Method Article

تجميد سطح الوظيفية للجينات باستخدام الطباعة الحجرية التشرد حبلا متعددة الخطوات

DOI:

10.3791/58634

⸱

October 25th, 2018

 ,  ,  , 
1Physics Department, Technical University of Munich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف لنا إجراء معدني بسيط للتثبيت جزيئات الحمض النووي الجيني-طول على سطح، التي يمكن استخدامها للقيام بتجارب تعبير الجينات الخلية الحرة في بيوتشيبس.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح التثبيت جينات على السطوح ليثوجرافيكالي منظم دراسة الجينات المجزأة عمليات التعبير في نظام مفاعل حيوي موائع جزيئية مفتوحة. على النقيض من النهج الأخرى نحو النظم الخلوية مصطنعة، يسمح هذا إعداد لإمداد متواصل مع الكواشف التعبير الجيني وتجفيف متزامنة من منتجات النفايات. وهذا يسهل تنفيذ عمليات التعبير الجيني الخلية الحرة على مدى فترات طويلة من الزمن، هو أمر مهم لتحقيق نظم التغذية المرتدة التنظيمية الجينات الحيوية. هنا نقدم بروتوكول مفصل لتلفيق الوراثية بيوتشيبس استخدام بسيط باستخدام معدني أسلوب استناداً إلى ردود فعل التشرد حبلا الحمض النووي، الذي يستخدم حصرا المكونات المتوفرة تجارياً. نحن نقدم أيضا بروتوكول على إدماج الجينات المجزأ مع بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)-على أساس نظام موائع جزيئية. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أن النظام متوافق مع انعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية، التي يمكن أن تستخدم للمراقبة المباشرة للتفاعلات الجزيئية بين الحمض النووي والجزيئات الواردة في مزيج التعبير.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلية الحرة التعبير الجيني ردود الفعل ذات أهمية كبيرة لمختلف التطبيقات في الكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية. وكان التعبير الخلية خالية من البروتينات مفيدة لإعداد عينات البروتين النقي، التي كانت الأساس للعديد من الدراسات في علم الأحياء الهيكلية. على سبيل المثال، نظم خالية من الخلية بنجاح واستخدمت للتعبير عن البروتين المجمعات1 أو غشاء بروتينات2، التي يصعب أن تنتج باستخدام تعبير يستند إلى الخلية. جدير بالذكر أن الخلية خالية من التعبير الجيني ردود الفعل واستخدمت أيضا توضيح بنية الشفرة الجينية، بدءاً من التجارب الرائدة واسطة Nirenberg ومأتى في عام 19613.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يرد جدولاً زمنياً للخطوات المذكورة في الأقسام المختلفة في المعلومات التكميلية (القسم 1).

1-رقاقة تلفيق

ملاحظة: كركائز، استخدام رقائق السليكون (بقطر 100 ملم، والسماكة مم 0.525) مع طبقة سميكة 50 نانومتر من ثاني أكسيد السيليكون أو الشرائح الزجاجية (24 ملم × 24 مم، رقم 1، 5؛ 22 مم × 50 مم، رقم 4). اعتماداً على التطبيق، أحجام وسمك أخرى قد تكون أكثر ملاءمة.

  1. التنظيف ركائز عبر RCA تنظيف الداخلي (الماء ومحلول الأمونيا NH3(aq) 30% وفوق أكسيد الهيدروجين ح2س2 30%، بنسبة 5:1:1)
    1. مزيج الماء والأمونيا الحل في كوب كوب وتسخين المخلوط على 70 درجة مئوية على لوحة الس....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطباعة الحجرية خطوتين: يبين الشكل 5 نتيجة لعملية من خطوتين معدني على شريحة زجاجية مع تداخل أنماط من خيوط ديس المسمى فلوريسسينتلي.

التعبير بروتين فلوري من فرشاة جينات: الشكل 6 يوضح التعبير عن البروتين الفلورسنت يبيت من الحمض النووي المعطل تداولها. في نقاط عدة في الوقت قمنا بتقييم معدل التعبير الجيني جزئيا تبيض البروتين الفلورسنت ومراقبة استرداد إشارة الأسفار، متجاهلة ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطباعة الحجرية بيفر تقنية قوية وتنوعاً لتجميد منقوشة من الحمض النووي الريبي أو. حتى الآن، الإجراء الذي يتضمن العديد من الخطوات، التي-إذا تغيرت--يمكن أن تكون مصدرا للفشل أو تخفيض أداء النظام.

هو خطوة حاسمة في تصنيع رقائق بيفوري بيجيلاتيون الركازة، الذي يوفر في توافق مع الحياة السطح. هنا، خطوة التنظيف مع إجراء تقييم النتائج والكفاءات الهامة، حيث أنه ينشط أيضا على السطح سيلانيزيشن اللاحقة. يجب أن تجف الركيزة لا، في أثناء بيجيلاتيون الفعلي، في أن. وعلاوة على ذلك، يجب أن يتم تخزين سيلاني-شماعة-الب.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونعترف مع الامتنان الدعم المالي لهذا المشروع "ستيفتونغ فولكس واجن" (منحة رقم 89 883) و "مجلس البحوث الأوروبي" (اتفاق منحة رقم 694410-عدنا). س. م. س. وتسلم الدعم المقدم من DFG من خلال GRK 2062.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
رقاقة السيليكون مع ثاني أكسيد السيليكون 50 نانومتر (ركيزة بيفور) سماكةرقاقة(& مايكرو; م): 525 & plusmn; 25 ، القطر (مم): 100
رقاقة السيليكون (لقالب PDMS الرئيسي) سمكرقاقة(& micro ؛ م): 525 & plusmn; 25 ، القطر (مم): 76.2 (3 بوصة)
شرائح زجاجية رقم 4Menzel22 مم × 50 مم
شرائح زجاجية رقم 1.5مساعد24 مم × 24 مم
Biotin-PEG-SilaneLaysan BioMW 5,000
التولوين اللامائيسيجما ألدريتش (ميرك)244511
StreptavidinThermo-Fisher ScientificS888
تقنيات الحمض النووي المتكاملة ( IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531SPCR
kit Wizard SV Gel ونظام تنظيف PCR   ؛PromegaA9281Spin-column PCR تنظيف
طقم PURExpressنيو إنجلاند BiolabsE6800Sنظام التعبير الخالي من الخلايا
PDMS داو كورنينجسليجارد 184
FluoSpheresThermo-Fisher ScientificF8771
PTFE (المعرف: 0.8 مم ، OD: 1.6 مم)BolaS 1810-10
EpoCore 20micro resist technology  GmbHPhotoresist
mr-Dev 600micro resist technology  GmbHPhotoresist المطور
Ti-PrimeMicroChemicalsالتصاق مروج السيليكون
ثنائي المكونPicodentTwinsil 
احباط صفراء للحماية من الأشعة فوق البنفسجيةLithoprotect (عبر MicroChemicals)Y520E212 <
قوي > المعدات < / قوي >
أقنعة للطباعة الحجرية الضوئيةZitzmann GmbH64.000 نقطة في البوصة ، 180 × 240 مم
مجهر مستقيمأوليمبوسBX51التصوير الحجري الضوئي والتصوير الفلوري
60x هدف الغمر في الماءOlympusLumPlanFlمستخدم مع Olympus BX51 ، NA 0.9
20x هدف الغمر في الماءOlympusLumPlanFlالمستخدم مع Olympus BX51 ، NA 0.5
PhotometricsCoolsnap HQالمستخدم مع Olympus BX51
Ligtht مصدرEXFOX-Cite 120Qالمستخدم مع Olympus BX51
المجهر المقلوبNikonTi2-EFluorescence تصوير التعبير الجيني
4x موضوعينيكونCFI P-Apo 4x Lambdaالمستخدم مع كاميرا نيكون Ti2-E
AndorNeo5.5المستخدم مع مصدر الضوء Nikon Ti2-E
LumencorSOLA SM IIنيكون Ti2-E
Okolabالجريءنيكون Ti2-E
ElveflowOB1 MK3
النانو ضوئيقياس تركيز الحمض
النووي منظف البلازماداينرفيمتو200 واط ، يعمل بسرعة 0.8 ملي بار مع العينة في قفص فاراداي
سيجرت Siegert DNA أنابيب Camera المستخدم مع حاضنة قفص خط المستخدم مع وحدة التحكم في الضغط مقياس

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
  2. Jaehme, M., Michel, H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Strand DisplacementBephore LithographyGene ImmobilizationMicrofluidic IntegrationTIRF MicroscopyPDMS CompartmentsFluorescence MicroscopySubstrate PEGylationPhotocleavable DNASelf re Expression System

Related Articles