يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

باراميكسوفيروسيس لاستهداف الورم المرباة: التصميم والتقييم السابقين فيفو

9.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58651

⸱

يناير 7, 2019

 , 
1Department of Translational Oncology, German Cancer Research Center (DKFZ) and National Center for Tumor Diseases (NCT), 2Faculty of Biosciences, Heidelberg University, 3Department of Medical Oncology, NCT and Heidelberg University Hospital

في هذه المقالة

ملخص

ويصف هذا البروتوكول سير عمل مفصلة لتوليد والسابقين فيفو توصيف الفيروسات أونكوليتيك للتعبير عن إيمونومودولاتورس، باستخدام فيروسات الحصبة ترميز engagers خلية T بيسبيسيفيك كمثال. التطبيق والتكيف مع سائر المنابر ناقلات والمتسلسلات سيتم التعجيل بتنمية إيمونوفيروثيرابيوتيكس الرواية للترجمة السريرية.

الملخص

العلاج المناعي السرطان الناجح لديه القدرة على تحقيق السيطرة الورم طويلة الأجل. وبالرغم من النجاحات السريرية الأخيرة، لا تزال هناك حاجة ملحة لعلاجات آمنة وفعالة مصممة خصيصا للورم الفردية محصنة ضد التشكيلات الجانبية. فيروسات أونكوليتيك تمكين التعريفي للاستجابات المناعية المضادة للورم وكذلك التعبير الجيني مقيدة بالورم. ويصف هذا البروتوكول تحليل متجهات أونكوليتيك إيمونومودولاتوري جيل والسابقين فيفو. التركيز على الفيروسات لقاح الحصبة ترميز engagers خلية تي بيسبيسيفيك على سبيل مثال، يمكن تكييفها المنهجية العامة لسائر أنواع الفيروسات والمتسلسلات. يتضمن سير العمل عرض تصميم والاستنساخ، والإنقاذ، ونشر الفيروسات المؤتلف. فحوصات لتحليل حركية النسخ المتماثل والنشاط الحال ناقل وكذلك الأداء الوظيفي ل immunomodulator معزولة السابقين فيفو مدرجة، وبالتالي تيسير توليد عوامل جديدة لمزيد من التطوير في نماذج الإكلينيكية وفي نهاية المطاف الترجمة السريرية.

المقدمة

ويجري وضع فيروسات أونكوليتيك (أوفس) كالعلاجات المضادة للسرطان على وجه التحديد إجراء نسخ متماثل داخل وتقتل الخلايا السرطانية بينما تترك الأنسجة صحية سليمة. أصبحت الآن شائعة فهم أن فيروثيرابي أونكوليتيك (عفت)، وفي معظم الحالات، لا تعتمد فقط على تحلل الورم كاملة قبل النسخ المتماثل كفاءة وانتشار الفيروس، ولكن يتطلب آليات إضافية للعمل من أجل نجاح العلاج، بما في ذلك استهداف الأوعية الدموية واللحمية، والأهم من ذلك التحفيز المناعي1،2،،من34. بينما يستخدم العديد من أوائل الدراسات OV فيروسات غير معدلة، البحوث الجارية لقد استفادت من بيولوجية تحسين التفاهم والمصارف البيولوجية الفيروسات التي يحتمل أن تحتوي على رواية أوفس، والإمكانات التي يوفرها الهندسة الوراثية من أجل إنشاء OV متقدمة منصات5،،من67.

ونظرا لنجاح الأخيرة من العلاج المناعي، المتسلسلات immunomodulatory تتسم بأهمية خاصة فيما يتعلق بالهندسة الوراثية من أوفس. التعبير المستهدفة من هذه المنتجات الجينات بالخلايا السرطانية المصابة OV يقلل من سمية مقارنة للإدارة العامة. استهداف تحقيق باستخدام الفيروسات مع أونكوسيليكتيفيتي الأصيل أو عن طريق تعديل انتحاء الفيروسية8. المحلية المرباة يعزز الآليات المضادة للورم متعدد الأوجه لعفت. وعلاوة على ذلك، هذه الاستراتيجية دور أساسي في استجواب التفاعل بين الفيروسات والخلايا السرطانية، والمضيف الجهاز المناعي. وتحقيقا لهذه الغاية، يوفر هذا البروتوكول سير قابل للتعديل والمعمول بها لتصميم واستنساخ، وإنقاذ، ونشر، والتحقق من صحة نواقل فيروس الباراميكسو (تحديداً فيروس الحصبة) أونكوليتيك ترميز هذه المتسلسلات.

تعديل الاستجابة المناعية يمكن أن يتحقق بتشكيلة واسعة من منتجات التحوير استهداف خطوات مختلفة للسرطان-الحصانة دورة9، بما في ذلك تعزيز الاعتراف مستضد ورم [مثل المستضدات المرتبطة بورم (TAAs) أو مستحثات من الرئيسية histocompatibility المعقد (MHC) الفئة الأولى جزيئات] عبر دعم نضوج الخلايا الجذعية لكفاءة مستضد العرض التقديمي (السيتوكينات)؛ تجنيد وتفعيل الخلايا المناعية المرغوبة مثل السامة للخلايا والخلايا مساعد تي [المستقطبات، بيسبيسيفيك خلية T engagers (بتس)]؛ استهداف الخلايا القمعية مثل التنظيمية تي الخلايا والخلايا المستمدة من النقوي القامع والضامة المرتبطة بورم والمرتبطة بسرطان الخلايا الليفية (الأجسام المضادة، بتيس، السيتوكينات)؛ ومنع تثبيط الخلية المستجيب واستنفاد (مثبطات حاجز). وبالتالي، يتوفر عدد كبير عوامل البيولوجية. تقييم مثل هذه إيمونومودولاتورس المرمزة بالفيروس فيما يتعلق بالفعالية العلاجية وأوجه التآزر المحتملة، فضلا عن فهم آليات كل منها ضروري لتحسين علاج السرطان.

المعني السلبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل فيروسات الحمض النووي الريبي الأسرة Paramyxoviridae تتسم بميزات عديدة تفضي إلى استخدامها كمتجهات أونكوليتيك. وتشمل هذه أونكوتروبيسم الطبيعية، سعة كبيرة الجينوم المتسلسلات (أكثر من 5 كيلو بايت)10،11، كفاءة الانتشار بما في ذلك تشكيل سينسيتيا، والاستمناع ارتفاع12. ولذلك، OV منصات استناداً إلى سل الكلاب الفيروس13والنكاف فيروس14و فيروس مرض نيوكاسل15،16،الفيروس سينداي17، الفيروس القردي 518وطوبيا فيروس الباراميكسو19 وقد وضعت. أبرزها، يعيش لقاح الحصبة الموهنة سلالات (MV) قد حققت تقدما في التنمية السريرية والسريرية20،21. وقد استخدمت سلالات الفيروسات هذه لعقود من أجل التحصين الروتينية مع سجل سلامة ممتاز22. وعلاوة على ذلك، ليس هناك أي خطر للطفرات insertional بسبب النسخ المتماثل سيتوسوليك تماما من باراميكسوفيروسيس. نظام الوراثة عكس تنوعاً يستند كدنا المضادة الجينوم الذي يسمح بإدراج المتسلسلات في وحدات النسخ الإضافية (عطاس) هو متاح11،،من2324. يجري حاليا تقييم ناقلات MV ترميز يوديد الصوديوم سيمبورتير (MV-شيكل) للتصوير والعلاج بالأشعة أو القابلة للذوبان carcinoembryonic antigen (MV-سيا) كعلامة بديلة للتعبير الجيني الفيروسي في التجارب السريرية (NCT02962167، NCT02068794، NCT02192775، NCT01846091، NCT02364713، NCT00450814، NCT02700230، NCT03456908، NCT00408590، و NCT00408590). وأكدت الإدارة الآمنة وقد أبلغ عن حالات من الفعالية المضادة للورم في السابق دراسات25،،من2627،،من2829، 30 (استعرضها مساويل et al.31)، مما يمهد الطريق لفيروسات الحصبة أونكوليتيك الإضافية التي تم تطويرها واختبارها بريكلينيكالي. MV ترميز immunomodulatory الجزيئات التي تستهدف مختلف خطوات دورة الحصانة السرطان قد ثبت أن تأخير نمو الورم و/أو إطالة البقاء على قيد الحياة في الفئران، مع وجود أدلة على فعالية جهاز المناعة بوساطة والذاكرة المناعية الواقية على المدى الطويل في سينجينيك نماذج الماوس. ترميز ناقلات المتسلسلات تشمل مستعمرة بلعم المحببات حفز عامل (GM-CSF)32،33، H. pylori العَدلات-تفعيل البروتين34، نقطة تفتيش محصنة ضد مثبطات35، انترلوكين-12 (إيل-12)36، TAAs37، وبتس38، الذي تشابك ورم السطحي antigen مع CD3 وهكذا حمل المضادة للورم النشاط بخلايا T [بولكلونل]، بغض النظر عن خلايا تي مستقبلات خصوصية وتحفيز المشاركين ( الشكل 1). الحصول على النتائج السريرية واعدة لهذه الثوابت كذلك جهود متعدية الطلب.

تاليموجيني لاهيرباريبفيك (تي-مركزنا)، نوع أنا فيروس الحلأ البسيط ترميز GM-CSF، هو فقط أونكوليتيك العلاجية وافقت عليها "الولايات المتحدة للأغذية" والدواء (FDA) ووكالة الأدوية الأوروبية (EMA). لم تظهر الدراسة ثالثا المرحلة الرائدة للموافقات في أواخر عام 2015 فقط نجاعة في موقع الحقن داخل الأورام، ولكن أيضا آثار بعاديا (أي، إسقاطها من غير حقن الآفات) في سرطان الجلد المتقدم39. T-مركزنا دخلت منذ محاكمات إضافية للتطبيق في الكيانات الورم الأخرى (مثل سرطان الجلد غير الميلانوما، ، NCT03458117؛ وسرطان البنكرياس، NCT03086642) وتقييم مجموعة من طرق العلاج، لا سيما مع نقطة تفتيش محصنة مثبطات (NCT02978625، NCT03256344، NCT02509507، NCT02263508، NCT02965716، NCT02626000، NCT03069378، NCT01740297، وريباس هt al.40).

وهذا يدل على إمكانية العلاج المناعي أونكوليتيك ليس فقط، بل أيضا الحاجة إلى إجراء مزيد من البحوث لتحديد تركيبات متفوقة عفت والمرباة. التصميم العقلاني ناقلات إضافية وتنميتها للاختبار السريري هو المفتاح لهذا التعهد. وهذا سوف تقدم أيضا فهم الآليات الكامنة وقد آثار بالنسبة للتقدم نحو أكثر تخصيصاً لعلاج السرطان. وتحقيقا لهذه الغاية، يعرض هذا المنشور منهجية لتعديل وتطوير باراميكسوفيروسيس للعلاج المناعي السرطان المستهدفة، وعلى وجه التحديد، فيروسات الحصبة أونكوليتيك ترميز الخلية تي--إشراك أجسام مضادة (الشكل 2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: [س], [ف]، و [م] تشير إلى الأقسام الفرعية المنطبقة على: أوفس العامة، باراميكسوفيروسيس (معظم)، أو أم فقط، على التوالي. [ب] يشير إلى أقسام محددة المتسلسلات وسيمان.

1 استنساخ المتسلسلات Immunomodulator-ترميز إلى نواقل فيروس الحصبة

  1. [س] تصميم إدراج تسلسل.
    1. [س] يقرر في إيمونومودولاتور فائدة استناداً إلى بحوث الأدب أو البيانات الاستكشافية مثل شاشات الجينية41 وتستمد تسلسل كدنا ذات الصلة من قواعد البيانات المناسبة مثل بنك الجينات، "الأرشيف النوكليوتيدات الأوروبية"، أو إيمونوجينيتيكس معلومات النظام الدولي (إيمجت).
    2. [س] إضافة ميزات إضافية لتسلسل التحوير (الشكل 3). السابقة كوزاك التسلسل وإبلاغها كودون الأمثل يمكن أن تعزز التعبير. تسلسل إشارة ضرورية لإفراز. وتشمل سلاسل ترميز العلامات البروتين N-و/أو ج--المحطة الطرفية ل الكشف وتنقية42. وتشمل مواقع التقييد للإدراج داخل المتجهة.
      ملاحظة: [م] بدء النسخ إضافية وحدات (أتوس) إيواء MV بوليميريز الجينات وإشارات التوقف ضرورية للتعبير التحوير من المؤتلف MV الجينوم. ناقلات كدنا المضادة الجينوم مناسبة، تسيطر عليها المروجين CMV والمحتوية على عطاس مع مواقع قيود فريدة من نوعها للأخذ المتسلسلات شعور إيجابي في مواقف محددة، وقد وضعت سابقا11. [ف] كافية لتحديد المواقع من التحوير أمر حاسم، كما أنه يؤثر على التعبير الفيروسية النسخ المتماثل والتحوير بسبب التدرج التعبير النموذجي باراميكسوفيروسيس43. مقدمة إلى أتو ما يقرب من 3 ' نهاية الجينوم لمكافحة (أي.، في موقف زعيم أو المصب من الجينات ف ) يؤدي عادة في التعبير التحوير عالية على حساب انخفاض النسخ المتماثل الفيروسية. يمكن توقع زيادة النسخ المتماثل ومستويات أدنى من التعبير التحوير عند استخدام ATU المصب من الجينات ح . التعبئة والتغليف لجينوم باراميكسوفيروسيس عدة، بما في ذلك فيروس الحصبة، يتطلب ربط النيوكليوتيدات ستة من كل بروتين nucleocapsid44. لإدراج المتسلسلات في مثل هذه الفيروسات، ضمان أن القسمة على ستة عدد النيوكليوتيدات الجينوم الكامل. وهذا أيضا يشار إلى "قاعدة لستة"45،46. إذا لزم الأمر، وتشمل النيوكليوتيدات إضافية في الإدراج (المنبع للتسلسل كوزاك أو المتلقين للمعلومات من كودون التوقف) دون إدخال تحولات الإطار أو codons توقف سابق لأوانه. [م] تجنب تسلسل خاصة في التحوير التي تشبه MV الجينات ابدأ (أجرنكمارجو) ووقف إشارات (رتاوانااا)، والجيش الملكي النيبالي تحرير متواليات (آآآآجج). وقد نشرت هذه التسلسلات توافق الآراء (انظر مثلاً، المتنزهات et al.47).
    3. [س] شراء اليغنوكليوتيد التسلسل المطلوب أو التجمع من تسلسل متوفرة باستخدام معيار الاستنساخ الجزيئي48.
      ملاحظة: [س] على [بكر] تضخيم للتحوير، تصميم تمهيدي إلى الأمام بما في ذلك موقع تقييد المنبع والنيوكليوتيدات 15-20 أول الإدراج وعكس تمهيدي بما في ذلك آخر النيوكليوتيدات 15-20 من الإدراج متبوعاً بتقييد المتلقين للمعلومات الموقع.
  2. [س] تضاف استنساخ الحمض النووي ترميز الجينوم الفيروسي (مضادات).
    1. [س] استنساخ الإدراج في ناقلات الحمض النووي أو جينوم الحمض النووي لمكافحة فيروسات الرنا بمعيار الجزيئية استنساخ تقنيات48 (أي، الانزيمية تقييد متبوعاً بربط الحمض النووي).
      1. [س] منع إعادة ربط ناقل باستخدام مواقع التقييد غير المتوافقة أو عن طريق الفسفرة دي قبل ربط.
      2. [س] عزل المنتج ربط [اغروس] هلام التفريد وتنقية جل اللاحقة باستخدام أدوات متوفرة تجارياً. بشكل عام، هو تحقيق الكفاءة المثلى ربط بنسبة 3:1 مولى لإدراج لناقلات.
    2. [س] تحويل ربط المنتج في البكتيريا المختصة مناسبة لاستعادة كفاءة والبلازميدات كبير (أي، إجراء صدمة الحرارة كولاي49) وتحديد استنساخ البكتيرية إيواء الحمض النووي الصحيح بمستعمرة بكر50 .
    3. [س] عزل تضخيم الحمض النووي من استنساخ بكتيرية مفرد باستخدام الحمض النووي المتاحة تجارياً إعداد مجموعات. تأكيد سلامة الجينوم من خلاصة التحكم مع إنزيمات التقييد الملائمة (مثل، هنديي للجينوم MV [م]). تأكيد الإدراج الصحيح وسلامته التحوير بالتسلسل.
      ملاحظة: [م] المتسلسلات إدراجها في حأم-وحدة مكافحة الإرهاب، أداء سانغر التسلسل مع الإشعال التالية: H-9018 [التمهيدي إلى الأمام، يربط MV الجينوم الموقف 9018 في ح فتح قراءة الإطار (ORF)]: جتجتجكتجكجاكتكاجاتك 5 '3'؛ لام-9249 + (عكس التمهيدي، يربط إلى موقف الجينوم MV 9249 في L ORF): كاجاتاجكجاجتككاتاكج 3 '5'.

2-إنقاذ جسيمات فيروس الحصبة المؤتلف الترميز إيمونومودولاتورس

  1. [س] توليد جزيئات الفيروس المؤتلف من (مضادات) المجينية الحمض النووي عن طريق تعداء الخلايا المنتجة الفيروس وفقا لبروتوكول قياسي للفيروس كل منهما. اتبع المبادئ التوجيهية للعمل تحت ظروف معقمة. أداء الثقافة الخلية تحت أغطية، لا سيما جميع الخطوات المتعلقة بالفيروس في الفئة الثانية خزانات السلامة البيولوجية.
    1. [م] لإنقاذ فيروسات الحصبة من كدنا23،24، لوحة أم منتج (القرد الأخضر الأفريقي الكلي المستمدة من فيرو) الخلايا بالتساوي على لوحة 6-جيدا 24 ساعة قبل تعداء. الخلايا البذور 2 × 105 2 مل المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) الواحدة وكذلك لتحقيق كونفلوينسي 65 – 75% في وقت تعداء.
      ملاحظة: [ف] تخفيض أرقام الخلية إذا كسا الخلايا قبل تشكيل الناجمة عن فيروس سينسيتيا.
    2. [ف] ترانسفيكت الخلايا مع الحمض النووي ترميز والبلازميدات مساعد الجينوم المضادة، مطلوب الفيروسية، وإذا رغبت في ذلك، بلازميد ترميز مراسل فلورسنت لتقييم كفاءة تعداء.
      1. [م] ميكروغرام 5 مزيج من الحمض النووي المؤتلف ترميز الجينوم المضادة فيروس الحصبة، 500 نانوغرام كل من التعبير الثدييات والبلازميدات ترميز فيروس الحصبة N و L البروتينات، و 100 نانوغرام كل من البلازميدات ترميز البروتين ف ومراسل فلورسنت في إجمالي حجم 200 ميليلتر دميم.
      2. إضافة ميليلتر 18.6 من كاشف تعداء الاسمافرون ومزيج فورا بالتحريك الأنبوب واحتضان لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      3. [ف] استبدال المتوسط 1.8 مل دميم، 2% FBS، 50 ميكروغرام/مل كاناميسين (أو المضادات الحيوية الأخرى لمنع التلوث) الواحد جيدا، ثم إضافة مزيج تعداء dropwise إلى البئر ودوامه بعناية. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. استبدال متوسطة مع 2 مل دميم الطازجة، 2% FBS وكاناميسين 50 ميكروغرام/مل في اليوم التالي؛ كرر هذه العملية عندما يصبح المتوسطة الحمضية.
        تنبيه: [س] التعامل مع الخلايا والمواد وفقا للوائح السلامة الأحيائية، قد يكون الفيروس موجوداً من تعداء من خلال الخطوات التالية. التخلص من النفايات المعدية (احتمال) على نحو ملائم.
  2. [ف] جمع ونشر جزيئات الفيروس.
    1. [ف] مراقبة الخلايا يوميا بالفحص المجهري لمراسل الجينات التعبير وسينسيتيا تشكيل (الشكل 4). حصاد الفيروس عند سينسيتيا الكبيرة، تتألف من خلايا 20 أو أكثر، تكون مرئية، أو عندما تصبح الخلايا كثيفة جداً (أي.، عندما تبدأ تنمو في طبقات متعددة، عادة بعد أيام 7 – 9).
      ملاحظة: [ف] إذا سينسيتيا لا ملاحظة بالنسبة لبناء ناقلات معين، هذا لا يعني بالضرورة أن الإنقاذ فشلت. ومع ذلك قد تكون الفيروسات المعدية الموجودة في العينة، نقل إلى خلايا جديدة منتجة باساجينج.
    2. [ف] البذور حوالي 1.5 × 106 إنتاج الخلايا في 12 مل دميم مع 10% FBS, في 10 سم أطباق ح 24 قبل موسم الحصاد المتوقع، أو 2.5 × 106 خلايا كل لوحة ح 4 – 6 قبل باساجينج الفيروس إلى تحقيق كونفلوينسي 65-75% في وقت إينوكولات الفيروس أيون.
    3. [ف] لجمع ذرية الفيروس، كشط الخلايا المنتجة ملتصقة من لوحة باستخدام مكشطة خلية بعناية ونقل المادة طافية التي تحتوي على خلايا في أنبوب الطرد مركزي. إزالة الحطام خلية بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2,500 س ز و 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن نقل الخلايا كشط مباشرة دون استخدام الطرد المركزي إلى أقصى حد المرحل الفيروس على حساب شروط الثقافة دون المستوى الأمثل والتحف مجهرية المحتملة.
      تنبيه: [س] تجنب تسرب وسائل الإعلام عند كشط الخلايا. تقليل تكوين الهباء الجوي.
    4. [ف] تعد العدوى عن طريق خلط المادة طافية الخلية خالية من الخطوة 2.2.3 مع المتوسط خالية من المصل لوحدة تخزين نهائي 4 مل. استبدال المتوسطة على الخلايا المنتجة بالعدوى واحتضان خلايا على الأقل 2 ح في 37 درجة مئوية و 5% CO2. إضافة 6 مل دميم مع 10% FBS واحتضان خلايا بين عشية وضحاها قبل تغيير في المتوسط إلى 12 مل دميم الطازجة مع 10% FBS.
    5. [ف] مراقبة الخلايا على الأقل مرتين يوميا والحصاد الفيروس قبل انفجار سينسيتيا (أي، عند انقطاع الغشاء يصبح مرئياً). حصاد أول مرور الفيروسات، إزالة المادة طافية من اللوحة وإضافة 600 ميليلتر من المتوسط خالية من المصل وكشط الخلايا مع رافعة خلية ونقل إلى أنبوب نظيفة.
      ملاحظة: [م] اعتماداً على الفيروس سلالة51،52 وتطور العدوى، نقل لوحات مع الخلايا المصابة إلى 32 درجة مئوية لتسهيل النسخ المتماثل الفيروسية وانتشار. وبوجه عام، تنتشر سلالات شفارتز MV جيدا في 37 درجة مئوية، في حين نقل الخلايا المصابة بفيروسات السلالة ب وادمونستون لنتائج 32 درجة مئوية في تشكيل سينسيتيا أبطأ ولكن التتر أعلى.
      ملاحظة: [ف] لا تسمح طبقة الخلايا الجافة أثناء موسم الحصاد، كهذا سيؤدي إلى انخفاض العدوى الفيروسية الجسيمات. على الرغم من أن بعض الفيروسات يتم فقدان عند التخلص من المادة طافية الخلايا المصابة، يمكن الحصول على التتر أعلى من طبقة الخلايا.
    6. [ف] فورا تجميد وقف الفيروسات في نيتروجين سائل. تجميد مخزن في-80 درجة مئوية على الأقل 24 ساعة لضمان شامل. تمتد إلى عدة أيام لمقاطعة الإجراء، إذا لزم الأمر.
    7. الإفراج عن الجسيمات الفيروسية بذوبان الجليد في 37 درجة مئوية. مجانسة فورتيكسينج، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2,500 س ز و 4 درجة مئوية. نقل سوبيرناتانتس المسمى كريوتوبيس ومخزن في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: [س] تخزين فيروسات في الكوة أحجام كافية لتجارب لاحقة، كما أنها ترتبط بشكل تفضيلي مذاب مرة واحدة فقط واستخدامها على الفور. [ف] كذلك تجميد أذاب دورات أو التخزين في 4 درجات مئوية على مدى عدة أيام نتيجة خفض كبير في التتر الفيروسية.
    8. [ف] يوما ما قبل باساجينج أخرى لتحقيق المبلغ المطلوب وعيار، البذور 4 × 106 إنتاج الخلايا في 12 مل دميم مع 10% FBS على الأطباق 15 سم. تطعيم فيروس في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 0.03. تصيب في 8 مل متوسط خالية من المصل للوحة الواحدة وتغيير المتوسطة دميم مع 10% FBS بعد حضانة الخلايا على الأقل 2 حاء مقياس أعلى باستخدام لوحات متعددة.
    9. الحصاد كما هو موضح في الخطوة 2.2.5، عندما انتشرت سينسيتيا عبر طبقة خلية كاملة. تجمع المعلقات التي تم الحصول عليها في أنابيب 50 مل والعملية كما هو موضح في الخطوات 2.2.6–2.2.7.
      ملاحظة: [س] من الأهمية بمكان لفحص جميع لوحات بصريا للتلوث الجرثومي والفطرية قبل الحصاد. وبصفة عامة، التحقق من جميع خطوط الخلايا بانتظام للتلوث مع مفطورة أو فيروسات العارض ببكر متعدد.
  3. التتر الفيروسية تقييم [ف]. تحديد التتر مخزون فيروس في أوكتوبليكاتيس الواحدة وقاسمه استخدام لوحات 96-جيدا. إجراء المعايرة لمختبرين الفردية الثلاث الواحدة الإنقاذ الفيروس واستخدام متوسط القيمة لحساب كمية الفيروسات تعليق لاستخدامها في التجارب.
    1. [ف] بركة المنتج الخلايا، العد، وضبط إلى 1.5 × 105 خلايا كل مل في دميم مع 10% FBS.
    2. [ف] بيبيت 90 ميليلتر من دميم مع 10% FBS في كل من لوحة 96-جيدا جيدا.
    3. [ف] إضافة 10 ميليلتر من قاسمة واحد من مخزون الفيروس لجميع الآبار 8 في العمود الأول من اللوحة ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً على الأقل 10 مرات.
    4. [ف] إجراء تخفيف إذ المسلسل من الفيروس. نقل 10 ميليلتر لكل بئر من الأول من العمود الثاني باستخدام بيبيت الأقنية. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واستخدم التلميحات بيبيت الطازجة لكل خطوة من خطوات تمييع. تجاهل 10 ميليلتر من كل بئر من العمود الأخير.
      ملاحظة: كل لوحة 96-جيدا يسمح 12 المسلسل تمييع الخطوات. [م] لناقلات السيارات، 8 خطوات لتخفيف إذ تكفي عادة، كالتتر أعلاه 1 × 109 خلية المعدية الوحدات/mL (سو) هي نادراً ما تم الحصول عليها بطريقة لإكثار هو موضح في الخطوة 2، 2. [ف] يمكن استخدام الآبار تحكم دون الفيروس للمقارنة ورصد التلوث.
    5. [ف] إضافة 100 ميليلتر من تعليق خلية لكل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية، 5% CO2 له 48. التأكد من عدم وجود كتل الخلية في التعليق لتحقيق توزيع متجانس للخلايا.
    6. [ف] التحقق من سينسيتيا استخدام مجهر ضوء. عد سينسيتيا في كل بئر من العمود مع عامل إضعاف أعلى المحتوية على سينسيتيا مرئية.
    7. [ف] حساب متوسط عدد سينسيتيا كل بئر في ذلك العمود بقسمة مجموع عدد سينسيتيا ثمانية. مضاعفة هذا المعدل مع عامل تخفيف للعمود الخاصة بكل منها، ابتداء من الساعة 102 سو كل مل ل العمود الأول53 (انظر الشكل 5 على سبيل مثال).

3-تحديد قدرات ريبليكاتيفي والسامة للخلايا من النواقل الفيروسية الترميز إيمونومودولاتورس

  1. [س] قارن حركية النسخ المتماثل الفيروس المؤتلف الذي تم إنشاؤه وناقل غير معدلة مع منحنيات النمو في خطوة واحدة أو متعددة الخطوات (الرابطة). للرابطة في خطوة واحدة، ويتم تقييم ذرية فيروسية عقب العدوى المتزامنة لكافة الخلايا (نظرياً، الإصابة بنسبة 100%). متعدد خطوة الرابطة ابدأ على نسبة منخفضة من الخلايا المصابة باتباع عدة جولات من فيروس النسخ المتماثل.
    1. [م] لتحليل حركية النسخ المتماثل فيروس الحصبة، البذور 1 x 10 خلايا فيرو5 في 1 مل دميم مع 10% FBS كل بئر على لوحات 12-جيدا قبل الإصابة بيوم واحد. لوحة الآبار اثنين على الأقل لكل تيميبوينت من الفائدة ك replicates التقنية.
    2. [س] تصيب الخلايا مع الفيروس في وزارة الداخلية منخفضة لخطوة متعددة أو في وزارة الداخلية عالية للحركة خطوة واحدة [م] (0.03 و 3 للنسخ المتماثل أم على فيرو الخلايا، على التوالي). استبدال المتوسطة مع 300 ميليلتر من المتوسط خالية من المصل يحتوي على مقدار كل منها فيروس واحتضانها في 37 درجة مئوية و 5% CO2 على الأقل 2 حاء إزالة العدوى، إضافة 1 مل دميم مع 10% FBS، وتستمر الحضانة.
    3. [ع] في تيميبوينتس ذات الصلة مثل 12، 24، 36، 48، 72 و 96 ساعة بعد الإصابة، حصاد ذرية الفيروسية بإلغاء الخلايا مباشرة في المتوسط. نقل المحتويات من كل بئر لأنبوب فردية والمفاجئة-التجميد في النيتروجين السائل وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى المعايرة.
      ملاحظة: [ف] يجوز تجميع عينات تكرار في هذه الخطوة من أجل تحليل متوسط التتر.
    4. [ف] جمع عينات من جميع تيميبوينتس. ذوبان الجليد في وقت واحد في 37 درجة مئوية للتقييم لذرية الفيروسية. دوامة وبيليه الحطام خلية بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2,500 س ز و 4 درجة مئوية.
    5. [ف] حساب متوسط التتر كل بناء وتيميبوينت كما هو موضح أعلاه. ارسم التتر على مر الزمن. مقارنة منحنيات النمو من ناقلات مع أو بدون المتسلسلات المدرج، مع المتسلسلات مختلفة أو المتسلسلات إدراجها في مواقع مختلفة (انظر الشكل 6A).
  2. [س] قارن الحال أنشطة الفيروسات ترميز إيمونومودولاتور وغير معدلة.
    1. [س] حدد من المنهجيات الممكنة بما في ذلك قياسات مقاومة، نازعة لاكتات (رابطة حقوق الإنسان) الإفراج عن المقايسة، أو بقاء الخلية اللونية على أساس التمثيل الغذائي فحوصات [مثل، 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT ) وفحوصات 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (إكستت)].
      1. [م] لتحليل سيتوتوكسيسيتي الحصبة نواقل الفيروسات باستخدام XTT الاعتداء، البذور فيرو الخلايا كما هو موضح في الخطوة 3.1.1. وتشمل replicates عنصر التحكم غير مصابة لكل تيميبوينت.
        ملاحظة: [س] أداء الفحص إكستت في تيميبوينتس مختلفة على نفس العينة يمكن أن تحد من الأخطاء التقنية، ولكن الغسيل المتكرر والتعرض لكاشف إكستت يؤثر على عدد خلايا قابلة للحياة. يوفر مقاومة قراءات بديلة لقياسات مستمرة.
    2. [م] تصيب الخلايا فيرو وزارة الداخلية من 1 كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.
      ملاحظة: [م] لعدوى خلايا المستهدفة أقل الدلالية مثل بعض خطوط الخلايا السرطانية مورين، قد يلزم موي أعلى 3 أو 5.
    3. [س] في تيميبوينتس للفائدة (على سبيل المثال.، 12، 24، 36، 48، 72 و 96 ساعة بعد الإصابة) تحضير الكمية المطلوبة من كاشف إكستت (أي.، 300 ميليلتر كل بئر بالإضافة إلى 10% الزائدة). تجنب التعرض للضوء.
    4. [م] وفي كل تيميبوينت، إزالة المتوسطة من الآبار الخاصة بكل منها. استبدال من 300 ميليلتر من كاشف إكستت واحتضان في 37 درجة مئوية في الظلام. جمع supernatants عند الكاشف في آبار المراقبة تحولت الأحمر العميق، والذي عادة ما يستغرق ما بين 15 دقيقة و 2 حاء، وتجميد في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: [س] أوقات الحضانة تعتمد على بنية الفيروس ونوع الخلية والكثافة وتأثير سيتوباثيك.
    5. [س] بعد جمع جميع العينات، ذوبان الجليد في وقت واحد. نقل 100 ميليلتر من كل عينة إلى لوحة 96-جيدا وقياس امتصاص الضوئية في 450 نانومتر، مع 630 نيوتن متر كطول موجه إشارة.
    6. [س] الأرض مقابل. تيميبوينتس (س) امتصاص بصري من العينات بالنسبة لعناصر التحكم، مما يشير إلى النشاط الأيضي كبديل لبقاء الخلية المحور (ص). انخفاض امتصاص النسبي مع مرور الوقت يعني سيتوتوكسيسيتي الفيروسية (انظر الشكل 6ب).

4-تحليل نشاط الفيروس ترميز إيمونومودولاتورس ويفرز من الخلايا المصابة

  1. [س] عزل التحوير يفرز المنتجات أعرب عن طريق الخلايا المصابة بالفيروسات المستهدفة.
    1. [ف] تتيح إنتاج الفيروس الخلايا تنمو إلى كونفلوينسي 70% في قوارير T175.
    2. [ف] إزالة المتوسطة من الخلايا، وتغسل مرتين مع 12 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة المصل. تلقيح خلايا مع الفيروس في وزارة الداخلية مل 0.03 في 12 من المتوسط خالية من المصل واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 بين عشية وضحاها. استبدال المتوسطة مع 12 مل متوسطة جديدة خالية من المصل.
      1. [م] للبحث عن الفيروسات ب وادمونستون، نقل الخلايا من 37 إلى 32 درجة مئوية بعد 40 ساعة لآخر 24 ساعة من الحضانة تيسير العدوى ومنع انفجار سابق لأوانه من سينسيتيا. اعتماداً على سلالة الفيروس يمكن تعديل التدرج52 وسينسيتيا51،ودرجات حرارة الحضانة ومرات للعائد الأمثل من البروتين والنقاء.
    3. [ف] بعناية جمع supernatants دون فصل الخلايا قبل انفجار سينسيتيا. على النحو الأمثل، وقد انتشرت سينسيتيا عبر طبقة الخلية بأكملها. تجمع سوبيرناتانتس في أنابيب 50 مل.
      ملاحظة: [ف] لكفاءة تنقية المنتج التحوير، تجنب انفجار سينسيتيا وتقليل الحطام خلية عند الحصاد supernatants الخلايا المصابة.
    4. [ف] إزالة الحطام الخلية من المادة طافية بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2,500 س ز و 4 درجات مئوية ويمر من خلال 0.22 ميكرون المرشحات. اعتماداً على الحجم الإجمالي فيلتراتي، وهذا يمكن أن يؤديها باستخدام المحاقن أو فراغ مضخة.
    5. [س] عزل التحوير المنتج باستخدام أسلوب تنقية مناسبة. تنقية البروتينات مع علامة سداسي-الحامض الأميني (بلده) التي تقارب تبادل اللوني باستخدام ني-جاتا تدور ميني الأعمدة38 كما هو موضح هنا بإيجاز (الخطوات 4.1.5.1–4.1.5.4).
      ملاحظة: [س] القيام بكافة الخطوات سريعة وعلى الجليد. قبل chill المخازن المؤقتة وباردة قبل الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
      1. [س] تحضير 100 مل من المخزن المؤقت مع برنامج تلفزيوني وكلوريد الصوديوم 200 ملم وايميدازول تركيزات النهائي 10 مم (العازلة الغسيل 1, WB1)، 20 (غسل العازلة 2، WB2)، و 500 ملم (شطف المخزن المؤقت، والمجلس التنفيذي). ضبط الأس الهيدروجيني WB1 و WB2 إلى 8.0 ومن المجلس التنفيذي إلى الإصدار 7.0. اعتماداً على البروتين يكون تنقيته، قد تركيزات ايميدازول تعديلها.
      2. [س] حجته الأعمدة مع 600 ميليلتر WB1 وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 2 دقيقة مع غطاء مفتوحة.
      3. [س] تحميل 600 ميليلتر من سوبيرناتانتس التي تمت تصفيتها على أعمدة. تسمح ملزم البروتينات صاحب معلم لمصفوفة العمود باستخدام الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق مع غطاء مغلق. يمكن أن تتكرر تحميل وربط ما يصل إلى ما مجموعة 300 ميكروغرام البروتين صاحب معلم لكل عمود.
      4. [س] يغسل ثلاث مرات مع WB1 ومرة مع WB2، أو حتى التدفق من خلال عديم اللون. إضافة 600 ميليلتر من المخزن المؤقت وتدور في 800 x ز لمدة 2 دقيقة مع فتح الغطاء.
      5. [س] الوت البروتين في أنبوب جديد عن طريق إجراء خطوتين شطف مع 300 ميليلتر من المجلس التنفيذي والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 x ز.
      6. [س] تحلية وتركيز المنتج باستخدام مرشحات الطرد المركزي طبقاً لحجم المنتج. إضافة برنامج تلفزيوني إلى حجم 15 مل والتصفية عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في س 4,000 ز. كرر حتى نقاء المنشود وهو تحقيق تركيز. لزيادة تركيز البروتين، تقليص حجم النهائي إلى حوالي 200 ميليلتر بالطرد المركزي لمدة 40 دقيقة في س 4,000 ز.
  2. [س] تأكيد هوية المنتج والنقاء.
    1. [س] تحديد مقدار البروتين الكلي في يعزل استخدام فحوصات قياس الألوان القياسية مثل حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) أو برادفورد المقايسة54،55. [م] يمكن أن تتراوح قيم نموذجية من 1 – 3 من الناتج التحوير ميكروغرام مل المادة طافية من الخلايا المصابة.
    2. [س] للقياس الكمي النسبي يعزل البروتين، منفصلة عن طريق الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وأداء أخذ تلطيخ56.
    3. [س] تأكيد هوية المنتجات النقية بواسطة immunoblotting استخدام أجسام مضادة محددة تستهدف البروتين أو علامة ببتيد المرتبط57.
    4. [س] تحليل خصوصية ملزمة البروتين باستخدام التقنيات المناسبة التي قد تشمل المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA) أو التدفق الخلوي (انظر الشكل 7). يمكن تأكيد ربط الخلية باستخدام مقايسة المنسدلة مغناطيسي وصف مؤخرا38.
      ملاحظة: [س] استخدام عناصر التحكم المناسبة. في الخلية فحوصات ملزمة، تشمل عناصر سلبية مع الخلايا التي لم تعرب عن الجزيء المستهدف (كما هو الحال في الشكل 9) وعدم استهداف البروتين الأمهات البديلات (الشكل 8). في التدفق الخلوي التجارب، تشمل الإيجابية، السلبية وايستب عناصر التحكم (الشكل 7).
      1. [س] شاركت في احتضان الهدف عزل الخلايا والبروتين للسماح للربط. [ب] لربط تحليل بتس إلى الدم المحيطي احتضان الخلايا وحيدات النوى (ببمكس) المعزولة من الدم البشري58، 2.5 × 106 خلايا مع 200 نانوغرام وسيمان في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 1% FBS (ربط المخزن المؤقت, BB) ح 1 على الجليد.
      2. [ب] يغسل خلايا مع 1 مل BB إزالة البروتين غير منضم. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من BB. إضافة جسم بيوتينيلاتيد استهداف بروتين الفائدة أو علامة ببتيد المرتبط واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. بتس مع العلامة إنفلونزا هيماغلوتينين (ها)، استخدام 100 نانوغرام لمكافحة--هكتار-البيوتين (استنساخ 3F10).
      3. [ب] يغسل خلايا مرتين مع 1 مل BB وريسوسبيند في ميليلتر 80 من BB. إضافة 20 ميليلتر من ستريبتافيدين-إلى جانب ميكروبيدس المغناطيسي واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      4. [ب] يغسل مرة واحدة إزالة الزائدة الخرز وريسوسبيند بيليه في 500 ميليلتر من BB وتستكمل مع 2 مم يدتا (العمود المخزن المؤقت، وبناء القدرات).
      5. [ب] عزل الخلايا التي تحتوي على أعمدة وموقفا مغناطيسي وفقا للدليل الخاص بموفر.
        1. [ب] حجته بالسماح 500 ميليلتر لبناء القدرات لتمرير من خلال العمود بتدفق الجاذبية.
          ملاحظة: [ب] العمود يجب أن تجف ابدأ. بيبيت بعناية وديغا المخازن المؤقتة لتجنب الفقاعات.
        2. [ب] وضع أنبوب نظيفة تحت العمود وتطبيق تعليق خلية/حبة للعمود. أغسل العمود ثلاث مرات مع 500 ميليلتر لبناء القدرات للمياه والصرف الصحي. جمع عينات التدفق من خلال التعليق، وعلى الأقل الخطوة الأولى للغسيل الأنبوب، ثم تخزين على الجليد.
        3. [ب] الوت حبة ربط الخلايا الاحتفاظ بالمجال المغناطيسي. وتحقيقا لهذه الغاية، إزالة العمود من موقف المغناطيسية ووضعه عبر أنبوب نظيف وإضافة 1 مل من بناء القدرات ودفع المخزن المؤقت من خلال العمود بسرعة في أنبوب استخدام المكبس. الاحتفاظ بالانبوب على الجليد.
      6. [ب] أجهزة الطرد المركزي أنابيب تحتوي على عينات من خلال تدفق وشطف لمدة 20 دقيقة في 16,000 س ز و 4 درجة مئوية بيليه الخلايا. تجاهل سوبيرناتانتس والخلايا الموجودة في المخزن مؤقت مقايسة (RIPA) راديويمونوبريسيبيتيشن (المقترح: 75 ميليلتر). أداء الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة56.
      7. [ب] أداء immunoblotting استخدام جسم أساسي مناسب. الأجسام المضادة قد تستهدف المنتج التحوير أو بروتين خلوي (على سبيل المثال.، β-أكتين، الشكل 8) لتقييم ملزمة خلية وسيمان.
  3. [س] تقييم الوظائف المناعية من إيمونومودولاتورس معزولة.
    1. [س] تحديد الاختبارات ذات الصلة وفقا لخصائص immunomodulator المرمزة. فيما يتعلق بالنشاط immunomodulatory المتوقعة، وأساليب تقييم انتشار الخلايا، الهجرة، والنضج، والتنشيط، أو سيتوتوكسيسيتي يجوز تطبيق.
      ملاحظة: [س] يمكن تحليل انتشار الخلايا بوصفها59 كفسي أو Ki67 المصبوغة60. تجارب ترانسويل أو نقطة الصفر المتوفرة لتحليل الخلية الهجرة61. نضج وتنشيط الخلايا يمكن تقييم استخدام البروتوكولات المصبوغة المناسبة للعلامات الخاصة بكل منها. [ب] تشمل التقنيات المتاحة لتقييم سيتوتوكسيسيتي الخلوية وسيمان بوساطة معاوقة القياسات والكروم الإصدار المقايسة. إذا كان اختيار فحص الإصدار الكروم، مراعاة تدابير السلامة المناسبة عند التعامل مع المواد المشعة.
    2. [ب] كبديل غير مشعة، فيما يلي وصف بالتفصيل كيفية تقييم سيتوتوكسيسيتي التي يسببها وسيمان، والخلية بوساطة من رابطة حقوق الإنسان الإفراج الإنزيم (الموصوفة سابقا في موجز38).
      1. [ب] اتخاذ قرار بشأن الشروط لفحصها خلال التجربة (انظر الشكل 9 على سبيل مثال). تيميبوينتس تركيزات (ساعات إلى أيام)، إيمونومودولاتور (pg/mL إلى ميكروغرام/مل)، ويمكن أن تختلف المستجيب لنسب الخلية (E:T) الهدف (بين 01:50 و 50: 1، على سبيل المثال). دائماً إعداد العينات في تريبليكاتيس.
      2. [ب] تدرج عينات دون البروتين والإفراج عن أنواع خلية مفردة (تيس وهس)، على ضوابط لرابطة حقوق الإنسان العفوي دون خلايا المستجيب، خلية تفسخ أقصى عنصر تحكم هدف (Tmax) مع المنظفات المضافة قبل قراءات، متوسطة فقط عنصر التحكم، وتحكم في مستوى الصوت لطنكحد أقصى.
        ملاحظة: [ب] يمكن أن تختلف أرقام المطلوب من الخلايا المستهدفة وأوقات الاحتضان. إجراء تشغيل الاختبار الأولية دون خلايا المستجيب وإيمونومودولاتورس لتحديد معلمات الأمثل. وتشمل تيس وعينات تيماكس وعناصر التحكم المقابلة لتقييم إعداد مختلفة من الخلايا وتيميبوينتس.
      3. [ب] عزل الخلايا المناعية المستجيب مثلاً عن طريق (الطرد المركزي التدرج الكثافة من الدم البشري للحصول على ببمكس58 ) أو الانتقاء السلبي من خلايا تي مورين من الماوس سبلينوسيتيس62.
      4. [ب] البذور استهداف الخلايا وفقا للخطوة 4.3.2 (مثل، 5 × 10 كل بئر) في لوحة 96 يو-أسفل بئر.
      5. [ب] إضافة البروتين المعزولة في التركيزات المطلوبة للعينات الخاصة بكل منها. إضافة الخلايا المناعية المستجيب في نسب المطلوبة. إضافة المتوسطة إلى إجمالي حجم 100 ميليلتر كل بئر.
      6. إينكوباتي [ب] لتحديد الإطار الزمني في الخطوة 4.3.2، عادة ما بين 4 و 48 ساعة (24 ح ببمكس أونستيمولاتيد وح 48 للخلايا T مورين طازجة معزولة؛ أوقات حضانة أقصر يمكن تطبيق للخلايا المناعية بريستيمولاتيد)، في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
      7. [ب] 45 دقيقة قبل جمع العينات، إضافة 10 ميليلتر من حل تحلل x 10 إلى الآبار التي تحتوي على عينات تيماكس وعناصر التحكم المتوسطة المقابلة. تستمر الحضانة.
      8. [ب] تدور أسفل الخلايا في 250 x ز لدقيقة 4 نقل 50 ميليلتر من كل المادة طافية على لوحة مسطحة القاع 96-جيدا. لا يتم تحويل الخلايا تجنب ربط الخلية رابطة حقوق الإنسان.
      9. [ب] إعداد الحل الركيزة وفقا للشركة المصنعة. إضافة 50 ميليلتر لكل بئر واحتضان في RT في الظلام لمدة 30 دقيقة، أو حتى تشغيل عينات تيماكس الأحمر العميق.
      10. [ب] إضافة 50 ميليلتر من إيقاف الحل لكل بئر. إزالة فقاعات الهواء بالطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في س 4,000 ز، ويدويًا بإبرة جوفاء. قياس امتصاص الضوئية في 490 نانومتر.
      11. [ب] حساب قيم محددة تحلل % لكل عينة.
        1. [ب] حساب المتوسطات ل replicates الضوابط متوسطة مع أو بدون حل تحلل. طرح القيم التي تم الحصول عليها من عينات تجريبية ومن تيماكس وضوابط الإفراج عفوية، على التوالي. استخدم هذه القيم الأساسية لتصحيح لمزيد من العمليات الحسابية.
        2. [ب] حساب المتوسطات لتصحيح الخلفية تيماكستيسوهس الضوابط. باستخدام هذه القيم المتوسطة، تؤدي المعادلة التالية النسبة المئوية لتحلل محددة لكل عينة:

          figure-protocol-1
        3. [ب] الأرض نسبة E:T أو قيم محددة تحلل % مقابل تركيز البروتين ومقارنة لعينات مراقبة عدم استهداف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 1 إليه عمل لفيروسات الحصبة أونكوليتيك ترميز engagers خلية T بيسبيسيفيك. ويرد في الشكل 2مخطط انسيابي تصور سير العمل لهذا البروتوكول. ويبين الشكل 3 مثالاً جينوم فيروس الحصبة أونكوليتيك المعدلة. وهذا يوفر تمثيل مرئي من التغييرات المحددة المطبقة على فيروس الحصبة ميزات المضادة الجينوم وخاصة من المتسلسلات المدرج. سينسيتيا التي يسببها فيروس الحصبة نموذجي يصور في

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أونكوليتيك المناعي (أي.، عفت في تركيبة مع المرباة) يحمل وعدا كبيرا لعلاج السرطان، مطالبين بمواصلة التنمية والتحسين من الفيروسات أونكوليتيك ترميز البروتينات إيمونومودولاتوري. ويصف هذا البروتوكول أساليب إنشاء والتحقق من صحة هذه الناقلات للتجارب اللاحقة في النماذج ذات الصلة الإكلينيكية والمحتملة مستقبلا السريرية ترجمة رواية العلاجات المضادة للسرطان.

هي منصات فيروس أونكوليتيك مختلفة عديدة مع المزايا المميزة المتاحة63. بالإضافة إلى خصوصية السرطان، سلامة ناقلات، متطل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يتم سرد إنجلاند م مخترع المشارك فيروسات الرنا فيما يتعلق براءات الاختراع "سرطان إيممونوفيروثيرابي" مملوكة لجامعة هايدلبرغ. ليس له علاقة بالكشف عن هيدبويتشيل J.P.W..

شكر وتقدير

وأنشئت هذه الأساليب في المجموعة فيروثيرابي يرأسه الأستاذ الدكتور الدكتور غي أونجيريتشتس في المركز الوطني "الأمراض السرطانية" في هايدلبرغ. ونحن مدينون له ولجميع أعضاء فريق المختبر، لا سيما الدكتور توبياس ذرة والدكتور Rūta فينالدي، جوديث فورستر، وغراسي البرقي وألبرت جيسيكا. وأيد هذا العمل قبل آخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ (منحة 2015_A78 أن إنجلاند م) و "المؤسسة الوطنية للعلوم الألمانية" (DFG، منح إنجلاند م EN 1119/2-1). هيدبويتشيل J.P.W. يتلقى راتبا من مدرسة الدراسات العليا الدولية هلمهولتز "بحوث السرطان".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الحمض النووي السريع Dephos & طقم الربطRoche Life Science ، مانهايم ، ألمانيا4898117001
CloneJET PCR SimulatorKit Thermo Fisher Scientific ، St. Leon-RotK1231
AgaroseSigma-Aldrich ، Taufkirchen ، ألمانياA9539-500G
QIAquick Gel ExtractionKit QIAGEN ، هيلدن ، ألمانيا28704
NEB 10-beta المختص E. القولوني< / em>نيو إنجلاند بيولابز (NEB) ، فرانكفورت / ماين ، ألمانياC3019I
LB medium بعد لينوكسكارل روث ، كارلسروه ، ألمانياX964.1
أمبيسلينكارل روث ، كارلسروه ، ألمانياHP62.1
QIAquick Miniprep KitQIAGEN ، هيلدن ، ألمانيا27104
إنزيم التقييد HindIII-HFنيو إنجلاند بيولوجيس (NEB) ، فرانكفورت / ماين ، ألمانياR3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Invitrugen ، دارمشتات ، ألمانيا31966-021
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Biosera ، Boussens ، فرنساFB-1280/500
FugeneHDPromega ، مانهايم ، ألمانيايمكن استبدال E2311بكاشف تعدي مفضل
KanamycinSigma-Aldrich ، Taufkirchen ، ألمانياK0129
Vero cellsATCC ، ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةCCL81
B16-CD46 / B16-CD20-CD46J. Heidbuechel ، DKFZ Heidelbergمتاح عند الطلب
Granta-519DSMZ ، براونشفايغ ، ألمانياACC 342
Opti-MEM (وسيط خال من المصل)Gibco Life Technologies ، دارمشتات ، ألمانيا31985070
خلية قياس الألوان مجموعة الجدوى III (XTT)PromoKine ، هايدلبرغ ، ألمانياPK-CA20-300-1000يتضمن كاشف XTT
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)Gibco Life Technologies ، دارمشتات ، ألمانيا14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin ColumnsQIAGEN ، هيلدن ، ألمانيا31014
كلوريد الصوديومكارل روث ، كارلسروه ، ألمانيا3957.3
ImidazoleCarl Roth, Karlsruhe, ألمانياI5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10  كيلو دي إيهميرك ، دارمشتات ، ألمانياUFC901024
مجموعة فحص البروتين BCAMerck Milipore71285-3
IgG من المصل البشريSigma-Aldrich ، Taufkirchen ، ألمانياI4506
Anti-HA-PEMiltenyi Biotech ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا130-092-257RRID: AB_871939
Mouse IgG1 ، التحكم في النمط المتشافي kappa ، Phycoerythrin Conrupgated ، استنساخ MOPC-21 الأجسام المضادةBD Biosciences ، هايدلبرغ ، ألمانيا555749RRID: AB_396091
الأجسام المضادة المضادة للبيوتين HA ، استنساخ 3F10Sigma-Aldrich ، Taufkirchen ، ألمانيا12158167001RRID: AB_390915
MicroBeads المضادة للبيوتينMiltenyi Biotech ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا130-090-485
MS ColumnsMiltenyi Biotech ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا130-042-201
فاصل MiniMACSMiltenyi Biotech ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotech ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا130-042-303
RIPA bufferRockland Immunochemicals ، جيلبرتسفيل ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةMB-030-0050
CytoTox 96 فحص السمية الخلوية غير المشعةPromega ، مانهايم ، ألمانياG1780يتضمن محلول تحلل 10x ، ومحلول الركيزة (مزيج الركيزة ومخزن الفحص المؤقت) ، وحل
التوقف رافع الخليةCorning ، Reynosa ، المكسيك3008
أطباق 10 سمCorning ، Oneonta ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية430167
أطباق 15 سمGreiner Bio-One ، Frickenhausen ، ألمانيا639160
أطباق 96 بئر ، U-bottomTPP ، Trasadingen ، سويسرا92097
ألواح 96 بئرا ، قاع مسطحNeolab ، هايدلبرغ ، ألمانيا353072
ألواح 6 آبارNeolab ، هايدلبرغ ، ألمانيا353046
ألواح 12 بئراNeolab ، هايدلبرغ ، ألمانيا353043
أنابيب 50 ملnerbe plus ، Winsen / Luhe ، ألمانيا02-572-3001
قوارير ثقافة الخلايا T175Thermo Fisher Scientific ، St. ليون روت159910
0.22 & مرشحاتm Merck ، دارمشتات ، ألمانياSLGPM33RS

المراجع

  1. Lichty, B. D., Breitbach, C. J., Stojdl, D. F., Bell, J. C. Going viral with cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (8), 559-567 (2014).
  2. Cassady, K. A., Haworth, K. B., Jackson, J., Markert, J. M., Cripe, T. P. To Infection and Beyond: The Multi-Pronged Anti-Cancer Mechanisms of Oncolytic Viruses. Viruses. 8 (2), (2016).
  3. Twumasi-Boateng, K., Pettigrew, J. L., Kwok, Y. Y. E., Bell, J. C. Oncolytic viruses as engineering platforms for combination immunotherapy. Nature Reviews Cancer. , (2018).
  4. Achard, C., et al. Lighting a Fire in the Tumor Microenvironment Using Oncolytic Immunotherapy. EBioMedicine. 31, 17-24 (2018).
  5. Kelly, E., Russell, S. J. History of oncolytic viruses: genesis to genetic engineering. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 15 (4), 651-659 (2007).
  6. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nature Biotechnology. 30 (7), 658-670 (2012).
  7. Russell, S. J., Peng, K. W. Oncolytic Virotherapy: A Contest between Apples and Oranges. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (5), 1107-1116 (2017).
  8. Seymour, L. W., Fisher, K. D. Oncolytic viruses: finally delivering. British Journal of Cancer. 114 (4), 357-361 (2016).
  9. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  10. Gao, Q., Park, M. S., Palese, P. Expression of transgenes from newcastle disease virus with a segmented genome. Journal of Virology. 82 (6), 2692-2698 (2008).
  11. Billeter, M. A., Naim, H. Y., Udem, S. A. Reverse genetics of measles virus and resulting multivalent recombinant vaccines: applications of recombinant measles viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 329, 129-162 (2009).
  12. Matveeva, O. V., Guo, Z. S., Shabalina, S. A., Chumakov, P. M. Oncolysis by paramyxoviruses: multiple mechanisms contribute to therapeutic efficiency. Molecular Therapy Oncolytics. 2, (2015).
  13. Suter, S. E., et al. In vitro canine distemper virus infection of canine lymphoid cells: a prelude to oncolytic therapy for lymphoma. Clinical Cancer Research. 11 (4), 1579-1587 (2005).
  14. Ammayappan, A., Russell, S. J., Federspiel, M. J. Recombinant mumps virus as a cancer therapeutic agent. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16019(2016).
  15. Schirrmacher, V. Oncolytic Newcastle disease virus as a prospective anti-cancer therapy. A biologic agent with potential to break therapy resistance. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (12), 1757-1771 (2015).
  16. Saga, K., Kaneda, Y. Oncolytic Sendai virus-based virotherapy for cancer: recent advances. Oncolytic Virotherapy. 4, 141-147 (2015).
  17. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Netesov, S. V., Onikienko, S. B., Chumakov, P. M. Mechanisms of Oncolysis by Paramyxovirus Sendai. Acta Naturae. 7 (2), 6-16 (2015).
  18. Gainey, M. D., Manuse, M. J., Parks, G. D. A hyperfusogenic F protein enhances the oncolytic potency of a paramyxovirus simian virus 5 P/V mutant without compromising sensitivity to type I interferon. Journal of Virology. 82 (19), 9369-9380 (2008).
  19. Engeland, C. E., et al. A Tupaia paramyxovirus vector system for targeting and transgene expression. The Journal of General Virology. 98 (9), 2248-2257 (2017).
  20. Russell, S. J., Peng, K. W. Measles virus for cancer therapy. Current Topics in Microbiology and Immunology. 330, 213-241 (2009).
  21. Aref, S., Bailey, K., Fielding, A. Measles to the Rescue: A Review of Oncolytic Measles Virus. Viruses. 8 (10), (2016).
  22. Demicheli, V., Rivetti, A., Debalini, M. G., Di Pietrantonj, C. Vaccines for measles, mumps and rubella in children. The Cochrane Database of Systematic Reviews. (2), 004407(2012).
  23. Radecke, F., et al. Rescue of measles viruses from cloned DNA. The EMBO Journal. 14 (23), 5773-5784 (1995).
  24. Martin, A., Staeheli, P., Schneider, U. RNA polymerase II-controlled expression of antigenomic RNA enhances the rescue efficacies of two different members of the Mononegavirales independently of the site of viral genome replication. Journal of Virology. 80 (12), 5708-5715 (2006).
  25. Russell, S. J., et al. Remission of disseminated cancer after systemic oncolytic virotherapy. Mayo Clinic Proceedings. 89 (7), 926-933 (2014).
  26. Hardcastle, J., et al. Immunovirotherapy with measles virus strains in combination with anti-PD-1 antibody blockade enhances antitumor activity in glioblastoma treatment. Neuro-Oncology. 19 (4), 493-502 (2017).
  27. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  28. Galanis, E., et al. Phase I trial of intraperitoneal administration of an oncolytic measles virus strain engineered to express carcinoembryonic antigen for recurrent ovarian cancer. Cancer Research. 70 (3), 875-882 (2010).
  29. Galanis, E., et al. Oncolytic measles virus expressing the sodium iodide symporter to treat drug-resistant ovarian cancer. Cancer Research. 75 (1), 22-30 (2015).
  30. Kurokawa, C., et al. Constitutive Interferon Pathway Activation in Tumors as an Efficacy Determinant Following Oncolytic Virotherapy. Journal of the National Cancer Institute. , (2018).
  31. Msaouel, P., et al. Clinical Trials with Oncolytic Measles Virus: Current Status and Future Prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  32. Grote, D., Cattaneo, R., Fielding, A. K. Neutrophils contribute to the measles virus-induced antitumor effect: enhancement by granulocyte macrophage colony-stimulating factor expression. Cancer Research. 63 (19), 6463-6468 (2003).
  33. Grossardt, C., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-armed oncolytic measles virus is an effective therapeutic cancer vaccine. Human Gene Therapy. 24 (7), 644-654 (2013).
  34. Iankov, I. D., et al. Expression of immunomodulatory neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori enhances the antitumor activity of oncolytic measles virus. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (6), 1139-1147 (2012).
  35. Engeland, C. E., et al. CTLA-4 and PD-L1 Checkpoint Blockade Enhances Oncolytic Measles Virus Therapy. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 22 (11), 1949-1959 (2014).
  36. Veinalde, R., et al. Oncolytic measles virus encoding interleukin-12 mediates potent antitumor effects through T cell activation. Oncoimmunology. 6 (4), 1285992(2017).
  37. Hutzler, S., et al. Antigen-specific oncolytic MV-based tumor vaccines through presentation of selected tumor-associated antigens on infected cells or virus-like particles. Scientific Reports. 7 (1), 16892(2017).
  38. Speck, T., et al. Targeted BiTE expression by an oncolytic vector augments therapeutic efficacy against solid tumors. Clinical Cancer Research. , (2018).
  39. Andtbacka, R. H., et al. Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33 (25), 2780-2788 (2015).
  40. Ribas, A., et al. Oncolytic Virotherapy Promotes Intratumoral T Cell Infiltration and Improves Anti-PD-1 Immunotherapy. Cell. 170 (6), 1109-1119 (2017).
  41. Patel, S. J., et al. Identification of essential genes for cancer immunotherapy. Nature. 548 (7669), 537-542 (2017).
  42. Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science. 73, Unit 9.9 (2013).
  43. Cattaneo, R., Rebmann, G., Baczko, K., ter Meulen, V., Billeter, M. A. Altered ratios of measles virus transcripts in diseased human brains. Virology. 160 (2), 523-526 (1987).
  44. Gutsche, I., et al. Structural virology. Near-atomic cryo-EM structure of the helical measles virus nucleocapsid. Science. 348 (6235), New York, N.Y. 704-707 (2015).
  45. Kolakofsky, D., et al. Paramyxovirus RNA synthesis and the requirement for hexamer genome length: the rule of six revisited. Journal of Virology. 72 (2), 891-899 (1998).
  46. Kolakofsky, D., Roux, L., Garcin, D., Ruigrok, R. W. Paramyxovirus mRNA editing, the "rule of six" and error catastrophe: a hypothesis. The Journal of General Virology. 86, Pt 7 1869-1877 (2005).
  47. Parks, C. L., et al. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. Journal of Virology. 75 (2), 921-933 (2001).
  48. JoVE Science Education Database. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  49. JoVE Science Education Database. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  50. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  51. Rota, J. S., Wang, Z. D., Rota, P. A., Bellini, W. J. Comparison of sequences of the H, F, and N coding genes of measles virus vaccine strains. Virus Research. 31 (3), 317-330 (1994).
  52. Bankamp, B., Takeda, M., Zhang, Y., Xu, W., Rota, P. A. Genetic characterization of measles vaccine strains. The Journal of Infectious Diseases. 204, Suppl 1 533-548 (2011).
  53. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of Experimental Medicine. 99 (2), 167-182 (1954).
  54. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  55. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  56. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  57. JoVE Science Education Database. The Western Blot. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  58. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. Journal of Visualized Experiments. (91), e51554(2014).
  59. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. Journal of Visualized Experiments. (44), (2010).
  60. Gerdes, J. Ki-67 and other proliferation markers useful for immunohistological diagnostic and prognostic evaluations in human malignancies. Seminars in Cancer Biology. 1 (3), 199-206 (1990).
  61. JoVE Science Education Database. The Transwell Migration Assay. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  62. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), e54596(2016).
  63. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).
  64. Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).
  65. Yu, F., et al. T-cell engager-armed oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 22 (1), 102-111 (2014).
  66. Fajardo, C. A., et al. Oncolytic Adenoviral Delivery of an EGFR-Targeting T-cell Engager Improves Antitumor Efficacy. Cancer Research. 77 (8), 2052-2063 (2017).
  67. Freedman, J. D., et al. Oncolytic adenovirus expressing bispecific antibody targets T-cell cytotoxicity in cancer biopsies. EMBO Molecular Medicine. 9 (8), 1067-1087 (2017).
  68. Wing, A., et al. Improving CART-Cell Therapy of Solid Tumors with Oncolytic Virus-Driven Production of a Bispecific T-cell Engager. Cancer Immunology Research. 6 (5), 605-616 (2018).
  69. Myers, R. M., et al. Preclinical pharmacology and toxicology of intravenous MV-NIS, an oncolytic measles virus administered with or without cyclophosphamide. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (6), 700-710 (2007).
  70. Rittner, K., Schreiber, V., Erbs, P., Lusky, M. Targeting of adenovirus vectors carrying a tumor cell-specific peptide: in vitro and in vivo studies. Cancer Gene Therapy. 14 (5), 509-518 (2007).
  71. Nakamura, T., et al. Rescue and propagation of fully retargeted oncolytic measles viruses. Nature Biotechnology. 23 (2), 209-214 (2005).
  72. Campadelli-Fiume, G., et al. Retargeting Strategies for Oncolytic Herpes Simplex Viruses. Viruses. 8 (3), 63(2016).
  73. Leber, M. F., et al. MicroRNA-sensitive oncolytic measles viruses for cancer-specific vector tropism. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19 (6), 1097-1106 (2011).
  74. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-mediated multi-tissue detargeting of oncolytic measles virus. Cancer Gene Therapy. 21 (9), 373-380 (2014).
  75. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and oncolytic viruses. Current Opinion in Virology. 13, 40-48 (2015).
  76. Miest, T. S., Cattaneo, R. New viruses for cancer therapy: meeting clinical needs. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 23-34 (2014).
  77. Phuong, L. K., et al. Use of a vaccine strain of measles virus genetically engineered to produce carcinoembryonic antigen as a novel therapeutic agent against glioblastoma multiforme. Cancer Research. 63 (10), 2462-2469 (2003).
  78. Dingli, D., et al. Image-guided radiovirotherapy for multiple myeloma using a recombinant measles virus expressing the thyroidal sodium iodide symporter. Blood. 103 (5), 1641-1646 (2004).
  79. Abate-Daga, D., et al. Oncolytic adenoviruses armed with thymidine kinase can be traced by PET imaging and show potent antitumoural effects by ganciclovir dosing. PLoS One. 6 (10), 26142(2011).
  80. Ungerechts, G., et al. Lymphoma chemovirotherapy: CD20-targeted and convertase-armed measles virus can synergize with fludarabine. Cancer Research. 67 (22), 10939-10947 (2007).
  81. Ketzer, P., et al. Artificial riboswitches for gene expression and replication control of DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 554-562 (2014).
  82. Freedman, J., et al. Targeting T-cells to human cancer associated fibroblasts using an oncolytic virus expressing a FAP-specific T-cell engager. Keystone Symposia & Digitell, Inc. , (2018).
  83. Nishio, N., et al. Armed oncolytic virus enhances immune functions of chimeric antigen receptor-modified T cells in solid tumors. Cancer Research. 74 (18), 5195-5205 (2014).
  84. Bressy, C., Benihoud, K. Association of oncolytic adenoviruses with chemotherapies: an overview and future directions. Biochemical Pharmacology. 90 (2), 97-106 (2014).
  85. Wennier, S. T., Liu, J., McFadden, G. Bugs and drugs: oncolytic virotherapy in combination with chemotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (9), 1817-1833 (2012).
  86. Fillat, C., Maliandi, M. V., Mato-Berciano, A., Alemany, R. Combining oncolytic virotherapy and cytotoxic therapies to fight cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6513-6521 (2014).
  87. Li, H., Peng, K. W., Russell, S. J. Oncolytic measles virus encoding thyroidal sodium iodide symporter for squamous cell cancer of the head and neck radiovirotherapy. Human Gene Therapy. 23 (3), 295-301 (2012).
  88. Opyrchal, M., et al. Effective radiovirotherapy for malignant gliomas by using oncolytic measles virus strains encoding the sodium iodide symporter (MV-NIS). Human Gene Therapy. 23 (4), 419-427 (2012).
  89. Mansfield, D., et al. Oncolytic Vaccinia virus and radiotherapy in head and neck cancer. Oral Oncology. 49 (2), 108-118 (2013).
  90. Miest, T. S., et al. Envelope-chimeric entry-targeted measles virus escapes neutralization and achieves oncolysis. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19 (10), 1813-1820 (2011).
  91. Santiago, D. N., et al. Fighting Cancer with Mathematics and Viruses. Viruses. 9 (9), (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

LDH
باراميكسوفيروسيس لاستهداف الورم المرباة: التصميم والتقييم السابقين فيفو
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.