هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة تبين نيون جديدة صبغة تقنية للكشف عن البروتين الكلي في الهلام بولياكريلاميدي. يستخدم البروتوكول تحقيق دورة على الأسفار الخاصة بايون فضة، الذي يكشف Ag+-البروتين المجمعات، ويزيل بعض القيود التقليدية البقع الفضية اللونية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تلوين الفضة الفلورسنت من البروتينات في المواد الهلامية Polyacrylamide
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلوين الفضة أسلوب قياس ألوان المستخدمة على نطاق واسع لتصور نطاقات البروتين في المواد الهلامية polyacrylamide عقب الصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). وقد البقع الفضية الكلاسيكية بعض العيوب، مثل خلفية عالية تلطيخ، استرداد البروتين الفقراء، وانخفاض إمكانية تكرار نتائج، مجموعة ديناميكية خطي ضيقة للقياس الكمي، والتوافق محدودة مع الطيف الكتلي (مللي ثانية). الآن، مع استخدام مجس Ag+ فلوروجينيك، TPE 4TA، قمنا بتطوير فضية فلورسنت تلطيخ الأسلوب للتصور مجموع البروتين في المواد الهلامية بولياكريلاميدي. ويتجنب هذا وصمة عار جديدة بخطوة التخفيض الفضة مزعجة في البقع الفضية التقليدية. وعلاوة على ذلك، يوضح وصمة الفضة الفلورسنت إمكانية تكرار نتائج جيدة، وحساسية، والكمي الخطي في الكشف عن البروتين، يجعلها وصمة عار جل بروتين مفيدة وعملية.
المقدمة
وكانت العديد من أساليب المصبوغة المستخدمة لتصور البروتينات بعد التفريد هلام، على سبيل المثال استخدام الأصباغ اللونية مثل "أخذ الأزرق الرائعة"، والفضة وصمة عار، والأسفار، أو المشعة وسم21،، 3 , 4-تلوين الفضة يعتبر أحد الأساليب الأكثر حساسية للكشف عن البروتين التي تتطلب الكواشف بسيطة ورخيصة. فإنه يمكن تصنيفها إلى عائلتين الرئيسية: وصمة وصمة الفضي أممونياكال ونترات الفضة5،6. في أسلوب الفضي أمونياكال القلوية، أنتجت مع هيدروكسيد الصوديوم والأمونيا المجمع ديامينى الفضة وخفضت إلى الفضي المعدني أثناء تطوير استخدام حل فورمالدهايد حمضية. وصمة عار يستوعب كفاءة للبروتينات الأساسية ولكن يظهر أداء الشبهة لبروتينات حمضية ومحايد وهو، علاوة على ذلك، يقتصر على جليكاين الكلاسيكية ونظم الغرواني الكهربي والتورين. في المقابل، استغلال البقع نترات الفضة بيو-تقارب عالية من أيونات الفضة للبروتين، وأساساً سلفهيدريل والكربوكسيل مجموعات من السلاسل الجانبية، وتميل إلى وصمة عار بروتينات حمضية أكثر كفاءة7. بعد أيون الفضة ملزمة، يتم تطبيق حل النامي (عادة مصنوعة من محلول كربونات المعادن يحتوي على ثيوسولفاتي فورمالدهايد والصوديوم) للحد من أيونات الفضة للحبوب الفضي المعدني، التي بناء لون الظلام-براون تصور نطاقات البروتين.
على الرغم من تلطيخ الفضة معروفة جيدا لبراعة وحساسية عالية منذ تطورها في السبعينات8، يعتبر الأسلوب كثيرا ما صعبة كما. أساليب تلوين الفضة خطوات مقيدة بالوقت وإظهار إمكانية تكرار نتائج منخفضة. منذ لون فضي وصمة عار لا عادة موحدة وتعتمد على فترة خطوة التخفيض، مما يصعب التحكم، وصمة عار الفضة ليس أسلوب كمي، وهكذا، لا ينصح لجل مقارنة بين الدراسة والبروتين الكمي9. قد تستخدم أساليب محسنة في حساسية الألدهيدات التي يمكن أن توفر أيضا موحد أكثر تلطيخ10. ومع ذلك، وهذا على حساب إجراء مزيد من التحليل المصب بسبب كروسلينكينج للبروتينات التي الألدهيدات. بروتوكولات سريعة معظمها الجمع أو تقصير خطوات للحد من الوقت، المساس بإمكانية تكرار نتائج والتوحيد من وصمة عار5. نتيجة لذلك هناك العديد الفضة تلطيخ المتغيرات داخل جل البروتين تلطيخ، كل الأمثل لتناسب متطلبات معينة؛ على سبيل المثال، البساطة، والحساسية، أو الببتيد معدل الاسترداد لتحليل المتلقين للمعلومات. هذه السمات قد تؤثر أيضا على بعضها البعض، وتلبية جميع الاحتياجات في بروتوكول واحد يمكن أن يكون صعباً.
في هذا العمل، نحن نقدم فضية فلورسنت جديدة تلوين الأسلوب للكشف عن البروتين في جل polyacrylamide. في هذا الأسلوب، نستخدم تحقيق فلوروجينيك لأيونات الفضة، TPE-4TA (الشكل 1)، أن تصور البروتينات مشربة فضة11. تم تصميم TPE--4TA بمبدأ الانبعاثات الناجمة عن تجميع (المترشح). هو غير عندما تذوب في المحلول، ولكن شدة حضور أيونات الفضة. بالاستعاضة عن تطوير اللونية في البقع الفضية التقليدية مع فلوروجينيك وضع الخطوة، يتيح الأسلوب الفضة الفلورسنت تلطيخ قوية من مجموع البروتينات مع خلفية انخفاض.
وعلاوة على ذلك، أظهرت وصمة الفضة الفلورسنت مجموعة خطي دينامية جيدة لتقدير البروتين، وقابلة للمقارنة مع وصمة "روبي سيبرو" يستخدم على نطاق واسع ولا يمكن تحقيقه مع البقع الفضية التقليدية. يمكن تصويرها على أنظمة التوثيق جل استخداماً مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية الهلام (الطول الموجي الإثارة: 302/365 نانومتر القناة؛ والانبعاثات: ~ 490-530 نانومتر) في مختبرات بيولوجية عديدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد هلام
ملاحظة: هذه المظاهرة يتبع بروتوكول قياسي تحضير الهلام لتلطيخ بعد وقت قصير من الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة12. وباختصار، الخطوات التالية تصف إعداد العينات وهلام التفريد.
- أداء الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع 4%-12% مكررا-تريس البروتين الجل (1 مم، 15-جيدا) استخدام خزان جل مصغرة مليئة 2-(ن-morpholino) اثانيسولفونيك الحمضية (MES) المخزن المؤقت.
- تمييع العينات مع خليط من الماء المقطر والليثيوم دوديسيل كبريتات (LDS) المخزن المؤقت، وعامل تخفيض عينة.
- تحميل لين الأولى مع مضاعفة كمية المخزون (10 ميليلتر)، تليها كمية الأسهم العادية (5 ميليلتر) وسلسلة من شقين تخفيف المخزون بعد ذلك (تخفيف 13، من 2 x 8192 x).
- تشغيل الهلام في جهد مستمر من 200 الخامس لمدة 30 دقيقة.
2. تثبيت جل
- بعد التفريد، غمر المواد الهلامية في محلول 100 مل من حمض الخليك ethanol/10% 40% على شاكر مداري 50 لفة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة 2 x (كل 30 دقيقة)، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل الهلام 3 × 10 دقيقة كل في الماء عالي النقاوة في حاوية نظيفة. خطوة الغسيل أمر بالغ الأهمية. إذا لم تتم إزالة الأحماض من الحل تحديد بشكل صحيح في الخطوة فلوروجينيك النامية، المفرطة TPE--4TA سوف يتم تفعيلها بالحامض وتؤدي إلى الأسفار خلفية قوية في الهلام.
3-إعداد إنيو3الحل والفضة التشريب من جل
- لجعل الحل3 إنيو (0.0001%) للحمل، أولاً، حل ز 0.01 إنيو3 في 10 مل الماء عالي النقاوة لإعداد حل أسهم3 إنيو 0.1%. بعد ذلك إضافة 100 ميليلتر من الحل الأسهم3 إنيو 0.1% إلى 100 مل الماء عالي النقاوة لجعل الحل العامل.
ملاحظة: يجب تخزين الحل3 إنيو في الظلام قبل الاستخدام. - تلقيح الهلام مع 100 مل فضة تعمل حل ح 1 على شاكر مداري 50 لفة في الدقيقة في حاوية زجاجية محكمة الإغلاق. من الضروري إجراء التلقيح الفضة تحت غطاء دخان، محمية من الضوء مع رقائق الألومنيوم.
- أغسل الهلام مع الماء عالي النقاوة (حوالي 100 مل) في حاوية نظيفة 2 × 60 ثانية.
4-فلوروجينيك تطوير هلام
- إعداد الحل صبغ الأسهم (0.1 مم)، إضافة مغ 3.0 لصبغ TPE--4TA في 50 مل الماء عالي النقاوة. Sonicate الحل لبضع دقائق وإضافة بعض حل هيدروكسيد الصوديوم (على سبيل المثال 1 م) للمساعدة في حل الصبغة.
- راجع الأسفار الحل تحت مصباح 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية لضمان أن الجزيء صبغ تماما يذوب. إلا أن الحلول ضعيفة أو نونيميسيفي يشير إلى حل كامل.
ملاحظة: صبغة TPE--4TA كان تصنيعه التالية البروتوكول أفادت مؤخرا بشيه et al. 10 الحل TPE--4TA مستقرة جداً، ويمكن أن يوضع في الظلام لمدة أشهر. - لتحضير 100 مل الحل فلوروجينيك النامية (10 ميكرون)، أضف 10 مل الحل الأسهم TPE--4TA إلى 90 مل من الماء عالي النقاوة. تحقق من الرقم الهيدروجيني للحل باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني وضبط ذلك باستخدام حل هيدروكسيد الصوديوم (1 ميكرومتر) من 7-9.
- نقل الجل إلى حاوية نظيفة ويمكن إغلاقها بشرط مع 100 مل الحل فلوروجينيك النامية. تأكد من الجل مغمورة تماما في الحل. ختم الحاوية. أنها تغطي من الضوء والتخلص منه بين عشية وضحاها في شاكر مداري 50 لفة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدلاً من ذلك، يمكن أيضا تقصير الخطوة الحضانة إلى حوالي ~ 2 ح بالتدفئة الحل المترشح النامي إلى 80 درجة مئوية لتلطيخ وثم تركها في درجة حرارة الغرفة.
5-ديستينينج والتصوير
- نقل الجل إلى حاوية نظيفة وديستين أنه في 100 مل إيثانول 10% لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: يمكن استخدام الماء وحدة لغسل الهلام. ومع ذلك، أنها أكثر فعالية من حيث الوقت لاستخدام حل إيثانول 10% ديستاينينج. وهذا سيساعد على الحد من عملية ديستاينينج من ساعة إلى 30 دقيقة. - شطف الجل في الماء عالي النقاوة لمدة 5 دقائق.
- صورة الجل في 365 نانومتر القناة أو قناة نانومتر 302 من آلة جل وثائق.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نطاقات البروتين الملون بوصمة الفضة الفلورسنت يحمل فلورية خضراء مكثفة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر. جميع نطاقات البروتين 14 (10-200 كاتشين)، من أعلى إلى أسفل، كانت واضحة للعيان، ربط جيدا مع 14 منها حمراء اللون الملون ب صبغ (الشكل 2) "روبي سيبرو"10.
وفيما يتعلق بالكشف عن كمية البروتين، المواد الهلامية تم تصويرها بهلام نظام الإجراءات الآلية باستخدام التصوير، والصور...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قدم هنا هو فضة فلورسنت رواية تلطيخ الأسلوب للبروتينات في المواد الهلامية polyacrylamide. ويدمج هذه الاستراتيجية البقع الفضية التقليدية والبقع الفلورسنت. التحقيق مآثر المصبوغة الربط الانتقائي لايون الفضة للبروتينات كما هو الحال في غيرها الفضة بقع لكنها توظف فضية فلوروجينيك حساسة للغاية TPE--4TA لتضيء البروتينات منضم الفضة. منذ التحقيق فلوروجينيك TPE-4TA يمكن الشعور أيونات الفضة بتركيز منخفض إلى حد ما في نطاق nanomolar11، فإنه تمكن من كشف حساسة للغاية دون أي مزيد من...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
قدمت طلب البراءة على هذا تلطيخ الفضة الفلورسنت.
شكر وتقدير
الكتاب يود أن يشكر باتريك تشان في مركز لاو وأي مينغ "الطب الترميمي"، ومعهد كارولينسكا، لدعمه التقني. عاشرا – س. ممتن للدعم من "مجلس البحوث السويدية" (منحة رقم 2017-06344).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
LDS عينة عازلة (4X) | كاشف | Thermo Fisher Scientific | NP0007 |
4-12٪ هلام بروتين Bis-Tris ، 1.0 مم ، 15 بئر | Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | عينة جل مسبقة الصب |
| (10X) | كاشف | Thermo Fisher Scientific | NP0004 |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | كاشف |
| ميني جل تانك | ثيرمو فيشر العلمي | A25977 | معدات |
| 300 واط مزود الطاقة (230 فولت تيار متردد) | معدات ثيرمو فيشر العلمي | PS0301 | سلم |
| بروتين غير ملوثة | ثيرمو فيشر ساینتيفيك | 26614 | عينة |
| نترات الفضة | سيجما ألدريتش | 31630-25G-R | كاشف |
| الإيثانول | براج وشركاه. | 42520J | كاشف |
| حمض الخليك | JT Baker | 103201A | كاشف |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk-يوفر | 18.2 M & Omega;. | |
| نظام توثيق هلام الماء cm (نموذج c600) Azure | biosystems-Equipment |
المراجع
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
