يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تدفق سيتوميتريك الكشف عن خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية سرطان الثدي التي شكلت حديثا بعد عكس المبرمج

9.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58642

⸱

يناير 26, 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory of Agrobiotechnology, The Chinese University of Hong Kong, 3Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, The Chinese University of Hong Kong, 4Centre for Novel Biomaterials, The Chinese University of Hong Kong

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل apoptotic خلايا سرطان الثدي عن طريق فرز fluorescence تنشيط الخلية وكذلك الكشف عن انتقال خلايا جذعية غير سرطان الثدي إلى خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية سرطان الثدي بعد عكس المبرمج بالتدفق الخلوي.

الملخص

منذ فترة طويلة درس تكرار سرطان بالأورام في حين الآليات الأساسية التي لا تزال غير واضحة. في الآونة الأخيرة، نحن وآخرون تبين أن ظاهرة يدعى عكس المبرمج يؤدي إلى زيادة توموريجينيسيتي في مختلف النماذج الخلية تحت المحفزات المختلفة. وقد تركزت الدراسات السابقة في تتبع هذه العملية في المختبر والحية؛ ومع ذلك، عزل خلايا حقيقية عكس لم يتحقق، الذي يحد من فهمنا في النتائج المترتبة على عكس المبرمج. هنا، لنا أن نستفيد صبغة "كشف الأخضر" Caspase-3/7 لتسمية الخلايا مع caspases تنشيط بعد التعريفي أبوبتوتيك. كذلك يتم فرز الخلايا التي تحتوي على إشارات إيجابية بها fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لاسترداد. دراسة الخصائص المورفولوجية تحت المجهر [كنفوكل] يساعد على تأكيد حالة apoptotic قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. زيادة في توموريجينيسيتي وكثيراً ما يمكن أن يعزى إلى ارتفاع النسبة المئوية للخلايا الجذعية السرطانية (CSC)-مثل الخلايا. أيضا، نظراً إلى التباين في سرطان الثدي، تحديد منشأ هذه الخلايا الشبيهة بديوان الخدمة المدنية ستكون حاسمة لعلاج السرطان. وهكذا، نحن نستعد الخلايا الجذعية غير سرطان الثدي قبل تحريك المبرمج وعزل الخلايا caspase-تنشيط وتنفيذ إجراءات الإلغاء المبرمج. ويكشف تحليل التدفق الخلوي أن الثدي ديوان الخدمة المدنية-مثل الخلايا تظهر من جديد في المجموعة المعكوسة، مشيراً إلى ديوان الخدمة المدنية مثل خلايا الثدي هي عبور من الخلايا الجذعية غير سرطان الثدي خلال عكس المبرمج. وباختصار، يشتمل هذا البروتوكول عزلة apoptotic خلايا سرطان الثدي والكشف عن التغيرات في النسبة المئوية لديوان الخدمة المدنية في الخلايا معكوسة بالتدفق الخلوي.

المقدمة

وكان السرطان سبب الرئيسي للوفاة، مما تسبب عبئا ثقيلاً على البلدان في جميع أنحاء العالم1. سرطان الثدي برتب عالية سواء من حيث معدل الإصابة والوفيات في المرضى الإناث من بين جميع أنواع السرطان1. نظراً لعدم تجانس السرطان، يستخدم عادة مزيج من العقاقير في العلاج الكيميائي لتحقيق سرطان الخلية الموت2،،من34. بيد حيث كثيرا ما تستهدف المخدرات العلاج الكيميائي مشترك الحمض النووي5،6، البروتين التوليف7،8 و/أو microtubule الديناميات9، الخلايا التي تنمو بسرعة تتأثر أكثر من غيرها في حين خلايا هادئة مثل سرطان الخلايا الجذعية (CSC) s فهي عادة ما تكون أقل تأثرا10. وبالتالي، CSCs أكثر احتمالاً للبقاء على قيد الحياة بعد العلاج، مما يؤدي فيما بعد إلى مقاومة المخدرات والسرطان الانتكاس10،11. ومن ثم القضاء على CSCs أصبحت موضوعا هاما لعلاج السرطان ودراسة منشأ CSCs هو أمر ضروري.

مزيد من الدراسات حول ظاهرة عكس المبرمج قد أجريت في12،العقد الأخيرة13،15،14،16،،من1718 , 19-قبل ظهور هذا المفهوم، قد قبلت على نطاق واسع أن الخلايا سيخضع بلا رجعة المبرمج بعد تفعيل caspase. كاسباسيس هي عائلة من البروتين الإنزيمات التي تلعب أدواراً رئيسية في مراحل البدء والتنفيذ المبرمج، بما في ذلك تشكيل apoptotic معقدة، والانقسام ومن ركائز المصب20. يعتبر التنشيط من الجلاد caspases مثل caspase 3 أو caspase 7 "نقطة اللاعودة" للمبرمج21. ومع ذلك، لاحظ الباحثون مؤخرا أن يحدث عكس المبرمج على حد سواء في المختبر والمجراه في، خلال الخلايا التي يمكن استرداد من المبرمج حتى بعد تفعيل caspase12،،من1314 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19-وعلاوة على ذلك، سمات عدوانية مثل الكشف عن المقاومة أعلى الأصلي apoptotic محفز واختزاع أعلى في عكس السرطان الخلايا15. ومن ثم، اقترح أن النسبة المئوية للخلايا الشبيهة بديوان الخدمة المدنية ستكون أعلى في عكس السكان بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة، وتسهم في نهاية المطاف أكثر الخبيث ملامح بعد عكس المبرمج18.

سابقا، كثيرة بذلت جهود لتعقب المبرمج عكس في المختبر، والأهم من ذلك، الحية، مما يساعد كثيرا في تأكيد الطابع العالمي لهذه العملية16،،من1719. ومع ذلك، تفتقر إلى دراسة منهجية عن النتائج المترتبة على عكس الخلايا بسبب العزلة غير مرضية للخلايا التي مرت بصدق عكس المبرمج. وهناك حاجة للحصول على خلايا أبوبتوتيك نقية واستعادتها لمزيد من الدراسة. هكذا، نقوم باستخدام علامة المتعارف عليها جيدا لتفعيل caspase الجلاد كالعلامة من "نقطة اللاعودة"21 للمبرمج والاستفادة من الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) تمييز الخلايا تفعيل caspase الملون مع صبغ "كشف الأخضر" Caspase-3/7. الصبغ تساهمي مرتبط بسلسلة قصيرة من الأحماض الأمينية، ديفد، التي يمكن الاعتراف بها والمشقوق من caspases النشطة 3/7. الانقسام ويساعد على إطلاق الصبغة، التي سوف ترانسلوكاتي من سيتوسول إلى نواة حيث يربط بالحمض النووي وتنبعث fluorescence قوية. ويتجنب هذا الإجراء استخدام سكان خلية الأكبر فيها بعض الخلايا قد لا خضعت [ابوبتوسس].

قد حددت CSCs أو الشروع في ورم الخلايا في الأورام الصلبة العديد من استخدام واحد أو مزيج من عدة marker(s) السطحية وعدد قليل جداً من هذه الخلايا كافية لشكل الأورام في الفئران العوز22،23، 24،25،،من2627. مزيج من CD44 و CD24 استخداماً في دراسات الثدي ديوان الخدمة المدنية، و CD44+/CD24– خلايا تم تعريفها الثدي CSCs26،27،،من2829 , 30-في الآونة الأخيرة، ونحن بإجراء سلسلة من التجارب تأكيد العلاقة المقترحة بين عكس المبرمج و CSCs، وتبين أن خلايا سرطان الثدي عكس المكتسبة زيادة قدرة تشكيل الورم في المختبر وفي المجراة مع نسبة مرتفعة من الخلايا مع ديوان الخدمة المدنية علامات18. على الرغم من أننا لا يمكنها استبعاد إمكانية البقاء على قيد الحياة أفضل CSCs الثدي وهكذا الحصول على إثراء بعد عكس المبرمج، الأهم من ذلك، عندما كنا عزل الخلايا الجذعية غير السرطانية والموضوع لهم بعكس المبرمج، ديوان الخدمة المدنية ستظهر في الأصل غير-الجذعية غير سرطان الخلية السكان، مما يوحي بأن الجذعية سرطان خلايا يمكن أن تسهم هذه الزيادة في النسبة المئوية ل CSCs أثناء عكس المبرمج.

هذا المقال يهدف إلى إثبات الانتقال من الخلايا الجذعية غير سرطان الثدي إلى خلايا الثدي مثل ديوان الخدمة المدنية بعد عكس المبرمج والكشف عن هذا التحول بالتدفق الخلوي. وتعد الخلايا الجذعية غير سرطان الثدي في البداية بعزل CD44/CD24–+ الثدي الخلايا السرطانية بنظام مراقبة الأصول الميدانية. ثم، الناجم عن المبرمج وأكدته التغييرات الشكلية تحت المجهر. بعد ذلك، تم عزلة بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية الخلايا apoptotic المسمى إيجابيا بصبغ "كشف الأخضر" Caspase 3/7 ومثقف كذلك نظراً لعدم وجود مستحثات apoptotic لعكس المبرمج. ثم ملطخة الخلايا معكوسة مع علامات ديوان الخدمة المدنية بعد 7 أيام انتعاش لتحليل تدفق سيتوميتريك. خلايا CD44+/CD24– علامات تظهر من جديد في السكان المعكوسة، مما يوحي بحدوث الانتقال من الخلايا الجذعية غير السرطانية لديوان الخدمة المدنية-مثل الخلايا أثناء عكس المبرمج.

عكس المبرمج وقد لوحظ في سرطان عدة خطوط الخلايا، فضلا عن الخلايا الأولية الطبيعية تعامل مع المحفزات أبوبتوتيك مختلفة في المختبر12،13. وقد تم اقتفاء أثر هذه العملية أيضا في المورفولوجية نموذج المجراة في16،،من1719. يمكن الحصول على الكثير من المعلومات فيما يتعلق بالآلية الأساسية لانتكاس السرطان في نماذج أمراض السرطان المختلفة ومنشأ CSCs عن طريق استخدام الأسلوب كما هو موضح في هذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد الثدي سرطان الخلايا الجذعية

  1. الثقافة MCF-7 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا في 10 مل من خالية من الفينول الحمراء المتوسطة روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 تستكمل مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS) في طبق 100 مم. الثقافة T47D في 10 مل من خالية من الفينول الحمراء المتوسطة RPMI 1640 تستكمل مع 2 مم ل الجلوتامين، 10% الحرارة-إبطال FBS، و 1% v/v البنسلين والستربتوميسين (PS) في طبق 100 مم. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في أول أكسيد الكربون 5%2هواء 95% خلية حاضنة ثقافة.
    ملاحظة: أحمر الفينول يؤثر على الكشف على أساس الأسفار ولكن أيضا لها تأثير محتمل على نمو خلايا سرطان الثدي سبب لها تأثيرات شبيهة بالاستروجين31. على سبيل المثال، يمكن أن يحفز الفينول الأحمر مستقبلات البروجسترون ونمو الخلايا MCF-731. أنها يمكن أيضا أن يحفز نمو الخلايا T47D31.
  2. أغسل الخلايا مع 2 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرتين. إضافة 2 مل 0.05% التربسين-يدتا MCF-7 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 أو 2 مل من 0.25% التربسين-أدتا إلى الخلايا T47D.
    ملاحظة: حاجة تختلف تركيز التربسين-يدتا لفصل الخلايا بين أنواع الخلايا سرطان الثدي مختلفة بينما بتركيز غير مناسب قد يؤثر على نمط التعبير لبعض علامات سطح الخلية مثل CD44 و CD2432.
  3. ثقافة الأطباق لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية تحت جو من 5% CO295% الهواء. وكثيراً ما تحقق مفرزة الخلايا تحت المجهر لمنع الخلايا من الهضم الإفراط يدتا التربسين.
  4. عند فصل خلايا أكثر من 90%، إضافة 5 مل من المكتملة ربمي المتوسطة إلى الطبق و "الماصة؛" من على سطح طبقة الخلية عدة مرات.
  5. نقل الخلايا إلى 15 مل الأنبوبة المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: عادة، يمكن الحصول على حوالي 6 × 106 خلايا من طبق 100 ملم عند كونفلوينسي يصل إلى 70%.
  6. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الكريات في6 10 خلايا/100 ميكروليتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5% جيش صرب البوسنة وأزيد الصوديوم 0.1 ٪) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  7. تقسيم الخلايا إلى عدة أنابيب. لخلايا mcf-7، تقسيم الخلايا إلى أنابيب 4: اثنين ايستب يتحكم، واحد لواحد CD24 تلطيخ CD24 التحكم الإيجابي وواحد لتلطيخ المزدوج.
  8. للخلايا T47D، وتقسيم الخلايا إلى أنابيب 3: اثنان لضوابط ايستب وواحدة لتلطيخ المزدوج.
  9. لجمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا، تقسيم الخلايا إلى أنابيب 4: اثنان ايستب يتحكم، واحد لواحد CD44 تلطيخ كمراقبة CD44 الإيجابية وواحد لتلطيخ المزدوج.
  10. أجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب مرة أخرى في 300 x ز و 4 درجات مئوية للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية، ثم قم بإضافة كتلة Fc المخفف 01:50 في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
  11. احتضان هذه العينات في الثلج لمدة 20 دقيقة في الظلام قبل الطرد المركزي في 300 x ز و 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  12. إضافة مترافق fluorochrome مونوكلونل ضد البشرية CD44 (بيركب-Cy5.5) وتلطيخ CD24 (PE) في تخفيف 01:40 و 01:10 (في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية) في المزدوج مجموعات. بالنسبة لعناصر إيجابية، إضافة CD44 (بيركب-Cy5.5) لجمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 وإضافة CD24 (PE) إلى خلايا mcf-7 في تركيز نفسه، على التوالي.
    ملاحظة: وقد تم الجمع بين CD44 و C24 استخداماً في الثدي ديوان الخدمة المدنية دراسة26،27،28،،من2930.
  13. إضافة لمجموعات مراقبة ايستب، Cy5.5 بيركب الماوس IgG2b، κ في 01:40 تمييع كعنصر التحكم ايستب CD44 الأجسام المضادة و PE الماوس IgG2a، κ في 01:10 إضعاف كعنصر التحكم ايستب لأجسام CD24 في 106 خلايا/100 ميكروليتر.
    ملاحظة: وينصح ايستب عناصر التحكم للأجسام المضادة لمصلحة كعناصر سلبية33.
  14. احتضان العينات (من الخطوات 1.12 و 1.13) في 4 درجات مئوية في الظلام للحد الأدنى 30 أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز و 4 درجات مئوية للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  15. أغسل بيليه مرتين مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  16. ريسوسبيند بيليه في 0.5 مل من برنامج تلفزيوني وتصفية من خلال 40 ميكرون نايلون قبل تشغيل على أرز fluorescence تنشيط خلية.
  17. ولأغراض النابضة والتعويض، وصمة عار خلايا mcf-7 مع الأجسام المضادة مترافق PE-CD24 ووصمة عار MDA-ميغابايت-231 الخلايا مع الأجسام المضادة-CD44 بيركب-Cy5.5-مترافق كعناصر إيجابية. استخدام خلايا ملطخة بضوابط ايستب كعناصر سلبية (الشكل 1).
  18. جمع الخلايا مع CD44/CD24–+ علامات في أنابيب مستديرة القاع البوليستيرين 12 × 75 مم تحتوي على 1 مل من جمع المتوسطة (خالية من الفينول الأحمر RPMI 1640 المتوسطة وتستكمل مع 20% الحرارة إبطال FBS و 2% v/v PS). الطرد المركزي هذه الأنابيب في 300 x ز و RT لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
    ملاحظة: ديوان الخدمة المدنية-مثل الخلايا في خلايا سرطان الثدي تم تعريفها ك CD44+/CD24– الخلايا26،،من2728،،من2930، وسرطان الثدي سرطان الخلايا الجذعية غير وتعرف بأنها CD44/CD24–+ الخلايا18 (الشكل 1).
  19. لوحة الخلايا السرطانية الجذعية غير مفروزة الثدي في الطبق الثقافة التي تحتوي على مجموعة جديدة متوسطة للمزيد من الثقافة في 37 درجة مئوية في 5% CO2 خلية ثقافة حاضنة.

2-Apoptotic التعريفي والكشف

  1. إعداد 1 مم ستوروسبوريني12،34 في [دمس]. مجموعة MCF-7 المعالجة، إضافة 25 ميكروليتر من ستوروسبوريني 1 مم إلى المتوسطة المنجزة لخلايا mcf-7 جعل يصل إلى 10 مل حجم النهائي (2.5 staurosporine ميكرومتر) في أنبوب مخروطي 15 مل. ماصة لخلط المحتوى بشكل متساو.
  2. إزالة المتوسطة الثقافة من الخلايا، وتغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني مرة واحدة. ثم أضف 10 مل المتوسطة مع staurosporine ميكرومتر 2.5 إلى خلايا mcf-7 ح 6 لحمل المبرمج عندما تصل كثافة الخلية كونفلوينسي 70%.
  3. إعداد 1 مم باكليتاكسيل35،36 في [دمس]. لمجموعة T47D المعالجة، إضافة 12.5 ميكروليتر من باكليتاكسيل 1 ملم إلى المتوسطة المنجزة للخلايا T47D لجعل إلى حجم 10 مل (5 ميكرومترات باكليتاكسيل) في أنبوب مخروطي 15 مل نهائي. ماصة لخلط المحتوى بشكل متساو.
  4. إزالة الثقافة المتوسطة من الخلايا، وتغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني مرة واحدة. قم بإضافة 10 مل المتوسطة مع 5 ميكرومترات باكليتاكسيل إلى الخلايا T47D عن 10 (ح) الحث على المبرمج عندما تصل كثافة الخلية كونفلوينسي 70%.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون الأمثل الوقت التعريفي وتركيز المحرضات التي تحفز المبرمج كلما تم استخدام خط خلية جديدة للمرة الأولى.
  5. لمجموعة MCF-7 المعالجة بالمذيبات، إضافة 25 ميكروليتر من العقيمة ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) إلى متوسط المكتملة من خلايا mcf-7 جعل إلى وحدة تخزين نهائي من 10 مل (أي 0.25% v/v [دمس]) في أنبوب مخروطي 15 مل. ماصة لخلط المحتوى بشكل متساو.
  6. إزالة المتوسطة الثقافة من المذيب يعامل خلايا mcf-7، المياه والصرف الصحي مع 2 مل من برنامج تلفزيوني مرة واحدة. ثم أضف 10 مل المتوسطة مع 0.25% v/v [دمس] ح 6 كعنصر التحكم المذيبات ل STS.
  7. لمجموعة T47D المعالجة بالمذيبات، إضافة 5 ميكروليتر من [دمس] العقيمة إلى المتوسطة المنجزة للخلايا T47D لجعل إلى الحجم النهائي 10 مل (أي، 0.05% v/v [دمس]) في أنبوب مخروطي 15 مل. ماصة لخلط المحتوى بشكل متساو.
  8. إزالة المتوسطة الثقافة من الخلايا T47D المعالجة المذيبات، وتغسل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني مرة واحدة. ثم أضف 10 مل المتوسطة مع 0.05% v/v [دمس] ح 10 كعنصر التحكم المذيبات باكليتاكسيل.
  9. لمراقبة التغيرات المورفولوجية للخلايا المعالجة، وصمة عار الخلايا مع 50 نانومتر "ميتوتراكير الأحمر كمكسروس" و 250 نانوغرام/مليلتر هويشت 33342، واحتضان لآخر 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت جو من 5% CO295% الهواء. مراقبة مورفولوجيا الخلايا apoptotic نموذجية تحت 60 × [كنفوكل] ليزر المسح مجهر (الشكل 2).
    ملاحظة: مورفولوجيا المبرمج نموذجي يتضمن انكماش الخلية والغشاء بلبينغ وتجزئة الميتوكوندريا والتكثيف النووية لكن مع الغشاء الخلوي سليمة12،،من1314،15 18، ،37.

3-عزل الخلايا أبوبتوتيك والمبرمج عكس الإجراء

  1. وصمة عار apoptotic محفز--والمذيبات-يعامل MCF-7 أو خلايا T47D مع 3 صبغ "كشف الأخضر" Caspase-3/7 ميكرومتر في تركيز خلية 106/mL في الظلام مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت جو من 5% CO295% الهواء.
  2. تصفية الخلايا عن طريق 40 ميكرون نايلون قبل تشغيل على فارز للفرز.
  3. لأغراض النابضة، أول بوابة السكان الرئيسية (R1) واستبعاد الأنقاض برسم الرسم البياني في النقاط مع مبعثر إلى الأمام والجانب مبعثر (الشكل 3).
  4. تستخدم الخلايا غير المعالجة دون إضافة صبغة "كشف الأخضر" Caspase-3/7 كعنصر سلبي إلى بوابة المنطقة السلبية (R2) (الشكل 3A).
  5. استخدام الخلايا تعامل مع staurosporine12،،من1834 ح 24 وملطخة بالصبغة كعنصر إيجابي لبوابة المنطقة إيجابية (R3) (الشكل 3).
  6. جمع الخلايا إيجابية (R3) من المجموعات تعامل محفز في أنابيب مستديرة القاع البوليستيرين 12 × 75 مم تحتوي على 1 مل من جمع المتوسطة (نفس المتوسط جمع في الخطوة 1، 18) (3 أرقامج-3د). الطرد المركزي هذه الأنابيب في 300 x ز و RT لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
  7. جمع الخلايا السلبية (R2) من المجموعات المعالجة بالمذيبات في أنابيب مستديرة القاع البوليستيرين 12 × 75 مم مع 1 مل من جمع المتوسطة كما هو الحال في الخطوة 3، 6 (ﻫالأرقام 3-3و).
    ملاحظة: ويمكن جمع جزء صغير من الخلايا (مثل الخلايا 10,000) وإعادة تشغيل على فارز للتحقق من نمط علامة caspases النشطة. إذا كان ما يزيد على 90 في المائة من فرز الخلايا المعالجة بالمذيبات ترد في منطقة caspase-السلبية أو ما يزيد على 90% من فرز الخلايا المعالجة محفز ترد في منطقة caspase-إيجابية، يعتقد أن نقي نسبيا (أرقام ج 3-3F) هذه الخلايا التي تم جمعها. وإلا، يجب إعادة تعيين منطقة الفرز و/أو فارز.
  8. ريسوسبيند الخلايا تم فرزها في المتوسط مجموعة جديدة والبذور لها في لوحات زراعة الأنسجة 12-جيدا والثقافة في 37 درجة مئوية تحت جو من 5% CO295% الجوية لمدة 7 أيام لعكس المبرمج.

4-تأكيد للمبرمج في تفعيل Caspase الخلايا

  1. ميكس 10 حبيس، 140 ملم كلوريد الصوديوم، و 2.5 ملم كاكل2 إعداد ملزمة أنيكسين المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4). تخزين المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية وتجنب المخزن المؤقت لفضح للضوء.
  2. تحضير حل عامل 100 ميكروغرام/مل من يوديد propidium (PI) بتمييع ميليلتر 5 1 مغ/مل الحل بي الأسهم في 45 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم annexin. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية وتفادي الحل تعريض للضوء.
    ملاحظة: بي مطفر محتملة وينبغي التعامل معها بحذر.
  3. إعداد الخلايا المعالجة محفز كما هو الحال في الخطوات 2.1 إلى 2.5.
  4. جمع MCF-7 يعامل محفز أو خلايا T47D التي بيبيتينج المتوسط عبر طبقة الخلية x 3-5 لفصل الخلايا. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  5. الطرد المركزي في 300 x ز و RT لأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  6. ريسوسبيند الخلايا مع المتوسطة المنجزة في تركيز خلية 106/mL في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل ووصمة عار الخلايا مع 3 ميكرومتر Caspase 3/7 "كشف الأخضر" صبغ في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. الطرد المركزي في 300 x ز و RT لتجاهل الحد الأدنى 5 في سوبيرناتانتس.
  8. تغسل الخلايا مع 1 مل من المثلج برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز وتجاهل 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 في سوبيرناتانتس.
  9. 1 ميليلتر من 100 ميكروغرام/مل PI حل عملي لكل 100 ميكروليتر من تعليق خلية ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت ملزم annexin مع ميكروليتر إضافة 5 من المتقارن V أننيكسين واحتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يشيع استخدام أنيكسين الخامس وبي معا لتسمية الخلايا أبوبتوتيك في التدفق الخلوي38،،من3940.
  10. إضافة 400 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم أننيكسين، مزيج بلطف. تبقى العينات على الجليد قبل تشغيل في سيتوميتير تدفق.

5-قياس الثدي الخلايا الشبيهة بديوان الخدمة المدنية بالتدفق الخلوي

  1. حصاد MCF-7 المعكوسة في كلتا المجموعتين تعامل محفز أو المذيبات مع التربسين-يدتا 0.05%. حصاد الخلايا T47D في كلتا المجموعتين تعامل محفز أو المذيبات أو مع التربسين-يدتا 0.25% كما هو الحال في الخطوات 1.2 إلى 1.5.
  2. وصمة عار الخلايا مع مترافق fluorochrome مونوكلونل ضد البشرية CD44 (بيركب-Cy5.5) و CD24 (PE) كما هو الحال في الخطوة 1، 12. ومن ناحية أخرى، تعد عناصر التحكم ايستب كما في الخطوة 1، 13.
  3. تشغيل الخلايا على سيتوميتير تدفق والكشف عن النسبة المئوية للخلايا مع CD44+/CD24– علامات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من أجل مراقبة الانتقال من الثدي غير الجذعية خلايا سرطان الثدي الخلايا الشبيهة بديوان الخدمة المدنية، الفرز الأولى من CD44/CD24–+ هناك حاجة إلى خلايا سرطان الثدي. خط الخلية MCF-7، الذي حوالي 0.15% الخلايا مع علامات ديوان الخدمة المدنية بين السكان الأصلي (الشكل 1)، هذه الخطوة ساعدت استبعاد إمكانية تخصيب ديوان الخدمة المدنية أثناء عكس المبرمج. على العكس من ذلك، إذا كانت هناك أية خلايا مع علامات CSC في السكان الأصليين، مثل خلايا T47D (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويصف هذا البروتوكول بطريقة مباشرة وواضحة للكشف عن انتقال الخلايا الجذعية غير سرطان الثدي في الثدي ديوان الخدمة المدنية-مثل الخلايا نتيجة عكس المبرمج. يمكن مساعدة تأكيدا لخصائص هذه الخلايا عكس ديوان الخدمة المدنية باستخدام أناالمختبر ن ماموسفيري تشكيل المقايسة و في فيفو إكسينوجرافت زرع في الفئران العوز18،24،26 ،،من2742،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

هذا العمل كان يدعمها "صندوق التكنولوجيا المبتكرة لابتكار التكنولوجيا اللجنة": "دعم التمويل" من الدولة مفتاح المختبر من يشكله (الصينية) ولو كو-سيونغ الصندوق البحوث الطبية الحيوية ومؤسسة هيسن لي. وأيد Y.X. سنهم بعد التخرج من المرحلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة ثقافة النوع الأمريكيMCF-7HTB-22
MDA-MB-231ثقافة النوع الأمريكي (ATCC)HTB-26
T47Dمجموعة ثقافة النوع الأمريكي (ATCC)HTB-133
قوي >كاشف< / قوي >
0.05٪ تريبسين-EDTA25300054
0.25٪ تريبسين-EDTAInvitrogen25200072
Alexa Fluor 680 annexin V مترافقInvitrogenA35109
ألبومين مصل الأبقارUSB9048-46-8
CaCl2< / sub> & middot; 2H2< / sub>OSigma-AldrichC-5080
CellEvent caspase-3/7 صبغة الفلورسنت الخضراءInvitrogenC10423
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتشD2650
Fc كتلةMiltenyi Biotec130-059-901
مصل الأبقار الجنينيInvitrogen16000044
HEPESمعطل بالحرارة USB16926
Hoechst 33342InvitrogenH3570
L-glutamineInvitrogen25030081
Mitotracker Red CMXRosInvitrogenM7512
الأجسام المضادة أحادية النسيلة ضد CD24BD Biosciencesالبشرية 555428استنساخ PE: ML5
القطعة: 5049759
RRID: AB_395822
الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد CD44BD Biosciencesالبشرية 560531PERCP-CY5.5 استنساخ: G44-26
القطعة: 7230770
RRID: AB_1727485
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش31434
باكليتاكسيلسيجما ألدريتشT7402
PE ماوس IgG2a ، & كابا ؛ استنساخ التحكم في النمط المتماثلBD Biosciences554648: G155-178 (RUO)
RRID: AB_395491
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15070-063
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشابهBD Biosciences558304استنساخ: 27-35
RRID: AB_647257
فوسفات مخزن محلول ملحيThermo Fisher Scientific21600010
بروبيديوم يوديدInvitrogenP1304MP
معهد روزويل بارك التذكاري 1640 متوسطInvitrogen11835055الفينول أزيد الصوديوم الخالي من
سيجما ألدريتشS2002
staurosporineSigma-AldrichS4400
Equipment< / قوي >
100 مم طبق ثقافةGreiner Bio-One664160
لوحات زراعة الأنسجة ذات 12 بئرمصفاة خلية 150628
فيشر العلمية 40 & mu ؛ m شبكة نايلونBD Biosciences08-771-1
FACSuite حزمة البرامج v1.0BD Biosciences651360
FACSVerseBD Biosciences651155
FluoView FV1000 مجهر متحد البؤرأوليمبوسIX8160X موضوعي
FV10-ASW عارض البرنامج Ver.4.2bأوليمبوسالبوليسترين
المستدير القاع 12 & مرات; أنابيب 75 ممBD Biosciences352003
فارز S3eBio-Rad1451006
(ATCC) مجموعة < الأحمر الحرارية

المراجع

  1. McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
  2. Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
  3. Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
  4. Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
  5. Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
  6. Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine). Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).
  7. Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
  8. Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
  9. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
  10. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
  11. Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
  12. Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
  13. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
  14. Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63(2013).
  15. Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
  16. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015(2015).
  17. Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  18. Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
  19. Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  20. Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
  21. Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
  22. Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
  23. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
  24. O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  25. Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357(2015).
  26. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  27. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  28. Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
  29. Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59(2006).
  30. Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
  31. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
  32. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  33. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
  34. Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
  35. Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
  36. Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685(2013).
  37. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  38. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
  39. Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
  40. Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
  41. Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
  42. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  43. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
  44. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  45. Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
  46. Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية لسرطان الثديقياس التدفق الخلويفرز الخلايا المنشط بالفلوريةالمجهر البؤريالكشف عن كاسبيز-3/7مؤشرات CD44 وCD24الخلايا السرطانية غير الجذعيةتحليل القدرة على تكوين الأورام
تدفق سيتوميتريك الكشف عن خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية سرطان الثدي التي شكلت حديثا بعد عكس المبرمج
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.