مقالة منهجية

تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع

DOI:

10.3791/58756

⸱

يناير 21, 2019

 , 
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجهر متقدمة تسمح سريعة وعالية الدقة التصوير على حد سواء، من غشاء البلازما معزولة وحجم داخل الخلايا المحيطة بها، وسيقدم. يسمح إدماج الغزل القرص ومجموع التأمل الداخلي fluorescence مجهرية في الإعداد واحد يعيش تجارب التصوير في معدلات اقتناء عالية تصل إلى 3.5 ثانية لكل صورة المكدس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الخلايا الحية، العمليات مثل تشكيل التصاق تنطوي على تغييرات هيكلية واسعة في غشاء البلازما وداخل الخلية. من أجل تصور هذه الأحداث ديناميكية للغاية، تم الجمع بين اثنين من التقنيات التكميلية الخفيفة الميكروسكوب أن السماح بتصوير سريع لعينات حية: الغزل القرص المجهري (SD) لتسجيل حجم سريعة وعالية الدقة والتأمل الداخلي الإجمالي الأسفار (TIRF) الفحص المجهري للترجمة الدقيقة والتصور من غشاء البلازما. سيظهر بروتوكول تصوير شاملة وكاملة لتوجيه من خلال إعداد العينة ومعايرة المجهر وتكوين الصور واقتناء، وأسفر متعدد الألوان SD-TIRF سلسلة التصوير العيش مع ارتفاع القرار الزمانية. وترد جميع خطوات تجهيز الصورة اللازمة لتوليد datasets التصوير حية متعددة الأبعاد، أي تسجيل ومجموعة من القنوات الفردية، في ماكرو الذاتي مكتوب لبرمجيات المصدر المفتوح إيماجيج. تصوير البروتينات الفلورية أثناء بدء تشغيل ونضوج التصاق المجمعات، وكذلك تشكيل شبكة cytoskeletal أكتين، استخدمت كدليل على المبدأ لهذا النهج المبتكر. تركيبة عالية الدقة 3D الفحص المجهري و TIRF قدمت وصفاً مفصلاً لهذه العمليات المعقدة داخل البيئة الخلوية، وفي الوقت نفسه، التعريب الدقيق للجزيئات المرتبطة بغشاء من الكشف، بارتفاع نسبة الإشارة إلى الخلفية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أيامنا، بتطوير تقنيات الفحص المجهري الخفيفة توفير تصوير القرار السامي/سوبر في ثابت والعينة الحية سريعاً. تقنيات فائقة القرار مثل حفز الانبعاثات استنفاد (STED)، منظم إضاءة مجهرية (SIM) وصور في تفعيل التعريب مجهرية (النخيل) أو إعادة البناء الضوئي العشوائية المباشرة مجهرية (العاصفة)، على التوالي، هي المتاحة تجارياً وتمكين تصوير هياكل سوبسيلولار عرض التفاصيل تقريبا في الحجم الجزيئي1،2،3،4،،من56. ومع ذلك، هذه النهج ما زالت محدودة الانطباق لتجارب التصوير الحية التي تحتاج إلى تصور مع إطارات متعددة في الثانية وسرعة اقتناء كميات كبيرة. أنواع مختلفة من عمليات ديناميكية للغاية تنظم عبر غشاء البلازما، مثل إندو-/الرقابة أو الالتصاق أو الهجرة أو إشارات، تحدث مع سرعة عالية داخل وحدات التخزين الخلوية الكبيرة. مؤخرا، من أجل ملء هذه الفجوة، كان أسلوب الفحص المجهري متكاملة المقترحة للغزل يسمى القرص-TIRF (SD-TIRF)7. بالتفصيل، تصاريح TIRF الفحص المجهري لعزل على وجه التحديد وتعريب8،غشاء البلازما9، بينما مجهرية SD واحدة من أكثر المسائل حساسية وسرعة يعيش تقنيات التصوير للتصور وتتبع سوبسيلولار العضيات في10،السيتوبلازم11. المزيج من كلا تقنيات التصوير في إعداد واحد قد تحققت فعلا في12،الماضي13، بيد المجهر المعروضة هنا (الشكل 1) وأخيراً يفي بمعايير القيام بتجارب التنمية المستدامة-TIRF التصوير الحي العمليات المذكورة آنفا على 3 إطارات في الثانية وسرعة. منذ هذا المجهر متاحة تجارياً، والهدف من هذه المخطوطة هو وصف في التفاصيل وتوفير أدوات مفتوحة المصدر وبروتوكولات للحصول على الصور والتسجيل والتصور المرتبطة بالفحص المجهري SD-TIRF.

يستند الإعداد مجهر مقلوب متصلة بوحدات الفحص اثنين عبر منافذ مستقلة-المنفذ الأيسر مرتبط بوحدة التنمية المستدامة والمنفذ مرة أخرى إلى وحدة الماسح الضوئي TIRF وصور--تنشيط/-تبييض التجارب. أشعة الليزر تصل إلى 6 (405/445/488/515/561/640 nm) يمكن أن تستخدم للإثارة. للإثارة والكشف عن إشارة الأسفار، أما علامة x 100/60 x أو زيت NA1.45/NA1.49 النفط الهدف TIRF، على التوالي، وقد استخدمت. الضوء المنبعثة هو تقسيم بواسطة مرآة مزدوج اللون (561 نانومتر طويلة-تمرير أو 514 nm منذ فترة طويلة-تمرير) وتتم تصفيتها بواسطة تمرير الفرقة مرشحات مختلفة (55 نانومتر واسعة تركزت في 525 نانومتر، 54 نانومتر واسعة تركزت في 609 نانومتر للأسفار الأخضر والأحمر، على التوالي) وضعت أمام اثنين كام م-مكافحة التصحر المناقصات الإلكترونية. يرجى ملاحظة أنه يتم سرد المزيد من التفاصيل الفنية حول برنامج الإعداد في زوبياك et al. 7. في تكوين TIRF، يتم نقل وحدة التنمية المستدامة خارج مسار الضوء داخل حوالي 0.5 s حيث أنه يمكن استخدام نفس اثنين من الكاميرات للكشف، مما يتيح سرعة التبديل بين طرائق التصوير اثنين مقارنة بحوالي 1 ثانية الذي تم الإعلام عنه في الماضي13 < /c2 >. تتيح هذه الميزة إمكانية اكتساب متزامنة مزدوجة القناة، وهكذا 4 القنوات SD-TIRF التصوير السرعة لا مثيل لها في السابق ويمكن تنفيذها بدقة. وعلاوة على ذلك، المواءمة بين التنمية المستدامة و TIRF الصور لا لزوم لها. محاذاة الصورة بين اثنين من الكاميرات، ومع ذلك، قد يمكن فحصها قبل البدء التجربة وتصحيحها إذا لزم الأمر. في البروتوكول التالية، تم تنفيذ روتين تصحيح تسجيل في ماكرو ImageJ الذاتي مكتوب. وعلاوة على ذلك، الماكرو صمم أساسا للسماح لمرئيات متزامنة TIRF الآدمية رغم أبعاد مختلفة والتنمية المستدامة. اقتناء البرمجيات نفسها لم تقدم هذه الميزات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد الخلايا

  1. يومين قبل التجربة، بذور الخلايا 3 * 105 هيلا أو NIH3T3 في 2 مل متوسطة النمو الكامل كل جيدا لوحة الخلية 6-جيدا-والثقافة. ضمان أن يتم التعامل مع الخلايا في غطاء الاندفاق الصفحي في جميع أنحاء هذا البروتوكول.
  2. يوم واحد قبل التجربة، إعداد الكواشف تعداء وفقا لتوصيات الشركة المصنعة أو بروتوكولا تجريبيا العزم، مثلاً:
    1. تمييع 1 ميكروغرام من ليفيكت طلب تقديم العروض وتخفيض 1 ميكروغرام من يفب-فينكولين في مجموعها 200 ميليلتر المتوسطة المصل. دوامة الكاشف تعداء بإيجاز، إضافة 4 ميليلتر للحمض النووي 200 ميليلتر ودوامه مرة أخرى. احتضان هذا المزيج تعداء لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة مزيج تعداء كاملة دروبويسي مباشرة إلى الخلايا. مزيج من الهز اللوحة ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.
  3. في يوم التجربة، إعداد العينة لتصوير مباشر:
    1. تعد حلاً ميكروغرام/مل 10 من فيبرونيكتين في برنامج تلفزيوني لمعطف سطح الزجاج صحن أسفل الزجاج 35 ملم. استخدم فقط كوفيرسليبس الزجاج 0.17 ملم ذات جودة عالية لتحقيق الأداء الأمثل TIRF وتجنب الأطباق أسفل البلاستيك. إجازة الحل على الزجاج السطحية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالته واسمحوا الطبق أيردري.
    2. تمييع حل خرز متعدد فلورسنت 0.1 ميكرومتر لكثافة 1.8 × 109 جزيئات كل مل بالماء المقطر وإضافة الحل بالنسبة 30-60 ثانية إلى سطح الزجاج فيبرونيكتين المغلفة. إزالة الحل فورا وترك الطبق أيردري.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضروري فقط إذا كان ينبغي العثور على الطائرة TIRF قبل البذر الخلايا و/أو للحصول على صورة مرجع 2-لون لتسجيل صورة تستند إلى حبة.
    3. إعداد حل حمض الأسكوربيك (أإ) 0.1 M وتمييع لتركيز نهائي من 0.1 ملم في النمو المتوسطة (أإ-المتوسطة). ضع الحل في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدام محسن للأسفار خلية الثقافة المتوسطة إذا كان ذلك ممكناً، مثل كما خالية من فينولريد و (ريبو) خفضت فلافين والمتوسط. AA هو عامل مؤكسدة المضادة التي يمكن أن تقلل من الآثار سمي ضيائي أثناء التصوير مباشرة14. نحن اختبرت بنجاح في هذا التحليل، أي المزيد من الخلايا تبدو صحية ضمن الشروط المطبقة من دون إضافة AA. ومع ذلك، تم خفض الرقم الهيدروجيني للوسط 0.17 درجة الحموضة الوحدات.
    4. تغسل الخلايا مع 2 مل برنامج تلفزيوني، إضافة 250 ميليلتر يدتا التربسين وانتظر حتى يتم الخلايا تماما منفصلة (2-3 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية). ريسوسبيند الخلايا بعناية في 1 مل قبل استعد AA والمتوسط مع ماصة وإضافته إلى 4 مل AA-المتوسطة في أنبوب ثقافة خلية 15 مل. وضع تعليق خلية مع غطاء فتحه قليلاً في حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية و 5% CO2 محيط المجهر.
    5. أضف 1 مل قبل استعد AA المتوسطة الطبق أسفل الزجاج ووضعه في صاحب المجهر ساخنة مسبقاً (انظر الفقرة التالية).

2-يعيش التصوير

  1. بدء تشغيل مراقبة البيئة من المجهر تحقيق استقرار 37 درجة مئوية، 5% CO2 والأجواء الرطبة.
    ملاحظة: هنا، غرفة حضانة أعلى مرحلة صغيرة وقد استخدمت أن إعدادات مستقرة المسموح بها ضمن حوالي 15 دقيقة أكبر الحاضنات سوف تحتاج مزيدا من الوقت لتحقيق ظروف مستقرة.
  2. إصلاح كافة الحصول على الإعدادات في المجهر قبل تطبيق تعليق الخلية:
    1. تعيين الفاصل الزمني إلى 30 ثانية، وأن مدة 60-90 دقيقة بتنشيط وظيفة التركيز التلقائي للأجهزة القائمة على التركيز التلقائي لكل نقطة الوقت (القيمة "1").
    2. ضبط التعرض الكاميرا والكسب، فضلا عن قوة الليزر لكل قناة. الحصول على مستويات عالية، ووقت التعرض المنخفضة والليزر منخفض الطاقة يوصي تقليل سمية صور.
      ملاحظة: البيانات المقدمة هنا حصل مع التعرض 200 مرض التصلب العصبي المتعدد، والوصول إلى مستوى 500 و 20% الليزر السلطة التي تساوي كثافة الإثارة من 0.5 W/cm ² ل 488 نانومتر و 1 ث/cm ² ل 561 نيوتن متر، على التوالي.
    3. تعيين z-المكدس لقنوات الغزل-القرص إلى 10 ميكرون مع 0.4 ميكرومتر التباعد. إلغاء تنشيط z-مداخن للقنوات TIRF. مجموعة السفلي-الإزاحة إلى "0"، أي أن الطائرة أدنى ستكون موضع تركيز الأجهزة التركيز التلقائي.
    4. تنشيط وظيفة متعددة النقاط "مرحلة المواقف".
      ملاحظة: ما يصل إلى 3 وظائف يمكن أن تسجل في فاصل زمني ق 30.
  3. البحث عن الخرز الفلورسنت مع إضاءة الفلورسنت برنامج التحصين الموسع في العين أو على شاشة الكمبيوتر، ثم تنشيط قناة TIRF واحدة وتعيين زاوية الإضاءة إلى قيمة التي تشير إلى الإضاءة TIRF. تنشيط التركيز التلقائي عن طريق الضغط على زر في لوحة مجهر وضبط التركيز مع عجلة الإزاحة. اكتساب من dataset 2-لون، أي TIRF 488 و TIRF-561، لتسجيل الصورة اللاحقة المستندة إلى حبة (انظر النقطة 3.1).
    1. اختياري: لضمان إضاءة TIRF، إضافة ميكروليتيرس عدد قليل من تعليق الخرز متعدد الألوان الفلورية بحرية عائمة (انظر النقطة 1.3.2.). تنشيط عرض حي لقناة TIRF وزيادة زاوية الإضاءة. سوف تختفي الخرز غير ملتصقة وراء زاوية حرجة، ضمان إضاءة TIRF صحيح8.
  4. مزيج تعليق الخلية مرة أخرى بعكس الأنبوبة المغلقة 2-3 مرات، وتطبيق 1 مل الخلايا إلى الطبق التصوير.
  5. العثور بسرعة على خلايا transfected مزدوجة مع انخفاض مستوى الإضاءة الفلورسنت برنامج التحصين الموسع. مركز الخلايا في المعاينة الكاميرا مباشرة باستخدام الإضاءة الحقل مشرق ووضع علامة على موضع. العثور على آخر 1-2 النقاط المثيرة للاهتمام وحفظها إلى قائمة المواقع.
    ملاحظة: في البداية، الخلايا بسهولة فصل بسبب الحركة المرحلة، ومن ثم تعيين مواقع 4-5 وإعادة التحقق من كل شيء قبل البدء في الحصول على الصور. وبعد ذلك، تجاهل مواقف 1-2.
  6. بدء الحصول على البيانات عن طريق النقر فوق الزر "التسلسل".

3-صورة مرحلة ما بعد المعالجة في إيماجيج

  1. من أجل توليد هايبرستاك التسجيل مجاناً في فيجي15، لقد كتب ماكرو باسم "التنمية المستدامة-TIRF_helper" التي يمكن تطبيقها إلى 2-4 قناة SD-TIRF timelapse مجموعات البيانات. حفظ الملف "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" في فيجي المجلد الفرعي "وحدات الماكرو" ثم تشغيل الماكرو بالنقر فوق أمر القائمة "الإضافات > وحدات الماكرو > تشغيل...".
    1. إذا قنوات اللون بحاجة إلى تصحيح التسجيل، حدد الخيار وإنشاء مرجع تسجيل المستندة إلى حبة جديد (ملف تاريخي) أو استخدام ملف موجود تم إنشاؤه من قبل.
      ملاحظة: سيتم تطبيق البرنامج المساعد توربوريج16 للأسفار الخرز الصور مرجع. قم بتثبيت البرنامج المساعد في البرمجيات فيجي وفقا للمبادئ التوجيهية العامة لعمليات تثبيت البرنامج المساعد.
    2. استيراد البيانات مع المستورد بيو-الأشكال واختيار هايبرستاك كخيار لعرض. تحميل dataset الصورة، حدد SD-السلسلة في الخطوة الأولى، وفي سلسلة TIRF في الخطوة الثانية. فيجي سيتم عرض البيانات حسب موقف القناة والمرحلة، أي تظهر عادة جميع القنوات SD وجميع القنوات TIRF كما هايبرستاك واحدة لكل موقف المرحلة التي تم تحديدها.
      ملاحظة: استيراد البيانات من الممكن من الأنواع المختلفة من الملفات، على سبيل المثال سلسلة TIFF أو ملف تعتمد على منصة أنواع مثل *.nd. لا يمكن التعرف على نوع الملف فقط إذا تم تصديرها لا باقتناء البرمجيات كتنسيق TIFF مستقلة، ضغط أقل.
    3. تطبيق تصحيح التسجيل على القنوات الخاصة بكل منها بتحميل الملف بمعالم محددة سلفا.
    4. حدد جدول البحث عن اللون المطلوب (لوط) لكل قناة SD--و TIRF ودمجها في هايبرستاك واحدة ومتعددة الأبعاد.
      ملاحظة: أثناء معالجة الأقنية TIRF، تتم إضافة عدد z-الطائرات مع قيم الصفر كثافة أعلى أسفل الطائرة التي تتناسب مع عدد الطائرات z في SD dataset. تعد هذه الخطوة هامة لتصور هايبرستاك النهائي. هذه المنهجية الصحيح، منذ عمق الإضاءة TIRF (أقل من 200nm7) أصغر من حجم المكدس SD z-الخطوة (400 نانومتر).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بغية إظهار إمكانيات تصوير SD-TIRF، وضعت تحليل ينبغي أن تكشف عن المنظمة الزمانية مجمعات التصاق الخلايا المصفوفة وتفاعلها مع سيتوسكيليتون خلال الالتصاق الخلوي. ولذلك، تمسكا هيلا أو، بدلاً من ذلك، NIH3T3 تم transfected الخلايا مع يفب-فينكولين وليفياكت طلب تقديم العروض ح 18-24، تريبسينيزيد والمصنف على الزجاج المغلفة فيبرونيكتين أسفل الأطباق. هذه خطوط الخلايا اختيرت cytoskeleton وضوحاً ومتانة أعلى في تجارب التصوير الحي تعارض، على سبيل المثال، الخلايا الأولية. تلك التي قد لا تصمد أمام التصوير ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفي هذه الورقة عرض أول نجاح تنفيذ الفحص المجهري SD و TIRF في تكوين مناسب لإجراء تجارب التصوير خلية حية، أي الحصول على ارتفاع معدلات مثل 2 رصات الصور SD-TIRF في الدقيقة في مرحلة مختلفة 3 تم الحصول على المناصب، المقابلة لمجموعة إطارات 168 (حوالي 3 إطارات في الثانية الواحدة)،. وصف مجاهر SD TIRF القليلة التي كانت سابقا12،13، أساسا من عدم وجود سرعة تصوير عالية بما فيه الكفاية لمتابعة العمليات الخلوية في 3D التي الأزمنة أقل من 2 s كل مكدس الصورة ضروري غالباً. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر كثيرا المجتمع العلمي للجامعة الطبية مركز هامبورغ-ايبندورف لدعم منا مع العينات للتقييم. هي: نحن نشكر "سابين ويندورست" لخلايا NIH3T3، موردورست أندريا يفب-فينكولين ورودولف الإيطاليون لطلب تقديم العروض-ليفيكت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المجهر وملحقاته< قوي>
SD-TIRF مجهرأنظمة Visitron
Ti مع نظام التركيز المثاليالمجهر المقلوبنيكون
CSU-W1 T2يوكوجاواوحدة القرص الغزل في تكوين الكاميرا المزدوجة
iLAS2 & nbsp;روبر ScientificTIRF / FRAP الماسح
الضوئي Evolve PhotometrixEM-CCD
PiezoZ المرحلةLudl المنتجاتالآلية Z المرحلة
الحيوية 2 المرحلة XYLudl المنتجاتالمرحلة XY الآلية
غرفة الحضانة العلويةOkolabخط جريءدرجة الحرارة ، CO2 < / sub > وإمدادات الرطوبة
< قوية > ثقافة الخلية < قوية>
خلايا سرطان عنق الرحم HeLaDSMZACC-57
NIH3T3 الخلايا الليفيةDSMZACC-59
ملحي مخزن للفوسفات من Dulbecco (PBS)Gibco14190144
Trypsin-EDTA 0.05٪Gibco25300054
Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)جيبكو31966-021
أوبتيم جيبكو31985070مصل
متوسط مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)جيبكو10500064
البنسلين / الستربتومايسين (PenStrep)جيبكو15140148
وسط النمو الكامل (DMEM مكمل ب 10٪ FCS و 1٪ PenStrep)
TurboFectThermoFisher ScientificR0531Transfection الكاشف
حمض الأسكوربيك (AA)SigmaA544-25G
لوحة ثقافة الخلايا ذات 6 آبارSarstedt83.392
أطباق القاع الزجاجيMatTekP35G-1.5-10-C35 مم ، غطاء زجاجي 0.17 مم
Fibronectin ، بلازما البقرThermoFisher Scientific33010018
Neubauer غرفة محسنةVWR631-0696
حبات TetraSpeckThermoFisher ScientificT7279
Plasmids< / strong>
RFP-LifeactMaren Rudolph ، معهد علم الأحياء الدقيقة الطبية ، المركز الطبي الجامعي هامبورغ إيبندورف ، ألمانيا
YFP-VinculinAndrea Mordhorst ، معهد علم الأحياء الدقيقة الطبية ، المركز الطبي الجامعي هامبورغ Eppendorf ، ألمانيا
<قوي > البرامج والمكونات الإضافية < / strong>
VisiViewVisitron Systemsالإصدار 3
ImageJالإصدار 1.52c
البرنامج المساعدhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
ماكرو "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"هذا المنشورhttps://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmerالإصدار 6.2.2
حامل كاميرات الإلكترونية الإلكترونية المرحلة محلول متوسط Turboreg

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
  2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  7. Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
  8. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
  9. Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
  10. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  11. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
  12. Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024(2009).
  13. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  14. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  17. Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
  18. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  19. Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
  20. Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
  21. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  22. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  23. Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
  24. Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
  25. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Spinning Disk MicroscopyTIRF MicroscopyLive Cell ImagingAdhesion FormationCytoskeletal NetworkFluorescent ProteinsImage RegistrationMicroscope CalibrationSample PreparationMulti Color Imaging

مقالات ذات صلة