانب تعليمات مباشرة تشرح كيفية تحليل سلوك الكنتوموسين بشكل موثوق في الخلايا الفردية والأنسجة الظهارية المنحنية. لا توجد مهارات البرمجة المطلوبة لمتابعة البرنامج التعليمي. يتم تنفيذ جميع الخطوات بطريقة شبه تفاعلية باستخدام واجهة المستخدم الرسومية من فيجي والإضافات المرتبطة بها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويسمى البيض Drosophila غير ناضجة غرف البيض، وهيكلها يشبه الأجهزة البدائية التي تخضع للتغيرات المورفولوجية من جولة إلى شكل القطع الناقص أثناء التنمية. وتسمى هذه العملية التنموية oogenesis وحاسمة لتوليد البيض ناضجة وظيفية لتأمين الجيل القادم ذبابة. لهذه الأسباب، كانت غرف البيض بمثابة نموذج مثالي وذي صلة لفهم تطور الأعضاء الحيوانية.

وقد وضعت عدة بروتوكولات الزراعة في المختبر، ولكن هناك العديد من العيوب لهذه البروتوكولات. واحدة يتضمّن التطبيق من تغطيات مختلفة أنّ يمارس ضغطة اصطناعيّة على ال يصور بيضة غرف [إين وردر تو] عاقمتهم وأن يزيد ال يصور اكتساب مستوى من السطح محيطيّة من ال يحلّ بيضة غرف. مثل هذا النهج قد تؤثر سلبا على سلوك آلات actomyosin رقيقة التي تولد القدرة على تدوير غرف البيض حول محورها أطول.

وهكذا، للتغلب على هذا القيد، ونحن ثقافة غرف البيض Drosophila بحرية في وسائل الإعلام من أجل تحليل موثوق آلات actomyosin على طول محيط غرف البيض. في الجزء الأول من البروتوكول، نقدم دليل بالتفصيل كيفية تحليل آلات actomyosin في طائرة اقتناء محدودة على نطاق الخلوية المحلية (ما يصل إلى 15 خلية). في الجزء الثاني من البروتوكول، ونحن نقدم للمستخدمين مع البرنامج المساعد الجديد مقرها فيجي التي تسمح استخراج بسيطة من طبقة رقيقة محددة من سطح غرف البيض المحيطية. ثم يصف البروتوكول التالي كيفية تحليل إشارات الأتوموسين على مقياس الأنسجة (>50 خلية). وأخيرا، نحدد أوجه القصور في هذه النهج على كل من النطاقات الخلوية والأنسجة المحلية ونناقش تطورها المحتمل في المستقبل وتطبيقاتها الممكنة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أدى التطوير المستمر لتكنولوجيات التصوير والبرمجيات الجديدة ذات التطبيقات في علوم الحياة إلى تأثير هائل على فهم المبادئ الأساسية للحياة. أحد التحديات الرئيسية هو التصور الموثوق به للعمليات التنموية بالاقتران مع تصويرها الحي في أنسجة مختلفة. الأنسجة هي أجزاء من الأعضاء والهيئات، وعلى هذا النحو، فإن الغالبية لا يمكن الوصول إليها بسهولة للتصوير. ولذلك، تم وضع بروتوكولات تسمح بتشريحها والزراعة في المختبر من أجل تصور الأحداث البيولوجية التي تعكس بما فيه الكفاية حالة في الجسم الحي داخل الجسم الحي.

على مدى العقود الماضية، وقد ساهم زراعة والتصوير الحي لغرف البيض Drosophila، هياكل تشبه acinar تشبه الأجهزة البدائية، بشكل كبير في فهم المبادئ الأساسية لتطوير الأعضاء البدائية1 , 2 , 3.حاليا، هناك العديد من بروتوكولات الزراعة المتاحة، واستخدامها يعتمد على وقت اكتساب، ونوع الخلية ليتم تصويرها، وسهولة الوصول إليها (على سبيل المثال، الجرثومية الداخلية مقابل الخط الجسدي الخارجي)4.

ومن السمات الشائعة في جميع بروتوكولات الزراعة هذه الحاجة إلى تجميد غرف البيض التي تم تحليلها التي تعرض نشاط ًا منضدية عالية في الوسائط السائلة. ويتسبب النشاط العقدي من غرف البيض أساسا من ورقة العضلاتالتي تغطي سلسلة طويلة من غرف البيض المتصلة 5،6،7. لذلك، لتحقيق الجمود السليم من غرف البيض الشباب، وقد وضعت نهج مختلفة،والتي تنطوي على تغطية غرف البيض مع الأغطية 6،8،9 أو البطانيات المرنة4، 10 أو تضمينها في منخفضة ذوباننقطة agarose 3،11. هذه النهج تحظى بشعبية لأنها تسمح أيضا بتصوير طائرة بصرية أكبر بسبب تسطيح خفية من سطح محيطي من غرف البيض.

ومع ذلك، في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن غرف البيض الشباب (المرحلة 1-8) تدور حول محورها الأمامي الخلفي6، وأن هذه الحركة الأنسجة مدعوم من شبكة actomyosin غرامة قريبة من السطح المحيطي من هذه الغرف البيض الشباب 12.ولذلك، فإن التغيير الاصطناعي للسطح الخلوي الناجم عن تسطيح خفية من هذا النسيج قد يكون لها تأثير سلبي على سلوك آلات actomyosin توليد القوة. والنقطة المضادة هي أنه إذا لم يتم تسطيح أنسجة غرفة البيض، فإن التصوير المجهري للبروتينات على السطح المحيطي لغرف البيض يصبح أكثر محدودية بسبب انخفاض حجم مستوى الاستحواذ.

لذلك، قمنا بالجمع بين بروتوكولات من Prasad وآخرون9 ومختبر سيليست بيرغ 4،10 وتعديلها مرة أخرى بحيث لا يتم استخدام غطاء / بطانية مرنة / أجاروز في الطريقة المتقدمة. يتم زراعة غرف البيض Drosophila بحرية في وسائل الإعلام والبروتوكول المعروض هنا ينطبق فقط المجهرية المقلوبة. هناك جزأين للبروتوكول. ويركز الجزء الأول على تحليل إشارات الأتوموسين على النطاق الخلوي المحلي (ما يصل إلى 15 خلية) داخل غرف البيض. في الجزء الثاني، نركز على التغلب على القيود المرتبطة بطائرة اقتناء صغيرة بسبب زراعة غرف البيض مجاناً. وفي هذا الصدد، قمنا بتطوير طريقة حسابية جديدة مقرها فيجي مع واجهة مستخدم رسومية شبه تفاعلية تستخرج وتتكشف بشكل انتقائي طبقات محددة من سطح الأنسجة المحيطية. ويلي ذلك بروتوكول يصف كيفية تحليل الكنتوموسين على مقياس الأنسجة (أي، >50 خلية). وبما أن الاستخراج الانتقائي لطبقة رقيقة محددة من الأنسجة الظهارية المنحنية لم يكن من الممكن بسهولة باستخدام إسقاط z-stack الكلاسيكي (الشكل1)، فإن هذه الطريقة السهلة الاستخدام بمثابة شرط مسبق هام لفهم الأنسجة الظهارية بشكل شامل سلوك شبكة أكميوسين رقيقة (<1 μm) على مقياس الأنسجة في غرف البيض دروسوفيلا.

بالإضافة إلى ذلك، لتسهيل البروتوكول، نقدم مثال أفلام الفاصل الزمني (TLMs) وملفات عينة من سلوك Myosin II التقليدي غير العضلي ذو العلامات الفلورية (انظر الملف التكميلي3). Myosin II هو بروتين محرك ويمثل الجزء التقلصي النشط من آلات actomyosin. من أجل صورة Myosin الثاني، ونحن نستخدم خطوط Drosophila المعدلة المعدلة التي تحتوي على سلسلة ضوء التنظيمية المعدلة من Myosin الثاني دعا MRLC::GFP (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل)12،13. من أجل تصور أغشية الخلايا، ويستند البروتوكول على الأصباغ التجارية (انظر جدولالمواد). هذا البروتوكول هو مناسبة ليس فقط لتحليل الصغيرة دون الخلوية MRLC::GFP إشارات12 ولكن أيضا لأي جزيئات شبه خلوية مماثلة الحجم حول ± 300 درجة مئوية، مثل تلك التي لوحظت مع Life-Act::GFP12,14.

على الرغم من أن كلا البروتوكولين يتم تقديمها باستخدام غرف البيض Drosophila المستزرعة في المختبر، يمكن أيضا أن يتم الحصول على إشارات الactomyosin باستخدام أنسجة أخرى على الاستفادة المثلى من وسائل الإعلام زراعة واعتمادا على توافر من البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الأصباغ التجارية المقابلة أو، على سبيل المثال، الحقن المجهرية mRNA للحصول على ملامح التعبير الجيني العابر. وبالمثل، يمكن تطبيق البروتوكول القائم على فيجي لاستخراج طبقة رقيقة من سطح محيطي بشكل أعم على الأنسجة المثلة بالقطع الناقص والأعضاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يوفر البروتوكول التالي إرشادات حول كيفية تحليل الأتوموسين في الخلايا المحلية ومقياس الأنسجة في غرف البيض دروسوفيلا. يسمح النهج المحلي للمستخدمين بتحليل سلوك الكنتوموسين المفصل في ما يصل إلى 15 خلية لكل غرفة بيض ويتطلب الحصول على TLMs لفترة قصيرة من الزمن (5-10 دقيقة) باستخدام التصوير عالي السرعة ومجهر مقلوب. وعلى النقيض من ذلك، يوفر مقياس الأنسجة للمستخدمين معلومات الكنتوموسين في 50-100 خلية ويتطلب الحصول على TLMs لفترة طويلة من الزمن (≥ 30 دقيقة) باستخدام التصوير منخفض السرعة ومجهر قرص الغزل المقلوب (انظر الشكل 2 و المعلمات الموصى بها في كل مقياس في الجدول1). يعتمد القرار الذي يتم في أي مقياس لتحليل إشارات الأتوموسين بشكل كامل على السؤال العلمي للمستخدم. يجب أن تساعد TLMs الاختبار المصاحبة في اتخاذ هذا القرار.

1. مقياس الخلوية المحلية (LCS)

ملاحظة: لتشريح وصورة في المختبر مثقف غرف البيض Drosophila، اتبع البروتوكول الموصوف في الملف التكميلي 1. لتحليل TLMs المكتسبة، تابع مع البروتوكول التالي. يتم توفير ارتباطات إلى ملفات الاختبار المصاحبة لـ TLMs في الملف التكميلي 3.

  1. معالجة بيانات TLMs على مقياس الهواتف الخلوية المحلية (LCS)
    1. تصحيح التبييض من TLMs للتعويض عن اضمحلال كثافة التسميات الفلورية
      1. تأكد من تثبيت تطبيق فيجي محدث على الكمبيوتر المستخدم باتباع هذه الإرشادات: Fiji > فتح TLM (على سبيل المثال، TestMovie1.tif من الملف التكميلي 3).
      2. تقسيم قنوات الألوان بالنقر فوق صورة > اللون > تقسيم القنوات.
      3. إجراء تصحيح التبييض على كلتا القناتين باستخدام صورة > ضبط > تصحيح التبييض > نسبة بسيطة > كثافة الخلفية 0.0.
        ملاحظة: إذا تم الحصول على نتائج غير مرضية، واستكشاف أي طرق التصحيح في هذا البرنامج المساعد يناسب أفضل (على سبيل المثال، استخدام مطابقة الرسم البياني بدلا من نسبة بسيطة).
    2. تجزئة الخلية لإنشاء قناع خلية لـ TLMs
      1. إذا لم تكن فيجي مفتوحة بالفعل، فأعد فتحها (وتأكد من تحديثها) بعد التعليمات > تحديث > تطبيق التغييرات > موافق.
      2. إذا لم يتم ذلك بالفعل، قم بتنزيل الماكرو TissueCellSegmentMovie.ijm (من http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). اسحب هذا البرنامج النصي وأسقطه في فيجي.
      3. افتح الملف .tiff الذي تم تصحيحه بالتبييض (راجع القسم 1.1.1). تقسيم قنوات الملف تصحيح التبييض باستخدام صورة > اللون > تقسيم القنوات.
      4. تشغيل البرنامج النصي الذي تم تحميله على قناة غشاء الخلية النشطة من TLM المحدد عن طريق الضغط على الرمز تشغيل في البرنامج النصي المفتوح. تعيين طمس غاوسي إلى 2.500 وحساسية الكشف عن الخلية إلى -1 وانقر فوق موافق. من أجل الحصول على قناع خلية لطيفة، لا تغيير هذه المعلمات أعلاه. قم بتعيين التسامح المتوقع للضوضاء بين 10-20 لـ TLMs التي تم الحصول عليها مع هدف 63x وانقر فوق موافق.
        ملاحظة: وبالنسبة لأهداف أخرى، قد تكون هناك حاجة إلى بارامترات مختلفة. الأنظف الخلفية في TLM، مطلوب التسامح الضوضاء المقدرة أقل.
      5. يظهر قناع الخلية التي تم إنشاؤها في TLM تحليلها وأيضا في نافذة جديدة تسمى ParticleStack (G)،وبالإضافة إلى ذلك، يظهر نافذة صغيرة تسمى العمل المطلوب. من قناع الخلية على TLM، والتركيز فقط على الخلايا في وسط TLM واختيار تلك التي يمكن أن توفر الخطوط العريضة كاملة ومحددة جيدا في جميع أنحاء TLM.
      6. إذا كانت الخلايا المحددة تحتوي على مخططات خلايا اصطناعية/إضافية، استخدم إطار أداة الدمج المسمى الإجراء المطلوب في TLM. بالنسبة لهذا الأخير، اتبع الإرشادات الموجودة في النافذة.
        ملاحظة: تأكد من أن الخطوط العريضة للخلايا محددة بشكل جيد وتتوافق مع أغشية الخلايا الحقيقية في TLM لأن أي عدم دقة قد يؤثر على التحليلات اللاحقة. يمكن إجراء تعديلات وتغييرات إضافية، مثل إزالة الخلايا غير المرغوب فيها، لاحقًا باستخدام أداة مدير Surface (الموضحة في القسم 1.1.3).
      7. عندما تتوافق الخلايا المحددة في المركز بشكل جيد مع أغشية الخلايا الحقيقية، احفظ ParticleStack كملف .tiff بعد ملف > حفظ باسم > Tiff.
    3. تحميل قناع الخلية الذي تم إنشاؤه في إدارة Surface
      1. تثبيت سطح مدير المساعد15 في إعداد فيجي المستخدمة. اتبع تعليمات فيكتوريانوفا وآخرون16.
      2. افتح Surface Manager باستخدام الإضافات > التجزئة > مدير Surface (3D).
        ملاحظة: يعرض إطار إدارة Surface عدة أزرار إجراء على اليمين وإطار فارغ على اليسار. لمشاهدة كافة أزرار الإجراء، قد يكون مطلوباً لتمدد الإطار في ارتفاعه/عرضه. لاحظ أن الإطارات الزمنية ستظهر كشرائح z.
      3. افتح الملف .tiff ParticleStack المطابق في Surface Manager بالنقر فوق ملف > فتح وحدد الصورة لفتحها (على سبيل المثال، ParticlesStack1.tif).
      4. في Surface Manager، انقر فوق الزر قراءة صورة المخطط التفصيلي وتعيين فهرس الجاكار إلى 60%.
        ملاحظة: تحميل الملف ParticlesStack1.tif يمكن أن يستغرق عدة دقائق، اعتماداً على طاقة معالجة الكمبيوتر.
      5. بمجرد تحميلها، سيتم تعيين كل خلية برقم S وتظهر في الجزء الأيسر من إطار إدارة Surface.
        ملاحظة: لإظهار المخططات التفصيلية وأسماء الخلايا لكافة الخلايا، حدد خانات الاختيار إظهار الكل وإظهار التسميات في أسفل إطار مدير Surface. من المستحسن استخدام هذه الوظيفة بمجرد التحقق من أرقام الخلايا للتأكد من صحتها.
      6. انقر على رقم S الأول; يظهر مخطط الخلية المستوردة من ParticlesStack1.tif على TLM. تحقق من كل رقم S المستوردة لجودة مخطط الخلية في جميع أنحاء TLM وإزالة الخلايا غير المرغوب فيها التي تعرض مخططات الخلايا غير صحيحة. للقيام بذلك، قم بتمييز مخطط الخلية وانقر على الزر حذف.
        ملاحظة: ومن الممكن أيضا لتصحيح الخطوط العريضة للخلية غير دقيقة وإضافة الخطوط العريضة للخلية الجديدة. ويرد وصف ذلك في قسم المناقشة.
      7. حفظ كافة الخلايا التي تم تصحيحها كملف RoiSet.zip عن طريق الضغط على الزر حفظ إلى القرص.
        ملاحظة: إذا كانت جلسة العمل تحتاج إلى مقاطعة، فمن الممكن تحميل الملف RoiSet في إدارة Surface لاحقاً: فتح TLM في فيجي (ملف > فتح)وحدد TLM. فتح مدير السطح عن طريق الإضافات > تجزئة > مدير السطح (3D). قم بتحميل الملف RoiSet.zip المطابق بالنقر فوق الزر تحميل من القرص واختيار الملف RoiSet.zip المناسب. تحقق مرتين من أن أقنعة الخلايا المحملة تتوافق مع TLM المحملة.
    4. تصحيح لانحراف الأنسجة في TLMs
      ملاحظة: خلال وقت الاستحواذ على TLMs، يمكن ملاحظة آثار الانجراف بسبب دوران الظهارية أو حركة غير مرغوب فيها. في كلتا الحالتين، نوصي بتصحيح أي انحراف من أجل تبسيط تحليل actomyosin اليدوي في وقت لاحق. مطلوب تصحيح الانجراف فقط لتحليل actomyosin اليدوي. هذا البرنامج التعليمي يتطلب ما يصل إلى تاريخ برنامج فيجي مع البرنامج المساعد MultiStackReg (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) مثبتة.
      1. فتح TLM تصحيح التبييض في فيجي عن طريق ملف > فتح وحدد ملف تصحيح التبييض التي تم إنشاؤها باستخدام البرنامج التعليمي المذكورأعلاه.
      2. تقسيم القنوات وتحديد واحد الذي يحدد أغشية الخلايا عن طريق صورة > اللون > تقسيم القنوات.
      3. استخدم البروتوكول التالي عندما لا تكون الخطوط العريضة للخلية ناعمة بشكل واضح: معالجة > المرشحات > ضبابية غاوسية. قم بتعيينه إلى ~ 1-2 لهدف 63x وانقر فوق موافق ثم نعم. انقر فوق عملية > ثنائي > تحويل إلى قناع باستخدام الإعدادات الافتراضية; ثم انقر فوق موافق.
      4. تحميل البرنامج المساعد MultiStackReg التالية الإضافات > التسجيل > MultiStackReg.
      5. تأكد من تعيين المكدس 1 إلى قناة غشاء الخلية، يتم تعيين الإجراء 1 إلى محاذاة، ويتم تعيين التحويل إلى الترجمة. حدد خانة الاختيار حفظ ملف التحويل ثم انقر فوق موافق.
      6. إعادة فتح TLM المحدد، والبرنامج المساعد MultiStackReg، وملف التحويل المحفوظة باستخدام ملف > فتح وحدد TLM. تقسيم قنوات الألوان باستخدام Image > اللون > قنوات سبليت.
      7. تحميل البرنامج المساعد MultiStackReg عن طريق النقر على الإضافات > التسجيل > MultiStackReg. حدد ملف تحويل التحميل كإجراء 1.
      8. ترك التحول كجسم جامد وانقر فوق موافق. حدد ملف التحويل الذي تم حفظه مسبقاً ثم انقر فوق موافق مرة أخرى.
      9. دمج قنوات الصورة وحفظ TLM المسجلة كملف .tiff بعد الصورة > اللون > دمج القنوات. حفظ الملف بالنقر فوق ملف > حفظ باسم > Tiff.
        ملاحظة: هناك طرق بديلة لتصحيح الانجراف الأنسجة في فيجي، وهي عن طريق الإضافات > التسجيل > StackReg / تصحيح الانجراف 3D.
  2. تحليل نبضات الكنتوموسين في مدير Surface في LCS
    ملاحظة: تسمح هذه الخطوة البروتوكولية للعلماء بتحديد ما إذا كانت نبضات الكنتيوموسين موجودة في الأنسجة التي تم تحليلها وفهم السلوك التفصيلي وكذلك اتجاه إشارات الأتيوميوسين.
    1. فتح فيجي والتأكد من أن TLM وقناع الخلية المقابلة لها مفتوحة في مدير Surface.
      ملاحظة: تأكد من تثبيت فيجي ومحدثة ويتم تثبيت البرنامج المساعد مدير Surface (الخطوة 1.1.3.1).
    2. افتح TLM مع ملف > افتح وحدد TLM لفتح (على سبيل المثال، TestMovie1_bleach.tif). تحميل البرنامج المساعد مدير السطح عن طريق الإضافات > تجزئة > مدير السطح (3D). تحميل قناع الخلية المحفوظة التي تم إنشاؤها في البرنامج التعليمي هنا (على سبيل المثال، ParticlesStack1.tif) عبر ملف > فتح وحدد قناع الخلية (على سبيل المثال، ParticlesStack1.tif). قم بتحميل المنطقة ذات الأهمية المقابلة (عائد الاستثمار، على سبيل المثال، TestMovie1_RoiSet.zip). انظر الشكل 3 ألف.
    3. قم بالتبديل إلى قناة الاهتمام بـ TLM المحدد.
      ملاحظة: لتمييز القنوات، اتبع رمز اللون المشار إليه حول TLM.
    4. في Surface Manager، انقر فوق الزر إحصائيات للحصول على إطار يسمى متوسط القيمة الرمادية شريحة حسب الشريحة (الشكل3B). لاحظ أنه سيتم عرض قيم الكثافة المتوسطة/الوسيطة لإشارات الكنتيوموسين في قناة معينة تم تحليلها داخل مخططات الخلايا المحددة مع مرور الوقت، بالإضافة إلى المعلمات الأخرى المتعلقة بمنطقة الخلية وشكل الخلية.
      ملاحظة: قيم الكثافة هي في وحدات التحكيم (A.U.); منطقة الخلية بالبكسل وتحتاج إلى تحويلها إلى ميكرومترات مربعة.
    5. حفظ القيم التي تم الحصول عليها كملف جدول بيانات. انقر على نافذة الإحصائيات، ملف > حفظ باسم.
      ملاحظة: من الممكن التحقق من القيم الإحصائية التي تم الحصول عليها في وقت لاحق على النحو التالي: فتح TLM تصحيح التبييض في فيجي وفتح مدير السطح. قم بتحميل RoiSet.zip المطابق إلى TLM عن طريق الضغط على الزر تحميل من القرص وفتح الملف. سيتم تحميل القناع المحفوظ مع الخطوط العريضة للخلية وستظهر أسماء الخلايا في إطار مدير Surface الأيسر. انقر فوق الزر إحصائيات للقيم الإحصائية.
  3. التحليل اليدوي لإشارات الأتوموسين دون الخلوية الفردية في LCS
    ملاحظة: ويتطلب هذا البروتوكول أكبر قدر من التركيز ويستغرق وقتا طويلا. بشكل عام، يمكن تحليل واحد TLM المكتسبة بشكل مريح في غضون يوم واحد. وهذا لا يشمل الوقت لإعداد ذبابة قبل تشريحها، وتشريح نفسها، والحصول على صورة.
    1. فتح TLM مختارة ومصوبة بالتبييض ومسجلة (مصححة بالانجراف) في طلب محدّث لفيجي. استخدم TLM مصوبًا ومصححًا بالانحراف (على سبيل المثال، TestMovie1_bleach_reg.tif) كمثال اختباري.
    2. اضبط السطوع والتباين لرؤية إشارات الكنتوموسين الفردية باستخدام الصورة > ضبط > السطوع/التباين.
    3. محاذاة TLMs في نفس الاتجاه بالنسبة إلى محور الأنسجة / الجسم. في حالة غرف البيض، محاذاة الجانب الأمامي من غرف البيض دائما إلى يسار الصورة / الفيلم الفرعي / TLM قبل التحليل.
    4. تقسيم الفيلم المحدد إلى أفلام فرعية قصيرة 30 s والوقت المشروع كل واحد منهم. حفظ الأفلام الفرعية غير المتوقعة والمتوقعة بالوقت مع الأسماء المقابلة. احتفظ بالمصدر الأصلي.
      ملاحظة: يمكن إنشاء الأفلام الفرعية من TLMs الأصلي عن طريق حذف الإطارات غير المرغوب فيها أولاً عبر Image > مكدسات > مزيل الشرائح. تعريف الشرائح التي سيتم إزالتها وتعيين الزيادة. قم بالتحويل إلى RGB قبل استخدام مزيل الشرائح عند الزيادة = 1. لمشروع الوقت فيلم فرعي 30 s، انقر فوق صورة > مكدسات > Z-project > الحد الأقصى للكثافة للإطارات المعرفة (الشرائح) ثم انقر فوق موافق. تخطي كل ثانية 30 ثانية s الفيلم الفرعي من أجل تجنب عد إشارات actomyosin 2X في اثنين من الأفلام الفرعية 30 ثانية اللاحقة.
    5. وضع صورة مسقطة الوقت بجانب الفيلم الفرعي 30 ق المقابلة (الشكل4A، B). حدد خط الإشارة في الفيلم الفرعي المتوقع في الوقت المحدد. حدد اتجاه حركة إشارة الكنتوموسين (0°-360 درجة) على طول هذا الخط في الفيلم الفرعي الأصلي عن طريق تشغيل الفيلم الفرعي يدويًا. استخدم أداة الزاوية (في شريط فيجي) لقياس اتجاه حركة الإشارة يدويًا بالنسبة إلى محور الأنسجة المحدد أو أداة متوفرة مشابهة.
      ملاحظة: لا تعمل فيجي إلا على مقياس 0°-180° (الشكل4C)،ويلزم إعادة حساب القيم التي تم الحصول عليها على مقياس 0°-360 درجة. يتوافق خط الإشارة مع مسار حركة إشارة أكميوسين واحدة مع مرور الوقت.
    6. لتجنب الازدواجية في تحليل إشارات الكنتوموسين، ضع علامة على خطوط الإشارة التي تم تحليلها داخل الخلايا في الفيلم الفرعي المتوقع زمنياً (الشكل4B,D).
    7. تحليل جميع الخلايا المحددة في الفيلم الفرعي 30 s وحفظ الزوايا التي تم الحصول عليها.
      ملاحظة: تحليل إشارات السيتوميوسين السيتوبلازمي تحت الخلية فقط في الخلايا مع الخطوط العريضة للخلايا محددة جيدا في جميع أنحاء TLM. استبعاد الخلايا الفردية التي تحتوي على أقل من 15-20 إشارة مكتشفة في TLM بأكمله. تجاهل إشارات الكنتوموسين التي تتحرك عبر الخلايا بسبب أصلها غير معروف. يظهر مثال على عدد الإشارات لخلية واحدة تم تحليلها في الفيلم الفرعي 30 s في الشكل 4D.
    8. استمر حتى يتم تحليل جميع الأفلام الفرعية 30 s-long من TLM واحد، وحفظ جميع الزوايا المقاسة من إشارات actomyosin من TLM واحد في ملف جدول بيانات.
    9. تلخيص جميع الزوايا المقاسة على العدد ذي الصلة من TLMs (تعتمد على التجربة). رسم النسبة المئوية لاتجاه إشارات actomyosin التي تم تحليلها، على سبيل المثال، كرسم تخطيطي وردي مع نطاق يتراوح بين 0 درجة إلى 360 درجة مع برنامج مفضل.
      ملاحظة: للحصول على نتائج هامة إحصائيا، ينصح خمس إلى عشر غرف البيض مستقلة من أي مرحلة غرفة البيض لتحليلها.

2. مقياس الأنسجة

ملاحظة: لتشريح وصورة في المختبر مثقف غرف البيض Drosophila، اتبع البروتوكول في ملف تكميلي 2. لتحليل TLMs المكتسبة، تابع مع البروتوكول التالي أدناه. يتم وضع ملفات الاختبار المصاحبة لـ TLMs في الملف التكميلي 3.

  1. استخراج سطح انتقائي من الأنسجة الظهارية المنحنية
    ملاحظه:يسمح هذا البروتوكول للمستخدمين باستخراج طبقة رقيقة من الكنتوموسين بشكل انتقائي في نسيج ظهاري منحني مع مرور الوقت. هذه الخطوة بروتوكول سهلة الاستخدام وتستند إلى واجهة رسومية بديهية. فمن الممكن لتحليل مريح (استخراج السطح) عدة TLMs. استخدام TestMovie2.czi (منالملف التكميلي 3) كمثال اختبار TLM.
    1. افتح تطبيق فيجي محدث (فيجي > تعليمات > تحديث > تطبيق التغييرات > موافق).
    2. تأكد من تثبيت البرنامج المساعد الإسقاط السطحي القطعي15. اتبع فيكتوريانوفا وآخرون. 16.
    3. فتح TLM وتصديره كملف XML / HDF5 عن طريق النقر على الإضافات > BigDataViewer > تصدير الصورة الحالية كملف XML / HDF5.
      ملاحظة: مطلوب لتعريف مسار تصدير. الحفظ نفسه يمكن أن يستغرق عدة دقائق ويعتمد على طول TLM.
    4. افتح الملف الذي تم تصديره في شاشة سطح القطع الناقص بالنقر فوق الإضافات > BigDataViewer > إسقاط سطح القطع الناقص > تحديد ملف XML.
      ملاحظة: ستظهر نافذة جديدة مع طرق عرض مترهلة لغرفة البيض ومربع حوار لتوجيه المستخدم خلال المعالجة. يمكن العثور على تفاصيل حول كيفية التنقل في طريقة عرض الشريحة في https://imagej.net/BigDataViewer.
    5. يحتوي إطار الحوار المسمى "إسقاط المبيضين" على عدة علامات تبويب. في علامة التبويب الحوار الأولى تسمى مربع الحدود المحيطة، حدد حدود x و y لغرفة البيض في TLM مع عرض z للمربع المحيط (أي عمق غرفة z-stack/egg) ومجموعة الضغط (الشكل5A).
    6. لتعريف الحدود، اسحب الأزرار المجاورة لـ x وy و z أو قم بتعريف إحداثيات الرقم في مربعات x و y و z. تأكد من أن الحدود سخية بما فيه الكفاية للحصول على جزء من غرفة البيض من الفائدة في استخراج السطح. يتم تمييز الأجزاء المختارة من غرفة البيض باللون الوردي.
    7. التبديل إلى علامة التبويب تسمى البحث عن النقط في نافذة المبايض الإسقاط. تعريف سيغما وقيمة الذروة الحد الأدنى؛ ثم، اضغط على حساب لتحديد إشارات actomyosin (الشكل5B)،والتي سوف تظهر كما النقط الخضراء. إعادة محاولة هذه الخطوة مع معلمات مختلفة حتى يتم العثور على بقع كافية (حوالي 100).
      ملاحظة: سيغما 1\u20123 مع الحد الأدنى من قيمة الذروة 20\u2012100 يعمل أفضل لتحديد إشارات actomyosin من المرحلة 6 إلى -8 غرف البيض. تحديد إشارات الactomyosin هو خطوة حاسمة ويعتمد على نوعية الإشارة وحجمها. من المهم تأكيد الحجم الصحيح للنقط الموجودة. لا توجد بقع خضراء مرئية/ النقط في الصورة يعني أن الخطوة التالية لن تعمل. تصفح من خلال طائرات z المحددة لرؤية النقط.
    8. لتصميم القطع الناقص، تابع علامة التبويب التي تسمى تناسب القطع الناقص. تعيين عينات عشوائية إلى 10,000، خارج / داخل مسافة قطع إلى 1\u201210، ومن ثم، انقر فوق حساب (الشكل5C).
      ملاحظة: كلما انخفضت مسافة القطع، كلما كانت القطع الناقص ة المطلوبة أكثر دقة. بعد ذلك، سيتم فتح علامة التبويب تسمى الإسقاط تلقائيًا وتسمح بتعريف استخراج السطح. يجب تحسين الإعدادات.
    9. مواصلة أكثر مع علامة التبويب تسمى الإسقاط (الشكل5D). إعداد مسافة إسقاط الحد الأدنى والحد الأقصى (أي عرض القطع الناقص المطلوب). مطلوب لتعيين مسافة الإسقاط الحد الأدنى والحد الأقصى بحيث تشمل منطقة القطع الناقص الوردي المحدد الطبقة الخارجية بأكملها من غرفة البيض. حدد مسافة الشريحة (1 مستحسن).
      ملاحظة: يتم عرض أمثلة على تناسب القطع الناقص غير صحيحة والأمثل مما يؤدي إلى معلمات الإسقاط غير صحيحة والأمثل في الشكل 6A،C. ويمكن تعريف الطبقة المحيطة رقيقة من الفائدة في وقت لاحق. تأكد من أن المنطقة الوردية من القطع الناقص مع عرض محدد على غرفة البيض مرئية قبل الضغط على حساب. من المهم أن القطع الناقص المطلوب (خط واحد وردي) يناسب بشكل جيد سطح القطع الناقص من غرفة البيض من أجل الحصول على أفضل النتائج. إذا كان تناسب القطع الناقص ليست جيدة، وترتيب إعدادات مختلفة حتى يتم الحصول على استخراج السطح المطلوب.
      1. تعيين عرض الإخراج (≥ 800) وارتفاع (≥ 400) من القطع الناقص. تعيين النقطة الزمنية التي ينبغي إنشاء استخراج السطح (أي تحديد طول استخراج TLM). اختيار إما كروية أو إسقاط أسطواني. الوجه Z ومحاذاة Y إذا لزم الأمر.
      2. اضغط على حساب للحصول على استخراج سطح لكلا القناتين في نوافذ جديدة تسمى صورة. اضبط سطوع وتباين نوافذ الصور التي تم الحصول عليها حتى تتمكن من رؤية إشارات الكنتيوسين المتوقعة، وذلك بالنقر فوق Image > ضبط > السطوع/التباين.
        ملاحظة: يظهر في الشكل 6B,Dمقارنة مثال للإسقاط الناتج عن تناسب القطع الناقص غير الصحيح والأمثل .
    10. إذا كان استخراج السطح يبدو جيداً، حفظ الصور (كلتا القناتين بشكل منفصل) كـ .tiff. بالإضافة إلى ذلك، حفظ ملف إطار السجل للرجوع إليها في المستقبل فيما يتعلق بكيفية استخراج سطح غرفة البيض هذه معينة.
      ملاحظة: هذه معلومات هامة بشكل خاص إذا كان يجب إرجاع الطبقة الرقيقة المستخرجة إلى شكلها الأصلي (للمطورين فقط).
    11. دمج القنوات مع رمز اللون المفضل في فيجي.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، المشروع المحدد z-كومة الطبقات مع إشارات actomyosin. مطلوب إسقاط طبقات z-stack المحددة عندما يتغير تركيز الاكتساب قليلاً مع مرور الوقت في TLM. للحصول على أفضل النتائج، قم بالمشروع على الأكثر من طبقة إلى طبقتين z-stack.
    12. حفظ النتائج كملفات .tiff.
      ملاحظة: يمكن العثور على أمثلة تمثيلية للطبقات الرقيقة (سطح القاعدية وapical الانتقائية) التي تمثل إشارة Myosin II (MRLC::GFP) من ظهارة الجريب للتحكم وغرف البيض المتحولة fat2 في الشكل 8.
  2. معالجة البيانات لسطح الأنسجة المستخرجة بشكل انتقائي
    1. التبييض تصحيح TLMs للتعويض عن اضمحلال كثافة من تسميات الفلورسنت.
      1. فتح فيجي. فتح TLM (على سبيل المثال، TestMovie2_extraction.tif من الملف التكميلي3) باستخدام ملف > فتح. حدد الصورة لفتحها.
      2. تقسيم قنوات الألوان وتحويلها إلى صور 16 بت، إذا لزم الأمر، عن طريق النقر فوق صورة > اللون > تقسيم القنوات. تحويل القنوات إلى صور 16 بت (من صور 32 بت) باستخدام صورة > نوع > 16 بت.
      3. إجراء تصحيح التبييض على كلتا القناتين باستخدام صورة > ضبط > تصحيح التبييض > نسبة بسيطة > كثافة الخلفية 0.0.
        ملاحظة: إذا تم الحصول على نتائج غير مرضية، فمن المطلوب لاستكشاف أي طرق التصحيح في هذا البرنامج المساعد تناسب أفضل (على سبيل المثال، استخدام مطابقة الرسم البياني بدلا من نسبة بسيطة).
      4. دمج القنوات من الصورتين المصححتين بالتبييض بالنقر فوق صورة > اللون > دمج القنوات. حفظ الصورة المدمجة كملف .tiff بالنقر فوق ملف > حفظ باسم > Tiff.
        ملاحظة: اضبط التباين والسطوع للقنوات إذا لزم الأمر.
    2. تجزئة الخلية لإنشاء قناع خلية لـ TLMs
      1. إذا لم تكن فيجي مفتوحة بالفعل، فأعد فتحها (وتأكد من تحديثها بالنقر فوق تعليمات > تحديث > تطبيق التغييرات > موافق).
      2. إذا لم يتم ذلك بالفعل، قم بتنزيل الماكرو TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. اسحب هذا البرنامج النصي وأسقطه في فيجي. افتح الملف المُصحح بالتبييض (على سبيل المثال، TestMovie2_bleach.tif من الملف التكميلي3، راجع أيضًا 2.2.1).
      4. تقسيم قنوات الملف الذي تم تصحيحه بالتبييض بالنقر فوق صورة > اللون > قنوات سبليت. ضبط قناة الغشاء لضمان الخطوط العريضة واضحة للخلية عن طريق النقر فوق صورة > ضبط > السطوع / التباين.
      5. تشغيل البرنامج النصي الذي تم تحميله على قناة غشاء الخلية النشطة من TLM المحدد عن طريق الضغط على الرمز تشغيل في البرنامج النصي المفتوح. تعيين طمس غاوسي إلى 1.500. تعيين حساسية الكشف عن الخلية إلى -1 وانقر فوق موافق. تعيين التسامح الضوضاء المقدرة إلى ~ 8 لTLMs المكتسبة مع الهدف 40x وانقر فوق موافق.
        ملاحظة: من أجل الحصول على قناع خلية لطيفة، لا تغيير هذه المعلمات أعلاه. وبالنسبة لأهداف أخرى، قد تكون هناك حاجة إلى بارامترات مختلفة. الأنظف الخلفية في TLM، مطلوب التسامح الضوضاء المقدرة أقل.
      6. يظهر قناع الخلية التي تم إنشاؤها في TLM التي تم تحليلها وأيضا في نافذة جديدة تسمى ParticleStack (G). بالإضافة إلى ذلك، يظهر إطار صغير يسمى الإجراء المطلوب. من قناع الخلية على TLM، والتركيز فقط على الخلايا في وسط TLM واختيار تلك التي يمكن أن توفر الخطوط العريضة كاملة ومحددة جيدا في جميع أنحاء TLM.
      7. إذا كانت الخلايا المحددة تحتوي على مخططات خلايا اصطناعية/إضافية، استخدم نافذة أداة الدمج التي تسمى الإجراء المطلوب في TLM. بالنسبة لهذا الأخير، اتبع الإرشادات الموجودة في النافذة.
        ملاحظة: تأكد من أن الخطوط العريضة للخلايا محددة بشكل جيد وتتوافق مع أغشية الخلايا الحقيقية في TLM لأن أي عدم دقة قد يؤثر على التحليلات اللاحقة. يمكن إجراء تعديلات وتغييرات إضافية، مثل إزالة الخلايا غير المرغوب فيها، لاحقًا باستخدام أداة مدير Surface (الموضحة في البرنامج التعليمي أدناه).
      8. عندما تتوافق الخلايا المحددة في المركز بشكل جيد مع أغشية الخلايا الحقيقية، احفظ ParticleStack كملف .tiff بعد ملف > حفظ باسم > Tiff. انتقل إلى إجراء تحميل قناع الخلية التي تم إنشاؤها وتحليل actomyosin في Surface Manager كما تم إجراؤها مسبقًا في القسمين 1-1-3 و1.2 (الموضح أيضًا بالتفصيل في القسمين 2-2-3 و2.3).
    3. تحميل قناع الخلية الذي تم إنشاؤه في إدارة Surface
      1. إذا تم تثبيت البرنامج المساعد "إدارة السطح" بالفعل في إعداد فيجي المستخدمة، انتقل إلى الخطوة 2. إذا لم يكن الأمر كذلك، اتبع Viktorinova وآخرون16. للمطورين، فقط التعليمات البرمجية المصدر هو متاح أيضا15.
      2. افتح Surface Manager بالنقر فوق الإضافات > الشرائح > مدير Surface(3D).
        ملاحظة: يعرض إطار إدارة Surface عدة أزرار إجراء على اليمين وإطار فارغ على اليسار. لمشاهدة كافة أزرار الإجراء، قد يكون مطلوباً لتمدد الإطار في ارتفاعه/عرضه. لاحظ أن الإطارات الزمنية ستظهر كشرائح z.
      3. افتح الملف ParticleStack.tif المطابق في Surface Manager عبر ملف > فتح وحدد الصورة لفتحها (على سبيل المثال، ParticleStack2.tif من الملف التكميلي 3).
      4. في Surface Manager، انقر فوق الزر قراءة صورة المخطط التفصيلي وتعيين فهرس الجاكار إلى 60%.
        ملاحظة: تحميل ملف ParticleStack.tif يمكن أن يستغرق عدة دقائق، اعتماداً على قوة الكمبيوتر.
      5. بمجرد تحميلها، سيتم تعيين كل خلية مع رقم S وسوف تظهر في الجزء الأيسر من إطار مدير Surface (الشكل7A).
        ملاحظة: لإظهار المخططات التفصيلية وأسماء الخلايا لكافة الخلايا، حدد خانات الاختيار إظهار الكل وإظهار التسميات في أسفل إطار مدير Surface. من المستحسن استخدام هذه الوظيفة بمجرد التحقق من أرقام الخلايا للتأكد من صحتها.
      6. انقر على رقم S الأول; يظهر مخطط الخلية المستوردة من ParticleStack.tif على TLM. تحقق من كل رقم S المستوردة لجودة مخطط الخلية في جميع أنحاء TLM وإزالة الخلايا غير المرغوب فيها التي تعرض مخططات الخلايا غير صحيحة. للقيام بذلك، قم بتمييز مخطط الخلية وانقر على الزر حذف.
        ملاحظة: ومن الممكن أيضا لتصحيح الخطوط العريضة للخلية غير دقيقة وإضافة الخطوط العريضة للخلية الجديدة. ويرد وصف ذلك في قسم المناقشة.
      7. حفظ كافة الخلايا التي تم تصحيحها كملف RoiSet.zip عن طريق الضغط على الزر حفظ إلى القرص.
        ملاحظة: إذا كانت جلسة العمل تحتاج إلى مقاطعة، فمن الممكن تحميل الملف RoiSet.zip في مدير Surface لاحقاً: فتح TLM في فيجي عبر ملف > فتح وحدد TLM. فتح مدير السطح على النحو التالي: الإضافات > تجزئة > مدير السطح (3D). قم بتحميل RoiSet.zip المطابق بالنقر فوق الزر تحميل من القرص واختيار الملف RoiSet.zip المناسب (على سبيل المثال، TestMovie2_RoiSet.zip). تحقق مرتين من أن أقنعة الخلايا المحملة تتوافق مع TLM المحملة.
  3. تحليل نبضات الكنتوموسين في مدير Surface
    ملاحظة: فتح فيجي والتأكد من أن TLM وقناع الخلية المقابلة لها مفتوحة في مدير Surface. تأكد من تثبيت فيجي ومحدثة ويتم تثبيت البرنامج المساعد Surface Manager (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager).
    1. افتح TLM مع ملف > افتح وحدد TLM لفتح (على سبيل المثال، TestMovie2_bleach.tif). تحميل البرنامج المساعد مدير السطح عن طريق الإضافات > تجزئة > مدير السطح (3D). تحميل قناع الخلية المحفوظة التي تم إنشاؤها في البرنامج التعليمي هنا (على سبيل المثال، ParticlesStack2.tif) عبر ملف > فتح وحدد قناع الخلية (على سبيل المثال، ParticlesStack2.tif). قم بتحميل عائد الاستثمار المقابل (على سبيل المثال، TestMovie2_RoiSet.zip).
    2. قم بالتبديل إلى قناة الاهتمام بـ TLM المحدد.
      ملاحظة: للتمييز بين القنوات، اتبع رمز اللون المشار إليه حول TLM.
    3. في Surface Manager، انقر فوق الزر إحصائيات للحصول على إطار يسمى متوسط القيمة الرمادية شريحة حسب الشريحة (الشكل7B). لاحظ أنه سيتم عرض قيم الكثافة المتوسطة/الوسيطة لإشارات الكنتيوموسين في قناة معينة تم تحليلها داخل مخططات الخلايا المحددة مع مرور الوقت، بالإضافة إلى المعلمات الأخرى المتعلقة بمنطقة الخلية وشكل الخلية.
      ملاحظة: قيم الكثافة في A.U.; منطقة الخلية بالبكسل وتحتاج إلى تحويلها إلى ميكرومترات مربعة.
    4. حفظ القيم التي تم الحصول عليها كملف جدول بيانات: انقر على نافذة الإحصائيات، ملف > حفظ باسم.
      ملاحظة: ويمكن التحقق من القيم الإحصائية التي تم الحصول عليها في وقت لاحق، على النحو التالي. فتح TLM تصحيح التبييض في فيجي. افتح مدير Surface. قم بتحميل RoiSet.zip المطابق إلى TLM عن طريق الضغط على الزر تحميل من القرص وفتح الملف. سيتم تحميل القناع المحفوظ مع الخطوط العريضة للخلية وستظهر أسماء الخلايا في إطار مدير Surface الأيسر. انقر فوق الزر إحصائيات للقيم الإحصائية.
      ملاحظة: وفيما يتعلق بتحليل يدوي لإشارات الأتوميوسين دونالخلوية الفردية ، لا يمكن إجراء تحليل يدوي لإشارات الأتوميوسين تحت الخلية على مقياس الأنسجة. التحسين مطلوب لتحليل إشارات الأتيوميوسين الفردية على مقياس شبه الأنسجة، كما هو موضح في قسم المناقشة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكّن هذا البروتوكول العلماء من التحقيق في سلوك شبكات الكتميوسين في الأنسجة الظهارية. هذا ممكن فقط عندما يتم الجمع بين تحليل مفصل لسلوك الأتوموسين على النطاق الخلوي المحلي (عدد قليل من الخلايا) مع تحليل مماثل على مقياس الأنسجة (العديد من الخلايا). ومع ذلك، غالبا ما تكون الأنسجة الظهارية منحنية واستخراج طبقة رقيقة من هذه الأنسجة لميكن من الممكن في السابق بسهولة، كما هو مبين في غرف البيض Drosophila (الشكل 1). البروتوكول المعروض هنا يوفر للمستخدمين تعلي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتشريح وزراعة غرف البيض

إذا تم وضع الكثير من الذباب في قارورة صغيرة، يمكن أن يتحول الطعام يطير الموحلة بعد 2-3 أيام بسبب كميات كبيرة من اليرقات تغذية والذباب الكبار الحصول على المحاصرين في الغذاء يطير. في مثل هذه الحالة، الوجه بقية هذه الذباب في قارورة جديدة مع المواد الغذائية الطازجة وتقليص عددها. على وجه الخصوص، استبعاد الإناث التي كانت عالقة في الغذاء.

يجب إعداد مزيج شنايدر (SM) مسبقًا ويمكن تخزينه عند درج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصحاب البلاغ ممتنون جدا لميريام أوسترفيلد لتقاسم مشورتها على التصوير الحياة في المختبر من غرف البيض باستخدام نهج اعتمد من مختبر سيليست بيرغ4. كما نشكر سيباستيان تسي على الخط الفيجي الذي يمكّن من تجزئة الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شنايدر ميدانجيبكو21720-024[+] -الجلوتامين
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140-122  ؛ [ +] 10.000 وحدة / مل البنسلين [+] 10.000 & ميكرو ؛ جم / مل من الستربتومايسين
مصل الأبقار الجنينيسيجما  ؛ F135
الأنسولين المعطل بالحرارة سيجما البشرية& nbsp ؛ I9278
50 مل أنابيب الصقرEppendorfمعقمة
مرشح Millex-GVMilliporeSLGV033NS33 مم
أطباق Microwell ذات القاع الزجاجيMatTek CorporationP35G-1.5-14-C35 مم طبق بتري ، 14 مم Microwell ، رقم 1.5 غطاء زجاجي
ملقطA. Dumont & Fils  # 55
CellMask أحمر غامق (صبغة غشاء الخلية)InvitrogenC10046
FM4-64 (صبغة غشاء الخلية) ThermoFisher/ InvitrogenT13320
شريحة تشريح الاكتئابفيشر Scientific12-560B
< قوية > معدات مجهرية < / قوية >
مجهريةعلى سبيل المثال ZeissStemi SV 6
مجهر متحد البؤر المقلوبZeiss / Olympus
Spinning، على سبيل المثال Zeiss / Andor
زجاج مجهري / غطاءزجاج ، على سبيل المثال Thermo Scientific / Menzel Glas
< قوي > أداة الصبار < / قوي >
حاملإبرة WironitHammacher9160020
Cactus spineEchinocactus grusonii / برميل الصبار
ذبابة الفاكهة< em> الأسهم المستخدمة في المخطوطة< / strong>
AX3< / sup> / AX3< / sup>; sqh-MRLC :: GFP / sqh-MRLC :: GFP < / em>لمزيد من التفاصيل ، انظر Rauzi et al.: تتحكم التدفقات الانقباضية المستوية المستقطبة في إعادة تشكيل التقاطع الظهاري. طبيعة سجية 2010 ، المجلد 468 ، ص. 1110-1115.
AX3< / sup> / AX3< / sup>; sqh-MRLC :: GFP / sqh-MRLC :: GFP ؛ fat258D< / sup> / fat2103C< / sup>< / em>للحصول على التفاصيل انظر Viktorinova et al.: يسبق الدوران الظهاري كسر التماثل المستوي للأكتوميوسين ويحمي الأنسجة الظهارية من تشوهات الخلايا. PLoS Genetics 2017 ، المجلد 13 ، العدد 11 ، ص. e1007107.
محلول مثل مجهر قرص

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).
  2. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
  3. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
  4. Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
  5. Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
  6. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
  7. Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
  8. Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044(2013).
  9. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
  10. Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
  11. Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511(2014).
  12. Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107(2017).
  13. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
  14. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
  15. Haase, R. Surface manager. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018).
  16. Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018).
  17. Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017).
  18. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  19. Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
  20. Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
  21. Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Actomyosin DynamicsDrosophila Egg ChambersTime lapse MoviesFiji based PluginSurface ManagerEllipsoid Surface ProjectionCell Mask AnalysisTissue Scale AnalysisLocal Cellular ScaleEpithelial Tissue

مقالات ذات صلة