مقالة منهجية

قياس استقلاب الطاقة في اكسبلانتيد نسيج الشبكية باستخدام تحليل الجريان خارج الخلية

DOI:

10.3791/58626

⸱

يناير 7, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Metabolism, Endocrinology and Lipid Research, Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in Saint Louis, 3Department of Ophthalmology and Visual Science, Washington University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا الأسلوب تسجيل الوقت الحقيقي لاستهلاك الأوكسجين ومعدلات تحمض خارج الخلية في أنسجة الشبكية الماوس اكسبلانتيد محلل تدفق خارج الخلية باستخدام.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رؤية عالية الحدة عملية استهلاك الطاقة بشكل كبير، والشبكية وقد وضعت عدة تعديلات فريدة من نوعها لتلبية هذه الطلبات مع المحافظة على الشفافية للمحور البصري تحديداً. اضطرابات بهذا التوازن الدقيق يسبب الأمراض المسببة للعمى، مثل اعتلال الشبكية السكري. ولذلك لا بد من تطوير العلاج العقلاني للأسباب المختلفة لفقدان الرؤية فهم تغيرات استقلاب الطاقة في الشبكية أثناء المرض. ظهور المحلﻻت التمويه المتاحة تجارياً خارج الخلية الأخيرة جعلت دراسة الأيض الطاقة الشبكية أكثر يسرا. ويصف هذا البروتوكول استعمال هذه محلل قياس المساهمات لإمدادات الطاقة الشبكية من خلال أسلحتها مبدأ اثنين-الفسفرة وتحلل-بالتحديد الكمي للتغيرات في معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR) وخارج الخلية معدلات التحمض (عكر) كوكلاء لهذه المسارات. يتم تنفيذ هذا الأسلوب سهولة في نسيج الشبكية اكسبلانتيد، تيسير تقييم الاستجابات لعدة عوامل دوائية في تجربة واحدة. تتم مقارنة التوقيعات الأيضي في شبكية العين من الحيوانات التي تفتقر إلى ورود إشارات مستقبله إلى البرية من نوع عناصر التحكم باستخدام هذا الأسلوب. قيداً رئيسيا في هذه التقنية هو عدم القدرة على التمييز بين استخدام الطاقة داركادابتيد وتتكيف مع الضوء، الاعتبارات الفسيولوجية هامة في نسيج الشبكية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شبكية العين بين أنسجة معظم الطاقة تطالب في الجهاز العصبي المركزي1. مثل معظم الأنسجة، فإنه ينشئ الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق تحلل في سيتوسول أو عن طريق الفسفرة في الميتوكوندريا. ميزة حيوية من الفسفرة على تحلل لإنتاج ATP من جزيء واحد من السكر واضح: 36 جزيئات ATP الناتجة السابق مقابل 2 جزيئات ATP التي تم إنشاؤها من هذا الأخير. وبناء على ذلك، الخلايا العصبية الشبكية تعتمد أساسا على التنفس المتقدرية للإمداد بالطاقة وهذا ينعكس على كثافة عالية من الميتوكوندريا2. حتى الآن، الشبكية أيضا تعتمد اعتماداً كبيرا على الآلات جليكوليتيك حتى في حالة وفرة الأوكسجين. ووصفت هذه العملية تحلل الهوائية أصلا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تابعت رابطة البحوث في الرؤية وبيان العيون "استخدام الحيوانات" البروتوكولات وأقرتها جامعة واشنطن.

1-إعداد الحيوان

  1. الحفاظ على الحيوانات في الإسكان القياسية مع 12 ساعة الظلام إلى دائرة الضوء 12 ساعة. بدء تجارب في توحيد مرات لتجنب التأثيرات الإيقاعية، عادة في الصباح بعد أن يتم تشغيل أضواء.

2. إعداد الحل

  1. إعداد قاعدة الوسائط بتذويب 8.4 ملغم من مسحوق وسائل الإعلام في المقطر مزدوجة ح2س (ddH2س) وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع HCl أو هيدروكسيد الصوديوم، إلى وحدة تخزين نهائي 1 تعقيم L. عامل التصفية هذا الحل مع عامل تصفية زراعة الأنسجة 0.22 ميكرومتر.
    1. إضافة الجلوكوز 1 م وبي....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام تقنيات وصف (الملخصة في الشكل 1)، explants الشبكية من 8 أسبوع البرية نوع (WT) الفئران كانت مقارنة بالعمر والخلفية مطابقة ترانسدوسين فارغة الفئران (Gnat1--/--). للحيوانات-/- Gnat1تفتقر إلى إليه لإغلاق دوري النوكليوتيدات بوابات قنوات أيونات في الاستجابة للمحفزات الخفيفة، ويبقى على فوتوريسيبتورس رود ديبولاريزيد حتى في ضوء14. اللاحقة بحاجة إلى الحفاظ على افلوكس البوتاسيوم من شأنه أن .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعرف الضوئي على الحروف وعكر تقاس بسهولة في نسيج الشبكية اكسبلانتيد باستخدام بيواناليزير استخدام الأساليب الموصوفة. ينطلق هذا الأسلوب من الفئات الأخرى في العديد من الخطوات الحاسمة. الأنسجة الشبكية المعزولة من خلال شق القرنية كبير دون انوكليتينج الكرة الأرضية، وصف أصلاً وينكلر15. يسمح هذا الأسلوب لعزل الشبكية للانتقال سريع من العين الحية في لوحة التقاط الأنسجة (عادة في غضون 5 دقائق). وتحفظ الأنسجة في 37 درجة مئوية طوال هذه العملية، التي تحافظ على التنفس الخلوي أفضل من عندما يتم وضعها على الثلج. تس.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر الدكتور ألكسندر كولسنيكوف والدكتور فلاديمير كيفالوف لتقديم Gnat1-/-الفئران، لتغذية مرتدة مفيدة، والمشورة، وقراءة المخطوطة.

وأيد هذا العمل قبل EY025269 المعاهد الوطنية للصحة (RR)، مركز أبحاث السكري في جامعة واشنطن-DK020579 المعاهد الوطنية للصحة (جرم و RR)، "جائزة تطوير المهنة" من البحوث لمنع العمى (RR)، ومؤسسة هورنكريست (RR)، و "جائزة تطوير المهنة" من JDRF ( جرم)، المعاهد الوطنية للصحة DK101392 (لجنة الأمن الغذائي العالمي)، DK020579 (لجنة الأمن الغذائي العالمي)، DK056341 (لجنة الأمن الغذائي العالمي) و DK114233 (جرم).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Seahorse XF24 محلل التدفق خارج الخليةAgilent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (يشمل: Microplate Capture Islet ، خرطوشة المستشعر وحل Caliberrant)Agilent ، Santa Clara ، CA101174-100يتضمن صفيحة صغيرة لالتقاط الجزيرة وخرطوشة مستشعر ومحلول العيار
RPMI 1640 Media (وسط مسحوق)Millipore-SigmaR1383RPMI 1640 الوسائط مع L-Glutamine وبدون جلوكوز أو بيكربونات الصوديوم
D-GlucoseMillipore-SigmaG82701M D-Glucose مفلتر ، لتحضير الوسائط
بيروفات الصوديومCorning25000CI100 ملي مولار بيروفات الصوديوم
Antimycin-AMillipore-SigmaA8674مكون بروتوكول إجهاد الميتوكوندريا
FCCPMillipore-SigmaC2920مكون بروتوكول إجهاد الميتوكوندريا
RotenoneMillipore-SigmaR8875مكون بروتوكول إجهاد الميتوكوندريا
2-deoxyglucoseMillipore-SigmaD6134مكون بروتوكول تحلل السكر
1 مم لكمات خزعة الجلد مع المكبسIntegra-Miltex33-31AA-P / 25زراعة أنسجة الشبكية
Dumont Mini-Fallps أدوات العلوم الدقيقة المستقيمة11200-10أداة زراعة أنسجة الشبكية
دومون الطبية # 5/45 ملقط - بزاوية 45 درجةأدوات العلومالدقيقة 11253-25زراعة أنسجة الشبكية
دومون # 7 ملقط -أدوات العلوم الدقيقة11271-30أداة زراعة أنسجة الشبكية
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay KitFisher ScientificP7589فحص
التطبيعقاعدة Trizma (قاعدة Tris)Millipore-SigmaT6066مكون عازلة التحلل
Triton X-100 (البولي إيثيلين جلايكول ثلاثي الأوكتيل الأثير)Millipore-SigmaX100مكون عازلة التحلل
0.5M EDTA درجة الحموضة 8.0AmbionAM9262مكون عازلة التحلل
C57BL / 6J الفئران   ؛مختبرات جاكسون  سلالة 000664
Gnat1-/- < / sup> و Gnat1+/+ فلاديمير كيفالوف ، دكتوراه ؛ كلية طب
أداة أداة المنحنية تحميل بجامعة واشنطن

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
  2. Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA

مقالات ذات صلة