هذا البروتوكول يوضح كيفية تنقية microRNAs خارج الخلية من خلية ثقافة وسائل الإعلام لبناء مكتبة رنا الصغيرة وتسلسل الجيل القادم. مختلف نقاط التفتيش لمراقبة الجودة ويرد وصف للسماح للقراء لفهم ما يمكن توقعه عند العمل مع نماذج الإدخال المنخفضة مثل اكسرناس.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الكشف خارج الخلية وتعميم (اكسرنا) يتم إنتاجها بواسطة العديد من أنواع الخلايا في الجسم وتوجد في العديد من سوائل الجسم مثل اللعاب والبلازما والمصل، والحليب والبول. هي واحدة من مجموعة فرعية من هذه الكشف المنظمين بوسترانسكريبشونال – ميكرورناس (ميرناس). لتحديد ميرناس تنتجها أنواع محددة من الخلايا، يمكن استخدام نظم الاستزراع في المختبر للحصاد، واكسرناس الشخصية المستمدة من مجموعة فرعية واحدة من الخلايا. العوامل يفرز من الخلايا الجذعية الوسيطة متورطون في التخفيف من العديد من الأمراض، ويستخدم كالنظام النموذجي في المختبر هنا. وتصف هذه الورقة عملية جمع، وتنقية من الحمض النووي الريبي الصغيرة وتوليد المكتبة إلى تسلسل ميرناس خارج الخلية. اكسرناس من وسائط الثقافة تختلف عن الحمض النووي الريبي الخلوية كونها منخفضة عينات من الحمض النووي الريبي الإدخال، الذي يدعو إلى إجراءات محسنة. يوفر هذا البروتوكول دليل شامل للتسلسل اكسرنا صغيرة من وسائط الثقافة، تظهر نقاط التفتيش لمراقبة الجودة في كل خطوة أثناء تنقية اكسرنا وتسلسلها.
المقدمة
خارج الخلية وتعميم الكشف (اكسرناس) موجودة في سوائل الجسم المختلفة وهي مقاومة نحو رنسيس1،2. وفرة عالية، واستقرارها وسهولة الوصول بشكل جذاب للتقييم السريري كعلامات التشخيص وتنبؤاتها3. واسطة النقل اكسرناس وتشمل حويصلات خارج الخلية (EVs)، رابطة مع البروتينات الدهنية (مثل البروتين الدهني الكثافة؛ الحميد) ومجمعات ريبونوكليوبروتين (مثل مع مجمعات Argonaute2)4.
هي مجموعة فرعية اكسرناس ميكرورناس (ميرناس)، وصغيرة غير الترميز الكشف من حوالي 22 nt التي تنظم التعبير الجيني بوسترانسكريبشونال. ميرناس السابقين قد تورطت في خلية خلية الاتصال وتنظيم التوا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: متوسط نمو الخلايا الجذعية الوسيطة (ماجستير وسائل الإعلام) أعد مسبقاً كما هو مبين في الجدول للمواد.
1-خلية ثقافة
ملاحظة: يمكن الحصول على الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة من نخاع العظام، والأنسجة الدهنية أو مصادر أخرى11. وبدلاً من ذلك، يمكن شراء همسكس من خلال مورد. بمسكس المستخدمة في هذا البروتوكول كانت مستمدة من نخاع العظام من المرضى واشترى من شركة.
- ذوبان الجليد 1 × 106 بمسكس في قارورة T175 التي تحتوي على 20 مل وسائط MSC. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 واستبدال وسائط الإعلام كل 2-3 أيام حتى 80% كونفلوينسي.
- تغسل ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول هو الأمثل لجمع اكسرنا من الثقافة لجنة السلامة البحرية لتسلسل الجيل القادم. الخطة الشاملة لسير العمل في الشكل رقم 1 على اليسار ونقاط التفتيش كل منها مراقبة الجودة على الحق.
مورفولوجيا الخلايا في يوم جمع متمايز (الشكل 3A) ومتباينة (الشكل 3B) يتم عرض الخلايا. وعلاوة على ذلك، كما تظهر الممثل مستويات طبيعية من .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتسلسل الجيل القادم من اكسرناس التي تمكن من تحليل التعبير التفاضلية من العينات المدخلات المنخفضة. الانضمام إلى بروتوكول معين لعزل EV واكسرنا مهم لأن التعديلات حتى الصغيرة (أي خطوة تنبيذ فائق أو تغيير نوع الدوار) يمكن أن تؤثر الترنسكربيتوم وميرنا المستويات13،14. وهكذا، بغض النظر عن كيف اكسرنا معزولة، من المهم تطبيق نفس الإجراء التجريبي وبيوينفورماتيك لجميع العينات في تجربة ليتمكن من مقارنة النتائج.
عادة ما يتم ت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
نحن ممتنون للسيد كلاوس الحافلة والسيدة ريتا Rosendahl في إينانو الخاصة بالمساعدة التقنية. شكر خاص إلى الدكتور دانييل أوتزين للسماح لنا الاستخدام المتكرر لبلده أولتراسينتريفوجي. وأيد هذه الدراسة أن الدانمرك "صندوق الابتكار" (حشد المشروع).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام | ATCC | PCS-500-012 | تم شراء الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول من ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | يطلق عليها اسم وسط نمو الخلايا الجذعية الوسيطة (وسائط MSC) |
| Gibco | A2720801 | المستنفدة من الإكسوسوم | |
| : MSCGM ولكن مع استبدال FBS ب FBS | |||
| قارورة Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 | Sarstedt | 833،912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| فوسفات مخزن محلول | ملحي سيجما | 806552 | |
| الطرد المركزي الفائق | بيكمان | ||
| زجاجة بولي كربونات مع مجموعة غطاء | بيكمان كولتر | 355618 | |
| بيكمان كولتر من النوع 60 Ti | الدوار المستخدم هنا | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| & beta ؛ -glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | مكونات وسائط التمايز العظمي |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | مكونات وسائط التمايز العظمي |
| 2-فوسفو-L-أسكوربيك ملح حمض ثلاثي الصوديوم | Sigma | 49752-10G | مكونات وسائط التمايز العظمي |
| 1 &alpha ; ، 25-Dihydroxyvitamin ؛ D3 | Sigma | D1530-1MG | مكونات وسائط التمايز العظمي |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA ومجموعة تنقية الحمض النووي الريبي الكلي للخطوة 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | آلة الرحلان الكهربائي الشعري القائمة على الرقاقة ورقائق لتحليل الحمض النووي الريبي والحمض |
| النووي Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | آلة الرحلان الكهربائي الشعري القائمة على الرقاقة ورقائق لتحليل الحمض النووي الريبي والحمض |
| النووي مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية | Agilent Technologies | 5067-4626 | آلة الرحلان الكهربائي الشعري القائمة على الرقاقة ورقائق لتحليل الحمض النووي الريبي والحمض |
| القياس الكمي لمكتبة KAPA | القياس الكمي لمكتبة | Roche | KK4824 |
| مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي الصغيرة TruSeq - المجموعة أ (24 rxns) (المجموعة أ: الفهارس 1-12) | مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبي الصغيرة Illumina | RS-200-0012 | المستخدمة في هذا البروتوكول - المستخدمة في الخطوة 5 |
| مستخرج هلام الحمض النووي الآلي Pippin Prep Sage Science المستخدم في هذا البروتوكول ؛ يمكن إجراء الاستخراج اليدوي أيضا | |||
| إزالة المحول cutadapt | في الخطوة 6 | ||
| تعيين ربطة العنق | للقراءات النظيفة في الخطوة 6 | ||
| Samtools | لجعل ملف تعريف التعبير في الخطوة 6 | ||
| أدوات السرير | لعمل ملف تعريف التعبير في الخطوة 6 |
المراجع
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circul....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
