يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

البروتين كيناز ج-دلتا "الببتيد المانع صياغة" استخدام "الذهب جسيمات نانوية"

4.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58741

⸱

مارس 9, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Respiratory Medicine Research Laboratory, Institute of Translation Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University, 3Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Toronto

في هذه المقالة

ملخص

وقد استخدمنا سابقا هجين ببتيد نانوحبيبات الذهب لتسليم عن طريق الوريد الببتيد الاصطناعية، مثبط البروتين كيناز ج-دلتا، مما خفض إصابة الرئة الحاد الناجم عن ضخه الاسكيمية. هنا نعرض البروتوكول مفصلاً لوضع المخدرات. يمكن أن تصاغ الببتيدات داخل الخلايا الأخرى وعلى نحو مماثل.

الملخص

مثبطات البروتين كيناز ج-دلتا (PKCδi) دواء واعداً لمنع الضرر الناجم عن ضخه الاسكيمية الجهاز. هو عادة مترافق لاختراق الخلية ببتيد، تأت، للتسليم داخل الخلايا. ومع ذلك، أظهرت تأت الأنشطة البيولوجية غير محددة. يمكن استخدام الجسيمات النانوية الذهبية (قومي) كشركات تسليم المخدرات دون سمية المعترف بها. ولذلك، فقد استخدمنا هجين الناتج القومي الإجمالي/ببتيد لتسليم PKCδi. اثنين قصيرة الببتيدات (P2: كااا و P4: كووو)، بنسبة نمط، واستخدمت لتعديل خصائص السطح من الناتج القومي الإجمالي. قومي مترافق مع PKCδi (الناتج القومي الإجمالي/بكسي) مستقرة في الماء المقطر، 0.9% كلوريد الصوديوم، وفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تحتوي على ألبومين المصل البقري أو المصل البقري الجنين. وأبدى سابقا الحقن الوريدي من الناتج القومي الإجمالي-بكسي لمنع الإصابة الاسكيمية-ضخه في الرئة. توضح هذه المقالة بروتوكول لصياغة الناتج القومي الإجمالي/بكسي وتقييم الخصائص الفيزيائية للناتج القومي الإجمالي/بكسي. لقد استخدمنا أساليب مماثلة لوضع المخدرات الأخرى المستندة إلى ببتيد مع الناتج القومي الإجمالي. سوف يوجه هذا المقال نأمل المزيد من الاهتمام لهذه التكنولوجيا تقديم رواية المخدرات داخل الخلايا وتطبيقاتها المجراة.

المقدمة

زرع الرئة يحفظ المرضى ب أمراض الرئة نهاية مرحلة1. ومع ذلك، تبقى مضاعفات خطيرة بعد زرع الرئة عقبة. في المراحل الأولى بعد زرع الرئة، هو الخلل الأساسي الابتزاز المضاعفات الضارة الأكثر1، وأن السبب الرئيسي هو الاسكيمية-الاكسجينيه (الأشعة تحت الحمراء)-الناجم عن إصابة الرئة الحاد2.

قيد الحفظ بالتبريد، يقتصر التمثيل الغذائي في الرئة المانحين إلى مستوى منخفض جداً. ومع ذلك، يتم تنشيط الأنواع الأكسجين التفاعلية وتوليف أكسيد النيتريك نظراً لوقف تدفق الدم3. بعد زرع الأعضاء، يتم استعادة الدورة الدموية، والأنواع الأكسجين التفاعلية وأكسيد النيتريك التي تم إنشاؤها أثناء الاسكيمية الباردة تعزيز التهاب وخلية الموت، أسفر عن إصابة الأنسجة.

وقد استخدمت لمنع ضرر الأشعة تحت الحمراء، مثبط Cδ كيناز بروتين (PKCδi) في القلب والمخ والرئة4،5،،من67،8. وأظهرت هذه الدراسات أن تناقص PKCδi التهاب والمبرمج أثناء ضخه. كما منعت الإصابة الأشعة تحت الحمراء الرئوية في الفئران و نموذج عملية زرع الرئة6. هو عادة مترافق PKCδi مع اختراق الخلية ببتيد، تأت، للتسليم داخل الخلايا. بيد أنه قد ثبت أن الببتيد تأت وحدها قد آثار بيولوجية غير محددة، بما في ذلك الترويج للأوعية، والمبرمج، وتثبيط السيتوكينات متعددة9،،من1011. جسيمات نانوية، جزيئات صغيرة تتراوح بين 1 إلى 100 نانومتر في قطرها12، تم استكشاف كمرشحين في تسهيل إيصال المخدرات13. على وجه الخصوص، تعتبر جسيمات نانوية الذهب (قومي) موسع وغير سام. ولذلك، قمنا بتطوير قومي كالمخدرات تسليم ناقلات للمخدرات على أساس الببتيد،من1415.

يمكن التلاعب بها سطح قومي لتطبيقات محددة مثل التعرف الجزيئي16،17و الاستشعار الكيميائية18و التصوير19وإيصال الأدوية. تم تطوير نظام هجين الناتج القومي الإجمالي/ببتيد، الذي يحتوي على 20 نانومتر قومي واثنين من الببتيدات قصيرة (P2: كااا و P4: كووو) بنسبة نمط، لتعديل خصائص السطح من قومي. الببتيد P2، مع حمض الجلوتاميك مشحونة سلبا (ه) في النهاية، تستقر قومي في محلول مائي، ويساعد الببتيد P4، مع التربتوفان مسعور (W) في النهاية، قومي مدخل داخل الخلايا14. بقايا السيستين (ج) في المحطة ن من هذه الببتيدات تحتوي على مجموعة ثيول يمكن مترافق ل الأسطح الذهب14. كذلك استخدمت هذا الهجين الناتج القومي الإجمالي الببتيد لتسليم PKCδi (كسفنسييلجسل). نسبة المولى محسن P2:P4 أن PKCδi هو 47.5:2.5:50. قومي مترافق مع PKCδi (الناتج القومي الإجمالي/بكسي) هي مستقرة في الماء المقطر، 0.9% كلوريد الصوديوم، وبرنامج تلفزيوني يحتوي على الزلال البقري أو المصل البقري الجنين14. لقد ثبت الحقن الوريدي من الناتج القومي الإجمالي/بكسي لمنع الإصابة ضخه الاسكيمية الرئة15. هذه الوثيقة بالتفصيل أسلوب صياغة الناتج القومي الإجمالي/بكسي ويصف كيفية تقييم الخصائص الفيزيائية للناتج القومي الإجمالي/بكسي. لقد استخدمنا أساليب مماثلة لوضع المخدرات الأخرى الببتيد يضاف إلى الناتج القومي الإجمالي20،،من2122. نأمل أن هذه المادة سيتم توجيه مزيد من الاهتمام لصياغة هذه الرواية لإيصال المخدرات داخل الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد حلول الببتيد

  1. استرداد الببتيدات (P2: كااا، P4: كاووو، PKCδi: كسفنسييلجسل) من الثلاجة-20 درجة مئوية وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: الاحتفاظ زجاجة مغلقة لمنع الرطوبة من التكثيف على الببتيدات.
  2. وزن 0.01 غرام من كل الببتيد في microscale. وضع كل الببتيد في أنبوب مخروطي منفصل 50 مل.
  3. إضافة 18.74 مل مياه (DI) إلى الأنبوبة P2.
  4. إضافة مل 16.93 المياه دي للأنبوب P4.
  5. إضافة 8.21 مل من 50% الاسيتو الانيتريل المخفف في الماء دي إلى أنبوب PKCδi.
  6. دوامة الحلول الببتيد بإيجاز. وضع الأنابيب المخروطية 50 مل سونيكاتور (40 ميغاهرتز) لمدة 5 دقائق.
  7. إيجاد حلول الببتيد للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء. ينبغي أن تكون جميع الحلول الببتيد أعد 1 مم.
  8. نقل 1 مل لكل حل الببتيد إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد. إضافة 19 مل مياه دي لأنابيب P2 و P4 وإضافة مل 19 من 50% الاسيتو الانيتريل إلى أنبوب PKCδi، حيث أن كل حل هو إضعاف إلى 50 ميكرومتر وتخزينها في الأنبوبة الخاصة به.

2-صياغة الناتج القومي الإجمالي/بكسي

  1. الببتيدات ينبغي أن يضاف إلى الحل الناتج القومي الإجمالي في حين لا يزال في بكالوريوس العلوم
  2. إضافة ميكروليتر 475 من P2، 25μL P4 و 500 ميكروليتر من حل δPKCi في أنبوب 15 مل. إضافة 9 مل من محلول الناتج القومي الإجمالي "20 شمال البحر الأبيض المتوسط" (7.0x1011 الجسيمات/mL) إلى الأنبوبة 15 مل نفس.
  3. خروج مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. التفاف على أنبوب 15 مل مع رقائق الألومنيوم. ترك الأمر على شاكر في الرايت بين عشية وضحاها.
  4. العودة العينات للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء. الكوة 1 مل من الناتج القومي الإجمالي/بكسي في كل microtubes 1.5 مل.
  5. الطرد المركزي هذه الأنابيب في الدقيقة-الطرد مركزي لمدة 30 دقيقة في 15,294 س ز في 4 درجات مئوية.
  6. إزالة المادة طافية من كل أنبوب إطار السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
    ملاحظة: كن حذراً لإزالة المادة طافية مع ضمان أن بيليه الناتج القومي الإجمالي لا يزال سليما، ولا يستنشق.
  7. إعادة تعليق بيليه في المذيب المطلوب وفقا للتركيز المطلوب. المذيبات المطبقة يمكن أن تكون المياه وبرنامج تلفزيوني 0.9% دي كلوريد الصوديوم.
    ملاحظة: ابتداء من 1 مل من الناتج القومي الإجمالي/بكسي، يحتوي على بيليه الناتج القومي الإجمالي 6.3 × 1011 الجسيمات، استناداً إلى تركيز الناتج القومي الإجمالي توفيرها من قبل الشركة المصنعة. إدارة 1.3 × 1012 الجسيمات في 500 ميليلتر من 0.9% كلوريد الصوديوم، نضيف ميليلتر 232 من 0.9% كلوريد الصوديوم إلى كل من الكريات الثلاثة. بعد تجميع معا، يمكننا ثم جمع 500 ميليلتر للحل الناتج القومي الإجمالي/بكسي.
    ملاحظة: مزيج المرجوة المذيبات قبل إضعاف الناتج القومي الإجمالي/بكسي بيليه، إلا الناتج القومي الإجمالي/بكسي سوف التجميعية.

3-تقييم قابلية الذوبان الهجين الناتج القومي الإجمالي/بكسي

  1. صب 0.5 مل من محلول الناتج القومي الإجمالي/بكسي في ومبومو اﻷكريليك. ضع ومبومو اﻷكريليك على جهاز المطياف الضوئي تجاه الأشعة فوق البنفسجية واختبار امتصاص ذروة15.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وينبغي الحرص على تقييم الخصائص الفيزيائية الهجين الناتج القومي الإجمالي/بكسي، الناتج القومي الإجمالي يميل إلى الكلية في المذيبات. عندما يتم تجميع الناتج القومي الإجمالي، يتغير لون الحل من الوردي إلى الأرجواني (الشكل 1a). جهاز المطياف الضوئي تجاه الأشعة فوق البنفسجية قادرة على الكشف عن التغييرات أكثر حساسية. إذا لم يتم تجميعه في الناتج القومي الإجمالي/بكسي ينبغي أن يكون ذروة امتصاص في 525 نانومتر (الشكل 1b). إذا كان يتم تجميعه في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لضمان صياغة سليمة، من الأهمية بمكان أن يخضع الحل δPKCi خطوة سونيكيشن المبينة في 1.6. ΔPKCi الببتيد تسلسل يحتوي على مويتيس مسعور، حيث سونيكاتور ويساعد في إذابة بكسي في الحل الاسيتو الانيتريل 50%. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم جداً لخلط المذيبات دقة، كما هو موضح في الخطوة 2.7.  الهجين الناتج القومي الإجمالي/بكسي ليس جيدا ستصاغ إذا لم تتم هذه الخطوات بشكل صحيح، بسبب تراكم الببتيد δPKCi23.
 
وضع المخدرات على أساس الناتج القومي الإجمالي يوفر العديد من المزايا. أولاً، يمكن توليفها قومي بسهولة في أح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالإفصاح عن هذا المشروع.

شكر وتقدير

ويدعم هذا العمل المنح البحثية من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (PJT-148847) ووزارة البحث والابتكار في أونتاريو (RE-08-029) وكندا البحث الأولى للتميز البرنامج، الطب حسب التصميم في جامعة تورنتو. الدكتور ليو مينجياو هو جيمس وماري دافي الرئاسة في إصابة الرئة، وإصلاح وتجديد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ببتيد حمض الجلوتاميك سالب الشحنة (P2)تسلسل CanPeptide: CAAAAE-NH2
الطول: 6aa
التعديل: C-terminal amidation
الكمية: 50mg
نقاء: >95٪
ببتيد التربتوفان الكارهة للماء (P4)تسلسل CanPeptide: CAAAAW-NH2
الطول: 6aa
التعديل: C-terminal amidation
الكمية: 50mg
نقاء: >95٪
δ PKCi الببتيدCanPeptideالتسلسل : CSFNSYELGSL-NH2
الطول: 11aa
التعديل: C-terminal amidation
الكمية: 50 مجم
نقاء: >95٪
أنبوب مخروطي (50 مل)أنبوب مخروطي 3582070
Life Sciences (15 مل)Corning Life Sciences3582096
AcetonitrileSigma-Aldrich271004-100ML
سونيكاتوربرانسون الموجات فوق الصوتية كورب.برانسون 2510MTH
MicrotubeDiamed.caAD 150-N
حل الجسيمات النانوية الذهبيةتيد بيلا15705-5حجم الجسيمات هو 20 نانومتر
هزاز منصة شاكرVWR الدولية40000-304 & nbsp ؛
جهاز طرد مركزي دقيقEppendorf5417R
أكريل كوفيتSARSREDT67.758
UV-Vis مقياس الطيف الضوئيAgilentCaty 60 UV-Vis
Corning

المراجع

  1. Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
  2. Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
  3. Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
  4. Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
  5. Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
  6. Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
  7. Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
  8. Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
  9. Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
  10. Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
  11. Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
  12. Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
  13. Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
  14. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  15. Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
  16. Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
  17. Rosi, N. L., Mirkin, C. A. Nanostructures in biodiagnostics. Chemical Reviews. 105 (4), 1547-1562 (2005).
  18. Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
  19. Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
  20. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  21. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  22. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  23. Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
  24. Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
  25. Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
  26. Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360(2009).
  27. Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
  28. Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
  29. Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

البروتين كيناز ج-دلتا "الببتيد المانع صياغة" استخدام "الذهب جسيمات نانوية"
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.