يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فلوريميتريك تقنيات لتقييم أغشية الحيوانات المنوية

13.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58622

⸱

نوفمبر 28, 2018

 , 
1Animal Sperm Research Center, Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Animal Sciences, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، منهجيات لتقييم سلامة غشاء سبيرماتوزوان، ميزة خلوية المرتبطة باختصاص إخصاب الحيوانات المنوية. يصف لنا ثلاث تقنيات لتقييم فلوريميتريك أغشية الحيوانات المنوية: تلطيخ متزامنة مع تحقيقات الفلورسنت محددة والأسفار الفحص المجهري الخلوي تدفق متقدمة مخصصة للحيوانات المنوية. وترد أيضا أمثلة للجمع بين المنهجيات.

الملخص

سبيرميوجرامس القياسية التي تصف نوعية الحيوانات المنوية معظمها يستند المعلمات الفسيولوجية والمرئية، مثل حجم السائل المنوي وتركيز وحركية والحركة التقدمية، ومورفولوجية الحيوانات المنوية والجدوى. غير أن أيا من هذه التقييمات جيدة بما يكفي للتنبؤ بنوعية السائل المنوي. نظراً لأن الحفاظ على سلامة الحيوانات المنوية والإخصاب المحتملة يتوقف على سلامة الغشاء ووظائف داخل الخلايا، قد تمكن التقييم لهذه المعلمات تنبؤ أفضل من اختصاص إخصاب الحيوانات المنوية. وهنا يصف لنا ثلاثة أساليب مجدية لتقييم جودة الحيوانات المنوية باستخدام المسابر الفلورسنت الخاصة جنبا إلى جنب مع الأسفار مجهرية أو التدفق الخلوي التحليلات. تحليلات لتقييم سلامة غشاء البلازما باستخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) ويوديد propidium (PI)، سلامة الغشاء أكروسومال باستخدام fluorescein isothiocyanate مترافق بسام بيسوم agglutinin (فيتك-PSA) و سلامة غشاء الميتوكوندريا استخدام 5, 5 ', 6, 6'-تترا-الكلورو-1، 1 '، 3، 3'-تيترايثيلبينزيميدازوليل كاربوسيانيني يوديد (JC-1). وترد أيضا مزيج من هذه الأساليب. على سبيل المثال، استخدام أننيكسين V جنبا إلى جنب مع بي فلوروتشروميس يتيح تقييم المبرمج وحساب نسبة apoptotic الحيوانات المنوية (apoptotic الفهرس). ونحن نعتقد أن هذه المنهجيات، التي تستند إلى دراسة الأغشية المني، مفيدة جداً لتقييم مدى جودة الحيوانات المنوية.

المقدمة

سلامة ووظيفة الحيوانات المنوية الأغشية عدد قليل من العوامل التي تشير إلى بقاء الحيوانات المنوية والإخصاب المحتملة. غشاء البلازما يعمل كحاجز بين الأقسام داخل الخلية وخارج الخلية، وبالتالي الحفاظ على توازن ناضح الخلوية1. أي الإجهاد الذي يؤدي إلى الأضرار بسلامة غشاء البلازما قد يضعف التوازن والحد من القدرة على البقاء والتسميد وزيادة موت الخلية. على سبيل المثال، يقلل نعد بقاء الحيوانات المنوية نظراً الأضرار التي لحقت بغشاء البلازما، ونتيجة للتغيرات في درجات الحرارة والضغط التناضحي2. ذكرت سابقا أن تعريض الحيوانات المنوية الثور بتركيزات منخفضة من الملوثات المنقولة مثل والاترازين مبيدات الآفات، وبه ديامينوتشلوروتريازيني المستقلب الرئيسي أو ميكوتوكسين الأفلاتوكسين B1، يقلل من الحيوانات المنوية البقاء1،3 . وكان تحديد هذا بواسطة وسم الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل مع DAPI في تركيبة مع بي، التي تلزم للحمض النووي للخلايا بغشاء البلازما تالفة.

أكروسومي رد فعل (ع) ينطوي على الانصهار الغشاء الخارجي أكروسومي وغشاء البلازما السطحية أسفر عن الإفراج عن الإنزيمات أكروسومال4،5. هذه هي الأحداث الأساسية لاختراق zona pellucida ودمج مزيد من الحيوانات المنوية مع البويضات6. ولذلك، يشكل تقييم سلامة غشاء أكروسومال معلمة مفيدة لتقييم نوعية السائل المنوي وخصوبة الذكور7،،من89. عدة تقنيات الفلورسنت مناسبة للتحقق من سلامة acrosome، فيتك-السلطة الوطنية الفلسطينية أو بسا فيتك8،10. في دراساتنا السابقة، باستخدام أنماط بسا فيتك المصبوغة1،3، تقدم تعاريف دقيقة ل (ط) acrosome سليمة، (ثانيا) تلف غشاء acrosome و (ثالثا) كان رد فعل أكروسومي. في التقرير الحالي، وعلينا تقييم الوضع acrosome استخدام مخصصة للحيوانات المنوية التدفق الخلوي ومقارنة النتائج لتلك باستخدام مجهر الأسفار.

الميتوكوندريا هي العضيات متعدد الوظائف المعنية في، في جملة أمور، ATP التوليف، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية، وإشارات الكالسيوم والمبرمج. الاختلالات الوظيفية الفيزيولوجية، بما في ذلك العقم الذكور والإناث، ترتبط بتغيير الوظيفة المتقدرية11. يتم ترتيب في ميدبيسي الميتوكوندريا الحيوانات المنوية وتلعب دوراً حاسما في حركية الحيوانات المنوية12. من المقبول أيضا أن غشاء الميتوكوندريا العالية المحتملة (ΔΨm) يرتبط بحركية طبيعية والتسميد عالية القدرة13. وفي المقابل، ΔΨm منخفضة يرتبط بمستوى مرتفع من الأنواع الأكسجين التفاعلية وانخفاض معدل الإخصاب14. على الرغم من ذلك، يمكن أن تحفز الإجهاد الخلوية المركبات البيئية المختلفة، على سبيل المثال اختلال الغدد الصماء، ويؤدي إلى زيادة مؤقتة في ΔΨm، فرط الاستقطاب1،3، وزيادة إنتاج الجذور الحرة، وفي نهاية المطاف، [ابوبتوسس]15. التحقيق الفلورسنت 6، 5، 5 '، 6'-تترا-الكلورو-1، 1 '، 3، 3'-تيترايثيلبينزيميدازوليل كاربوسيانيني يوديد (JC-1) تمكن على سبيل المثال، بدراسة آثار السموم المنقولة على الحيوانات المنوية ΔΨm1،3.

سبيرميوجرامس القياسية، استناداً إلى المعلمات الفسيولوجية والمورفولوجية، ليست جيدة بما يكفي للتنبؤ بنوعية السائل المنوي. أساليب أكثر دقة مطلوبة لضمان جودة الحيوانات المنوية. هنا، نحن نقدم اثنين من الأساليب الممكنة لتحديد نوعية الحيوانات المنوية على أساس تقييمات أغشية الحيوانات المنوية: تلطيخ رباعية متزامنة مع تحقيقات الفلورسنت محددة والفحص المجهري الأسفار، ووصف لنا الدراسات1،3 ومؤخرا استخدمت الخلوي تدفق متقدمة مخصصة للحيوانات المنوية، في المختبر، وسبق استخدامها من قبل الآخرين16،،من1718.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الإسرائيلية عام 1994 للرفق بالحيوان. تم توفير الحيوانات المنوية البقري من شركة إسرائيلية تجارية للتلقيح الاصطناعي، وتربية. وقيمت الدفقات من شيكاغو بولز 11 في هذه الدراسة.

1-الحيوانات المنوية عينة إعداد

ملاحظة: ويستند الإجراء في المختبر روث البروتوكول1،3.

  1. الحصول على حوالي 1 – 6 مل من السائل المنوي الثور في أنبوب 15 مل في درجة حرارة الغرفة.
  2. لكل 1 مل من السائل المنوي، إضافة 6 مل من المخزن المؤقت نكم بريوارميد (عند 37 درجة مئوية) (110 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، والمماسح 20 مم [حمض 3-N-مورفيلينو بروبانيسولفونيك؛ ودرجة الحموضة 7.4]) والطرد المركزي لدقيقة 8 في 600 x غ، 1-2 مرات حتى المادة طافية واضحة.
    ملاحظة: إذا كان تركيز الحيوانات المنوية أو وحدة التخزين الأولية مرتفعة جداً، تنقسم إلى أنابيب اثنين في غسل الأولى.
  3. على الفور إزالة وتجاهل المادة طافية واضحة وترك حوالي 1 سم من المادة طافية فوق بيليه.
  4. العجاف بعناية هذه الأنابيب بزاوية 30 درجة زيادة المساحة السطحية للحيوانات المنوية السباحة حتى والانتظار 20 – 30 دقيقة للسماح للمني للسباحة حتى عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: ويمكن رؤية التعكر.
  5. استخدام ميكروبيبيتي عناية، إزالة العلوي 1 مل من المادة طافية الذي يحتوي على المني متحركة لأنبوب 1.5 مل جديدة.
  6. تبقى الحيوانات المنوية عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  7. ويقدر عدد الحيوانات المنوية استخدام هيموسيتوميتير نويباور.
    ملاحظة: دائرة عد مختلفة يمكن استخدامها بدلاً من ذلك، ولكن عملية عد الأصوات المختلفة.
    1. لمنع حركة المني، تمييع 100 ميليلتر من المني متحركة مع 10 مل ماء المقطر مزدوجة (دو) (تخفيف 1: 100) في أنبوب 15 مل وتخلط برفق.
    2. تحميل 10 ميليلتر من العينة في كل جانب من هيموسيتوميتير وساترة. تأكد من تجنب تشكيل فقاعة داخل الدائرة كما قد يؤدي هذا عدد الحيوانات المنوية غير دقيقة.
    3. مراقبة تحت مجهر المركب مع هدف X 20.
      ملاحظة: الشبكة كاملة في هيموسيتوميتير تحتوي على 9 مربعات كبيرة، كل 1 مم2، وتقع كوفيرجلاس 0.1 ملم فوق أرض الدائرة. وهكذا، وحدة التخزين عبر المنطقة الوسطى في عد الأصوات هو 0.1 ملم3 أو 0.1 ميليلتر. المنطقة الوسطى من هيموسيتوميتير تحتوي على مربعات متوسطة 25 وكل مربع متوسط المربعات الصغيرة 16 مع أسطر مفردة.
    4. حساب إجمالي عدد الخلايا الموجودة في المربعات الزاوية متوسطة 4 والساحة المركزية. لدقة أعلى، عد دائرتين (كلا الجانبين من هيموسيتوميتير نويباور) واستخدام المتوسط لحساب تركيز الخلية.
    5. حساب عدد الحيوانات المنوية بضرب عدد يعني الحصول على 5 (للحصول على عدد الخلايا في منطقة العد) و 10,000 (للحصول على العدد الخلايا كل 1 مل عينة المخففة). ثم اضرب عدد مرات الحصول على عامل إضعاف (1: 100).
      ملاحظة: على سبيل المثال، متوسط عدد الحيوانات المنوية عدها في 5 مربعات متوسطة 25 داخل منطقة الفرز المركزية من دائرتين هو 150 ([152 + 148]/2). وهكذا، هو متوسط عدد الحيوانات المنوية كل دائرة (أو لكل ميليلتر 0.1) 150 × 5 = 750. اضرب 750 من 10,000 الحصول على العدد الخلايا كل 1 مل عينة المخففة (7,500,000) وثم ضرب 100 (عامل إضعاف) للحصول على خلايا 75 × 107 الواحد مل عينة السائل المنوي أصلية.

2-أسلوب #1: تقييم المتزامن لأغشية الحيوانات المنوية الفلورسنت متعددة باستخدام يسبر

ملاحظة: قيمت أغشية الحيوانات المنوية (البلازما، أكروسومال و mitochondrial) كما تم وصفه سابقا سيليغيني et al.10، مع إدخال بعض التعديلات عليها. واستخدمت ابيفلوريسسينت المجهري، جنبا إلى جنب مع كاميرا رقمية مع الإثارة في 450-490 نانومتر والانبعاثات في 515-565 نانومتر باستخدام عامل تصفية ثلاثي.

  1. إعداد حلول الأسهم.
    1. إعداد 0.1 مغ/مل الحل الأسهم DAPI بتذويب 5 ملغ DAPI في 50 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS). إعداد 50 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، تمييع الحل الأسهم مع برنامج تلفزيوني في 01:10 (حل عملي؛ 10 ميكروغرام/مل).
    2. تحضير 1 ملغ/مل الحل الأسهم فيتك – PSA بتذويب 1 مغ من فيتك – PSA في 1 مل من برنامج تلفزيوني. إعداد 50 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، تمييع الحل الأسهم مع برنامج تلفزيوني في 01:10 (حل عملي؛ 100 ميكروغرام/مل).
    3. تحضير حل الأسهم 1 ملغ/مل JC-1 بإذابة 1 مغ من JC-1 في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]). إعداد 10 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، تمييع الحل الأسهم مع [دمس] في 01:10 (حل عملي؛ 0.1 مغ/مل).
    4. إعداد الحل بي الأسهم بتذويب 10 مغ PI في 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (إعطاء 2.5 ملغ/مل). مخزن في + 4 درجة مئوية. تمييع الأسهم 1 مع برنامج تلفزيوني في 01:20 (حل عملي؛ 0.125 مغ/مل). تخزين في + 4 درجة مئوية كحل أسهم.
      تنبيه: PI مطفر محتملة وينبغي التعامل معها بحذر. يجب التخلص من الصبغة بأمان، ووفقا للوائح المحلية المطبقة.
  2. نقل ميليلتر 133 من المني متحركة (الخطوة 1.5) إلى أنبوب 1.5 مل جديدة (25 × 106 الحيوانات المنوية/mL).
    ملاحظة: إذا كان تركيز العينة أعلى، تمييع في المخزن المؤقت نكم لتحقيق تركيز المطلوبة؛ إذا كان تركيز العينة من السباحة حتى العينة أقل، الطرد المركزي المادة طافية التي تم الحصول عليها بعد السباحة حتى في س 1,000 ز لمدة 5 دقائق وإزالة 0.5 مل من المادة طافية وعدد الحيوانات المنوية مرة أخرى.
  3. إضافة 17 ميليلتر من DAPI (حل عملي) واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  4. الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
  5. لبيليه، إضافة 100 ميليلتر نكم المخزن المؤقت.
  6. إضافة 50 ميليلتر من فيتك – PSA، 2 ميليلتر من JC-1 و 3 ميليلتر من PI (تعمل الحلول) واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  7. الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
  8. بيليه، إضافة 40 ميليلتر من المخزن المؤقت نكم وريسوسبيند بيبيتينج.
  9. نقل 10 ميليلتر من العينة الشريحة الزجاجية وتشويه وساترة.
  10. تصور فورا بالفحص المجهري ابيفلوريسسينسي (استخدام 40 x هدف) مع عامل تصفية ثلاثي، مجهزة بكاميرا رقمية، والتقاط صورة لكل مرشح على حدة.
    ملاحظة: لا يوجد أي أهمية ترتيب مرشحات تصور.
    1. تصور تحت قناة DAPI مع الإثارة في 358 نيوتن متر والانبعاثات في 461 شمال البحر الأبيض المتوسط.
    2. تصور تحت قناة فيتك مونومرات الأخضر مع الإثارة في 450-490 نانومتر والانبعاثات في 515 – 565 نانومتر.
    3. تصور تحت قناة بي للمجاميع حمراء مع الإثارة في 488 نانومتر والانبعاثات في 590 نانومتر.
    4. تصور تحت جيمي كارتر-1 المجاميع حمراء مع الإثارة في 559 شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات في نطاق 574 – 627 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ جيمي كارتر-1 مونومرات الأخضر مع الإثارة في 488 نانومتر والانبعاثات في المجموعة من 500 – 535 نانومتر.
  11. دمج الصور الثلاث الواردة من عوامل التصفية في تنسيق JPG/JPEG، باستخدام الخيار "دمج" لبرنامج الكاميرا.
  12. فتح الصورة المدمجة مع أداة "الرسام" واستخدم خيار الفرشاة لوضع علامة المني الأصوات التي تم فرزها.
  13. تصنيف المني استناداً إلى الأسفار التي تنبعث من كل التحقيق:
    1. تقييم المني 200 على الأقل من كل شريحة بشكل عام – كافة الخلايا تظهر الأزرق (DAPI).
    2. تقييم الجدوى طريق عد الخلايا الميتة، التي تظهر الأرجواني (PI [الأحمر] + [الأزرق] DAPI) وحساب النسبة المئوية للخلايا الميتة (مجموع الخلايا الميت عد الخلايا x 100).
    3. تقييم حالة acrosome باستخدام الأنماط لتلطيخ الفلورسنت (فيتك – PSA). حساب النسب المئوية لأنماط مختلفة (acrosome سليمة أو التالفة أو رد فعل إلى مجموع الخلايا عد الخلايا x 100).
      ملاحظة: غشاء أكروسومال التالفة يظهر كغطاء acrosome تماما الملون، أخضر؛ يظهر رد فعل غشاء أكروسومال المتبقية الخضراء الاستوائية أو العلوي تلطيخ؛ الخلايا التي تحتوي على غشاء أكروسومال سليمة سوف لا يحمل أي صبغة خضراء من منطقة أكروسومال.
    4. تقييم ΔΨm بالتمييز بين المني مع ΔΨm عالية، مما يحمل ميدبيسي ملطخة بالأحمر، والمنى مع انخفاض ΔΨm الذي يحمل ميدبيسي الملون الأخضر. عد الأحمر والأخضر ميدبيسيس كل على حدة وحساب النسبة (أحمر/أخضر).

3-أسلوب #2: تقييم أغشية الحيوانات المنوية مع مجموعات جاهزة للاستخدام والتدفق الخلوي

ملاحظة: وأجرى تقييم سلامة غشاء البلازما، سلامة غشاء أكروسومال والمحتملة غشاء الميتوكوندريا مع مجموعات قياس التدفق جاهزة للاستخدام تحتوي على فلوروتشروميس المجففة بالتبريد في كل بئر. وكان تنفيذ الإجراء حسب الشركات المصنعة مع إدخال بعض التعديلات عليها.

  1. تقييم نزاهة غشاء البلازما
    1. أن العدد المطلوب من الآبار من مجموعة أدوات البقاء وتركيز (PI و SYbr14)، ونقلها إلى قاعدة العمل وتغطية بغطاء مرن (حماية من الضوء).
    2. إضافة ميليلتر 199 الحل مخزنة للخلوي كل بئر.
    3. أضف 1 ميليلتر من السائل المنوي متجانسة في 57 × 106/mL (الخلايا 57,000 كل بئر) وتجانسه قبل بيبيتينج.
    4. وتغطي اللوحة بغطاء أسود.
    5. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية محمية من الضوء.
    6. تشغيل العينة من خلال سيتوميتير التدفق مع الإعداد 'استمرارية'.
  2. غشاء الميتوكوندريا المحتملة
    1. أخذ العدد المطلوب من الآبار من الحزمة من نشاط المتقدرية مجموعة (JC-1)، وتحويلها إلى قاعدة العمل وتغطية بغطاء مرن (حماية من الضوء).
    2. إضافة 10 ميليلتر من الإيثانول المطلقة كل بئر و "الماصة؛" ريسوسبيند هذا المسحوق داخل البئر.
    3. إضافة ميليلتر 190 من برنامج تلفزيوني كل بئر وتجانسه قبل بيبيتينج.
    4. إضافة ميليلتر 0.75 من السائل المنوي متجانسة في 57 × 106/mL (الخلايا 50,000 كل بئر) وتجانسه قبل بيبيتينج.
    5. وتغطي اللوحة بغطاء أسود.
    6. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية محمية من الضوء.
    7. تشغيل العينة من خلال سيتوميتير التدفق بالنشاط ʽmitochondrial الإعداد '.
  3. سلامة غشاء أكروسومال
    ملاحظة: تلطيخ فيتك – هيكل السلام والأمن (انظر أسلوب #1) يتيح تقييم 3 فئات أكروسومي (acrosome سليمة ورد acrosome acrosome التالفة). استخدام تدفق سيتوميتير والسلامة & acrosome سلامة kit (PI وفيتك – السلطة الوطنية الفلسطينية)، مفصولة المني في هذه الفئات 3.
    1. أخذ العدد المطلوب من الآبار من مجموعة طقم النزاهة صلاحية & أكروسومي، ونقلهم إلى قاعدة العمل وتغطية بغطاء مرن (حماية من الضوء).
    2. إضافة 200 ميليلتر من حل مخزنة للخلوي كل بئر.
    3. إضافة ميليلتر 0.7 من السائل المنوي متجانسة في 57 × 106/mL (الخلايا 40,000 كل بئر) وتجانسه قبل بيبيتينج.
    4. وتغطي اللوحة بغطاء أسود.
    5. احتضان لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية محمية من الضوء.
    6. تشغيل العينة من خلال سيتوميتير التدفق مع ʽInCyte الإعداد '.
    7. تحليل الرسم البياني الناتجة من النابضة ثلاثة مجالات علامة وفقا لكثافة الأسفار، تمثل الخلايا ضئيلة، الاستشعاع منخفضة مع سليمة، أونستاينيد أكروسومي (R1)، منخفضة الاستشعاع الخلايا مع بقايا الملون جزء من أكروسومي (R2) و الغاية الاستشعاع الخلايا مع تعطل acrosome (R3).
      ملاحظة: استخدام المقطع "تحليل الملفات التي تم الحصول عليها باستخدام الوحدات النمطية الأخرى" في دليل مستخدم أداة من أجل إنشاء المناطق الثلاث (R1, R2, R3).

4-الأسلوب #3: تقييم أغشية الحيوانات المنوية باستخدام المسابر الفلورسنت والتدفق الخلوي

ملاحظة: استخدام أنيكسين V جنبا إلى جنب مع بي فلوروتشروميس يتيح تقييم المبرمج وحساب نسبة apoptotic الحيوانات المنوية (apoptotic الفهرس).

  1. إعداد 1 × أنيكسين المخزن المؤقت ملزم الخامس من 20 x حل الأسهم (ميليلتر 500 مخفف من أنيكسين V ربط المخزن المؤقت 20 x حل الأسهم مع 9.5 مل ماء المقطر المعقم).
  2. ويقدر عدد الحيوانات المنوية استخدام هيموسيتوميتير نويباور وصفها في الفرع 1-7.
  3. غسل المني6 10 في 1 مل 1 × أنيكسين V ربط المخزن المؤقت والطرد المركزي في 300 x غ لمدة 10 دقائق.
  4. نضح المادة طافية تماما.
  5. ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر 1 × أنيكسين V ربط المخزن المؤقت.
  6. إضافة 10 ميليلتر annexin الخامس يضاف إلى فيتك.
  7. يخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  8. غسل المني بإضافة 1 مل 1 x أننيكسين V ملزمة المخزن المؤقت لكل 10 من6 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق.
  9. نضح المادة طافية تماما.
  10. ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من annexin x 1 V ملزمة العازلة الواحدة 106 مجموع الخلايا.
  11. أضف 1 ميكروغرام/مل بي قبل التحليل مع سيتوميتير تدفق مباشرة.
  12. تشغيل العينة من خلال سيتوميتير التدفق على ʽInCyte '.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام الشكل 1 يبين فلوريميتريك المتزامنة التقييم أغشية الحيوانات المنوية (البلازما، أكروسومال و mitochondrial) PI، DAPI، فيتك-PSA وجيمي كارتر-1. تقييم الأغشية الحيوانات المنوية استخدام تلطيخ متزامنة مع أربعة تحقيقات الفلورسنت يسمح، على سبيل المثال، تقييم نسبة الحيوانات المنوية في كل فئة من فئات – يعيش مقابل الميت؛ ارتفاع مقابل انخفاض ΔΨm؛ سليمة مقابل. أضرار acrosome – في وقت واحد لكل المني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الحيوانات المنوية إخصاب محتمل يعتمد على عوامل متعددة تعكس نوعيته. تركيزات عالية من المني ونسبة عالية من المني متحركة عالية تدريجيا قد يعتبر السائل المنوي عالية الجودة. ومع ذلك، مثل هذا تقييم لا تأخذ في الاعتبار المعلمات الخلوية والفنية الأخرى. استخدام سيتوميتير ميكروكابيلاري 'مقاعد البدلاء-أعلى' تدفق يمكن تكييفها بسهولة لتقييم مختلف هياكل الحيوانات المنوية باستخدام المسابر الفلورسنت، كما هو موضح سابقا قبل الآخرين17 وأظهرت هذه الوثيقة (الأسلوب #3). على سبيل المثال، سلامة acrosome الحيوانات المنوية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أن هناك لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

الكتاب يود أن يشكر "سيون" شركة إسرائيلية للتلقيح الاصطناعي، وتربية (حاييم هافيتز، إسرائيل) لمساعدتهم والتعاون، والسيدة لي نا (التكنولوجيات IMV، L'Aigle، فرنسا) للحصول على المساعدة مع أداة الإعداد والتدريب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كلوريد الصوديومسيجماS5886
KClسيجماP5405
MOPS [3-N-morphilino البروبانسولفونيك حمض]سيجماM1254
PBSسيجماP5493
DMSOسيجماD2438
الإيثانول المطلقسيجما64-17-5
مقياسالدممقياس الدم Neubauer Germany
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)مسبار الفلورسنتSigmaD9542
PI (يوديد البروبيديوم) مسبارالفلورسنتSigmaP4170
FITC-PSA (الفلوريسين إيزوثيوسيانات مترافق Pisum sativum agglutinin) مسبار
الفلورسنت Sigma L0770JC-1 (5،5 '، 6،6 '-tetra-chloro-1،1 '، 3،3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodied)ENZOBiochem ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكيةمسبار الفلورسنتENZ52304
الملحق V مقترن ب FITCMACS ، Miltenyi Biotec130-093-060مسبار الفلورسنت
Annexin V المخزن المؤقت الملزم 20x حل المخزونMACS ، Miltenyi Biotec130-092-820المخزن المؤقت
Nikon Eclipse ، TE-2000-uنيكون ، طوكيو ، اليابانمجهر مضان مقلوب
Nis Elementsنيكون ، طوكيو ، اليابانالبرمجيات
نيكون DXM1200Fنيكون ، طوكيو ، اليابانالكاميرا الرقمية
الجوافة EasyCyte PlusIMV Technologies ، L'Aigle ، فرنساتدفق المنوية الشعرية
الدقيقة CytoSoftشركة Guava Technologies Inc. ، هايوارد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ وزعت بواسطة برنامج IMV Technologies
حل مخزن مؤقت لقياس الخلاياIMV Technologies ، L'Aigle ، فرنسا023862مجموعة
أدوات الجدوى والتركيزIMV Technologies ، L'Aigle ، فرنسامجموعة 024708لتقييم الجدوى
طقم نشاط الميتوكوندرياIMV Technologies ، L'Aigle ، فرنسا024864مجموعة لنشاط الميتوكوندريا مجموعة أدوات
التقييم للبقاء وسلامة الأكروسومIMV Technologies ، L'Aigle ، فرنسا025293مجموعة لتقييم سلامة الأكروسوم
JMP-13SAS Institute Inc. ، 2004 ، ary، NC ، الولايات المتحدة الأمريكيةبرنامج
المنوية البقرية"SION" ، شركة إسرائيلية للتلقيح الاصطناعي والجرف ، Hafetz-Haim ، إسرائيل
مقياس

المراجع

  1. Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
  2. Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
  3. Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
  4. Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
  5. Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
  6. Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
  7. Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
  8. Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
  9. Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
  10. Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
  11. Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
  12. Eddy, E. M., O’Brien, A. The spermatozoon. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).
  13. Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
  14. Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
  15. Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
  16. Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
  17. Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
  18. Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

سلامة غشاء الحيوانات المنويةالمسابر الفلوريةقياس التدفق الخلويالمجهر الفلوريالغشاء البلازميالغشاء الأكروسوميالغشاء الميتوكوندريتلوين DAPIتلوين PIFITC-PSA
فلوريميتريك تقنيات لتقييم أغشية الحيوانات المنوية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.