مقالة منهجية

تحديد المناطق الوظيفية البروتين من خلال تشييد البروتين تشيميريك

DOI:

10.3791/58786

⸱

يناير 8, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Cardiac Development and Remodelling, Max Planck Institute for Heart and Lung Research, 2Partner site Rhein-Main, German Centre for Cardiovascular Research (DZHK)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكثيراً ما تمارس البروتينات المرتبطة هيكلياً الوظائف البيولوجية المتميزة. تبادل مناطق ما يعادل هذه البروتينات من أجل خلق البروتينات تشيميريك يشكل نهجاً مبتكراً لتحديد المناطق الحرجة البروتين التي المسؤولة عن الاختلاف الوظيفي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذا البروتوكول يشمل تصميم البروتينات تشيميريك فيها مناطق متميزة من البروتين تحل محلها تسلسل المقابلة في بروتين هيكلياً مشابهة، من أجل تحديد أهمية هذه المناطق الوظيفية. مثل هذه التركيبات يتم إنشاؤها بواسطة بروتوكول PCR متداخلة باستخدام شظايا من الحمض النووي متداخلة والمصممة على نحو كاف الإشعال، متبوعاً بالتعبير عنها ضمن نظام الثدييات لضمان هيكل الثانوية الأصلية والتعديلات بوستترانسلاشونال.

ثم يشار إلى الدور الوظيفي لمنطقة متميزة بفقدان نشاط الوهم في مقايسة قراءات مناسبة. ونتيجة لذلك، يتم تحديد مناطق إيواء مجموعة من الأحماض الأمينية الهامة، التي يمكن أن تكون كذلك فرزهم بتقنيات تكميلية (مثل موقع الموجه الطفرات) لزيادة دقة الجزيئية. على الرغم من أن يقتصر على الحالات التي يمكن العثور على بروتين هيكلياً المتصلة بوظائف مختلفة، البروتينات تشيميريك قد استخدمت بنجاح لتحديد المناطق الحرجة ملزمة في البروتينات مثل السيتوكينات وسيتوكين المستقبلات. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة في الحالات التي لا تكون المناطق الوظيفية للبروتين محددة تحديداً جيدا، ويشكل خطوة أولى قيمة في نهج التطور الموجه لتضييق المناطق ذات الاهتمام وتقليل الجهد الفحص المعنية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تجميع عدة أنواع من البروتينات، بما في ذلك السيتوكينات وعوامل النمو، في أسر أعضاؤها مشاركة هياكل ثلاثية الأبعاد مشابهة ولكن غالباً ما يمارس الوظائف البيولوجية المتميزة1،2. هذا التنوع الوظيفي هو عادة نتيجة للفروق الصغيرة في تكوين الأحماض الأمينية داخل المواقع النشطة للجزيء3. تحديد هذه المواقع والمحددات الوظيفية لا فقط تقدم أفكاراً قيمة تطورية بل أيضا لتصميم أكثر تحديداً يضع ومثبطات4. ومع ذلك، عدد كبير من الاختلافات في تكوين بقايا كثيرا ما وجدت بين البروتينات المرتبطة هيكلياً تعقيد هذه المهمة. على الرغم من أن تشييد المكتبات الكبيرة التي تحتوي على مئات طفرات في الوقت الحاضر ممكناً، تقييم كل الاختلاف بقايا واحد ولا تزال مجموعات منهم صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً جهد5.

تقنيات تقييم أهمية الوظيفية لمناطق كبيرة من البروتين ذات قيمة للحد من العدد البقايا المحتملة إلى الإدارة رقم6وهكذا. وقد البروتينات مبتوراً النهج الأكثر استخداماً لمعالجة هذه القضية. وبناء على ذلك، تعتبر مناطق ذات الصلة الوظيفية إذا تأثرت بحذف المنطقة خاصة7،،من89وظيفة البروتين قيد الدراسة. ومع ذلك، قيداً رئيسيا لهذا الأسلوب أن الحذف يمكن أن تؤثر على هيكل الثانوية للبروتين، مما يؤدي إلى ميسفولدينج والتجميع وعدم القدرة على دراسة المنطقة المقصودة. مثال جيد هو نسخة مقتطعة من oncostatin سيتوكين M (OSM)، الذي درس حذف داخلية أكبر من بقايا 7 أسفرت عن تجمعات متحولة لا يمكن زيادة10.

ويشكل توليد بروتينات تشيميريك نهج البديلة والمبتكرة التي تسمح بتحليل مناطق أكبر من البروتين. والهدف من هذا الأسلوب تبادل المناطق ذات الاهتمام في بروتين بتسلسل يتصل هيكلياً في بروتين آخر، بغية تقييم مساهمة الفروع حل محل للوظائف البيولوجية المحددة. يستخدم على نطاق واسع في مجال إشارات مستقبلات لتحديد المجالات الوظيفية11،12، البروتينات تشيميريك مفيدة بشكل خاص لدراسة البروتين الأسر مع القليل من الأحماض الأمينية الهوية لكن الهيكل الثانوي المصانة. يمكن العثور على أمثلة المناسبة في الفئة من انترلوكين-6 السيتوكينات (إيل-6) نوع، كعامل نيوروتروفيك انترلوكين-6 والهدبيه (6% تسلسل الهوية)13 أو اللوكيميا العوامل المثبطة (LIF) و OSM (هوية 20%)6، الذي ويستند اتباع البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-تصميم البروتين تشيميريك

  1. تحديد بروتين مناسب (المانحين) لتبادل مناطق مع البروتين للفائدة (المتلقي) ينبغي أن يكون البروتين المانحين هيكلياً مشابهة، من الناحية المثالية الذين ينتمون إلى نفس الأسرة البروتين، ولكن تفتقر إلى النشاط البيولوجي لاستخدامها كقراءات. إذا تعرف لا البروتينات المرتبطة هيكلياً، يمكن تحديد المرشحين المحتملين باستخدام أداة مؤتمتة مثل ال14،أداة البحث المحاذاة المتجهات (واسعة)15
    1. الوصول إلى مصرف بيانات البروتين (PDB)16 موقع الأوروبية (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/) وإدخال اسم بروتين الفائدة في مربع البحث في الزاوية العلوية اليمنى، وانقر فوق 'بحث'. شريطة أن تتوفر بنية بلورية، لا إلى أسفل المعرف PDB (PDB معرف؛ مثلاً 1evs ل OSM).
      ملاحظة: إذا لم يتوفر البيانات الهيكلية في PDB، نموذج التماثل من البروتين قد إنشاء بواسطة أداة مثل النموذج السويسري17 بدلاً من ذلك، استخدام البروتوكولات خطوة بخطوة المتوفرة18.
    2. الوصول إلى موقع العظمى (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). في حالة وجود معرف PDB المتوفرة، قم بالتمرير إلى القسم 'استرداد النتائج المحسوبة مسبقاً'، imput PDB المعرف في مربع '"إظهار هياكل مماثلة"ل'، وانقر فوق 'انتقال'. في الشاشة التالية، انقر فوق 'الشاسعة الأصلي' ومن ثم 'السلسلة بأكملها' مشاهدة قائمة بمعرفات PDB للمرشحين المحتملين هيكلياً مشابهة.
      1. إذا كان معرف PDB غير متوفر ولكن تم إنشاء نموذج التماثل، قم بالتمرير لأسفل إلى المقطع 'بحث مع هيكل جديد' وانقر فوق الارتباط 'بحث واسعة'. تحميل ملف PDB النموذج بالنقر فوق 'استعراض' بجوار 'ملف PDB تقدم'، وتحديد الملف والنقر فوق 'إرسال'.
      2. بعد PDB يتم تحميل الملف، انقر فوق الزر 'ابدأ' لبدء حساب الشاسعة. بمجرد يتم إجراء العملية الحسابية، انقر على '"السلسلة بأكملها"' ضمن المجالات لمشاهدة معرفات PDB البروتينات هيكلياً مشابهة.
    3. تقييم الوظائف البيولوجية للفائدة (مثل مستقبلات التنشيط، النشاط الأنزيمي، نشاط عامل النسخ) للمرشحين الأعلى، أما تجريبيا في النظام قراءات الاختيار أو من خلال بحث في الأدب الطبي. تحديد بروتين المانحين مع الدالة المتباينة بالمقارنة مع البروتين للفائدة.
  2. الحصول على سلاسل الأحماض الأمينية البروتين البروتينات المتلقية والمانحة من قاعدة بيانات "مرجع تسلسل" (ريفسيق)19 .
    1. الوصول إلى قسم الجينات في صفحة ويب ريفسيق (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)، واكتب اسم بروتين الفائدة في مربع البحث وانقر فوق 'بحث'. انقر فوق اسم الجينات للأنواع المرغوبة في القائمة الناتجة.
    2. قم بالتمرير لأسفل إلى المقطع ريفسيق لرؤية isoforms جميع موثقة. انقر فوق معرف التسلسل isoform الفائدة (بدءاً من شمال البحر الأبيض المتوسط) وقم بالتمرير لأسفل وانقر على 'الاسطوانات' لتسليط الضوء على منطقة ترميز البروتين من الجينات. في أسفل يمين الشاشة، انقر على 'فاستا' ونسخ التسلسل الجيني.
    3. حفظ تسلسل الحمض النووي باستخدام الحمض مناسبة من برامج تحرير. عند استخدام القرد متاحة بحرية20، افتح البرنامج ولصق تسلسل المنسوخة في المربع فارغاً، حدد اسم تسلسل وانقر فوق 'حفظ'.
      ملاحظة: تكرار الخطوات 1.2.1. إلى 1.2.3. لواحد أو أكثر الجهات المانحة البروتينات المحددة.
  3. اختيار المناطق البروتين لاستبداله في بنيات تشيميريك مختلفة.
    1. تقسيم تسلسل البروتين الفائدة في مناطق هيكلية متميزة. ومن الناحية المثالية، المجالات المختلفة للبروتين في السؤال سوف قد وصفت في الأدب. إذا كان هذا ليس هو الحال، ينبغي تقييم وجود السمات الهيكلية المصانة متميزة (لوالب، الحلقات) في الخطوات 1.3.1.1. ل 1.3.1.4.
      1. تحميل البيانات الهيكلية من البروتين للفائدة من موقع PDB (راجع الخطوة 1.1.1.). الوصول إلى صفحة PDB للبروتين، وتحميل ملف PDB بواسطة النقر فوق 'تحميل' في الجانب الأيمن من الشاشة.
      2. فتح ملف PDB في نظام التصوير جزيئي مثل بيمول (https://pymol.org/). في بيمول، عرض تسلسل النوكليوتيدات (بواسطة النقر فوق عرض > التسلسل في) وإخفاء البيانات الهيكلية الافتراضية (بواسطة النقر فوق ح بجوار معرف PDB، وتحديد 'كل شيء')، وحدد طريقة العرض 'الرسوم المتحركة' تصور واضح الهيكلي للبروتين ميزات (النقر S بجوار معرف PDB، وتحديد 'الرسوم المتحركة').
      3. انقر فوق تسلسل النوكليوتيدات في الجزء العلوي من الشاشة لتسليط الضوء على أجزاء مختلفة من الجزيء، مشيراً إلى انخفاض الأحماض الأمينية المقابلة لكل سمة هيكلية مميزة.
    2. إضافة تعليقات توضيحية مميزة المناطق الهيكلية المتعلقة بتسلسل الحمض النووي في القرد. للقيام بذلك، افتح تسلسل الحمض النووي من الخطوة 1.2.3. وحدد النيوكليوتيدات الترميز للأحماض الأمينية في منطقة، انقر بالزر الأيمن على التحديد وحدد '"ميزة جديدة"' لإعطائها اسم ولون. كرر هذه العملية لكل منطقة الهيكلية التي تم تحديدها في الخطوة السابقة.
      ملاحظة: يمكن أن تخضع النوكليوتيدات التحديد بواسطة النقر فوق Orf > ترجمة، ثم النقر فوق موافق، التأكد من أن أنها رمز للتسلسل الصحيح من الأحماض الأمينية.
    3. قم بمحاذاة تسلسلات بقايا من البروتينات هما استخدام أداة محاذاة بروتين (مثل أوميغا كلوستال21).
      ملاحظة: نظراً للتركيبات يمكن إنتاجها في نظام تعبير الثدييات، ينبغي أن تشمل هذه التسلسلات الببتيدات إشارة للبروتينات.
      1. الحصول على التسلسل الكامل من الأحماض الأمينية البروتينات المانحة والمستقبلة في القرد، عن طريق فتح تسلسل الحمض النووي من الخطوة 1.2.3. وتحديدها والنقر فوق Orf > ترجمة.
      2. الوصول إلى صفحة ويب أوميغا كلوستال (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) و imput سلاسل الأحماض الأمينية البروتينات اثنين، ثم قم بالتمرير لأسفل وانقر فوق 'إرسال'. يجب أن تكون كل تسلسل proceded بخط نص مع '> بروتينامي' يتم التعرف بشكل صحيح...
      3. استرداد ملف المحاذاة بواسطة النقر فوق علامة التبويب 'تحميل ملف محاذاة' وحفظه. يمكن فتح هذا الملف بالنص أي برنامج تحرير.
      4. استخدام ملف محاذاة كمرجع، تعليم المناطق الهيكلية المقابلة من البروتين المانحين في تسلسل الحمض النووي بها (راجع الخطوة 1.3.2.).
    4. تقرر أي مناطق البروتين لتبادل في البروتينات تشيميريك وتصميم في تسلسل النوكليوتيدات المناسبة للتركيبات.
      ملاحظة: نظراً لغياب المعلومات المفصلة بشأن الأهمية الوظيفية لمختلف المناطق، يقترح لتحديد بدائل كبيرة مثل الحلقات كاملة أو لوالب لتقييم أي منها أثرا على وظيفة البروتين. يمكن أن هذه التجربة الاستكشافية الأولى ثم تتبعها جولة ثانية من تصميم البروتين تشيميريك، ركزت على استبدال أصغر داخل المناطق ذات الصلة.
      1. إنشاء نسخة من تسلسل الحمض النووي المشروح من البروتين مستقبلات من الخطوة 1-3-2. وإعادة تسميتها بروتين تشيميريك. فتح تسلسل الحمض النووي الذي تمت إعادة تسميته في القرد، وتحديد وحذف الترميز تسلسل النوكليوتيدات للمنطقة لتبادل، والاستعاضة عنها بالمنطقة المقابلة في البروتين المانحين (نسخ من تسلسل المشروح بإنشائه في الخطوة 1.3.3.)، ثم حفظ التغييرات.
        ملاحظة: إنشاء نسخة جديدة وكرر هذه الخطوة لكل الوهم مختلفة مصممة.

2-الإعداد للاستنساخ الجزيئي

  1. حدد متجه بلازميد مناسبة للتعبير نظام الاختيار. للتعبير الثدييات، ينصح ناقل التعبير عالية مثل بكاجس22 أو سلسلة متجه بكدنا.
    1. لأنزيم التقييد على استنساخ الواضحة في هذا البروتوكول، التأكد من وجود قيود فريدة المواقع الموجودة في الموقع الاستنساخ لأغراض متعددة (MCS) لمكافحة ناقلات متوافقة مع البروتين للفائدة. للقيام بذلك، افتح تسلسل الحمض النووي من بنيات تشيميريك مع القرد، انقر فوق 'الإنزيمات > إنزيم محدد' والتحقق من أن اثنين على الأقل من مواقع تقييد في الإشراف غائبة في التسلسل (عرض صفر بجوار اسمها).
  2. تصميم كبسولة تفجير المحطة الطرفية باستخدام محرر الحمض النووي مثل القرد.
    1. إنشاء ملف جديد في الحمض النووي (ملف > جديد) والشروع في التمهيدي الطرفي ن مع تسلسل زعيم (3-9 إضافية الأزواج الأساسية، مثل آآغغاا)، يليه موقع القيد الأول المحدد في الإشراف ناقلات (6-8 أزواج حقيرة، مثل تاتا باشي)، فاصل اختياري (مثل جكتاجكجكاتكجككاكك في ناقلات بكاجس المستخدمة في المثال) وأزواج قاعدة أولية 18-27 من الجينات للفائدة (مثلاً أتججججتاكتجكتكاكاكاجاجاكج ل OSM).
    2. في ملف الحمض النووي جديد، يبدأ التسلسل التمهيدي ج-الطرفية النهائية 18-27 قاعدة أزواج من الجينات للفائدة (مثلاً كتكجاجكاككاككاككاككاككاكتجا لجين مع علامة ج-محطة 6xHistidine)، متبوعاً مباعدة اختيارية (مثل تاجكجككجك في ناقل بكاجس)، تقييد الثاني الموقع المختار (مثلاً جكجكجكك للإداريين) وتسلسل زعيم (مثل آآغغاا). تسليط الضوء على التسلسل الكامل، انقر بالزر الأيمن وحدد 'عكس-تكملة' للحصول على التمهيدي عكس.
  3. تصميم كبسولة تفجير لكل منطقة من المناطق الحدودية في بنيات تشيميريك.
    1. فتح تسلسل الحمض النووي من الوهم (تم إنشاؤه في الخطوة 1.3.4.1.) وتسليط الضوء على منطقة 30 زوج قاعدي في المنطقة التي تكون فيها التسلسل الأصلي وإدراج جهة اتصال، تضم 15 من أزواج قاعدة لكل تسلسل. نسخ المنطقة (بزر الماوس الأيمن واختر 'نسخ') ولصقه في ملف الحمض النووي جديدة؛ وسوف يكون هذا التسلسل التمهيدي إلى الأمام.
    2. عمل نسخة من التمهيدي إلى الأمام التي تم إنشاؤها في السابق خطوة وتسميته كعكس التمهيدي. تسليط الضوء على تسلسل التمهيدي، انقر بالزر الأيمن وحدد 'عكس-تكملة' لإنشاء تسلسل عكس التمهيدي.
    3. كرر الخطوات 2.3.1. و 2.3.2. لكل منطقة الاتصال في تسلسل الحمض النووي تشيميريك. عموما، مجموعتين من الإشعال إلى الأمام/عكس مطلوبة لتوليد الوهم واحد، ما لم يحدث الاستبدال على الطرفي ن أو المناطق الطرفية ج.
  4. ترتيب الإشعال المحطة الطرفية والداخلية من موفر توليف اليغنوكليوتيد.
    ملاحظات: عالية باستخدام تنقية كبسولة تفجير المحطة الطرفية (مثل تنقية [هبلك]) يمكن أن يكون لها أثر إيجابي في نسبة النجاح للبروتوكول. ديسالتيد كبسولة تفجير الداخلية تنص عادة على نتائج جيدة.
  5. الحصول على قالب تسلسل المورثات المانحة والمستقبلة.
    ملاحظة: تستخدم البلازميدات التي تحتوي على إطارات القراءة المفتوحة (Orf) هذه التسلسلات كقالب إلى حد كبير يسهل الإجراءات وينصح. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الحمض النووي التكميلية (كدنا) التي تم إنشاؤها من خط خلية معروفة للتعبير عن هذه الجينات كقالب للخطوات اللاحقة.

3-بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) التضخيم أجزاء الحمض النووي الفردية تشكل الوهم

  1. إعداد أن خليط تفاعل PCR فردية لكل أجزاء تأليف البروتين تشيميريك. بروتين تشيميريك نموذجي سيتطلب ثلاثة أجزاء فردية: الجزء الطرفي ن والمنطقة المراد إدراجها والجزء جيم--المحطة الطرفية.
    ملاحظات: استخدام عالية دقة بوليميريز الحمض النووي (مثل فوسيون عالية الدقة دنا بوليميريز) لتجنب إدخال طفرات في التسلسل. يمكن إعداد في المساء تفاعل PCR وتشغيل بين عشية وضحاها.
    1. مجموعة 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب على الجليد وبيبيت الكواشف المختلفة من الخلائط PCR بالترتيب الموضح في الجدول 1، ضمان الإشعال الصحيحة وتستخدم قوالب لكل تفاعل PCR (انظر الجدول 2).
    2. تسمية أنابيب PCR رقيقة الجدران 0.2 مل اثنين لكل رد فعل، ونقل 20 ميليلتر من خليط PCR المقابلة في كل أنبوبة. نقل أنابيب PCR في ثيرموسيكلير بكر والشروع في البروتوكول بالتفصيل في الجدول 3.
      ملاحظة: الصلب درجة الحرارة يجب أن تكون على الأقل 5 درجات أقل من درجة حرارة انصهار كبسولة تفجير تصميم.
  2. بينما يعمل بكر، إعداد 100 مل من 1% [اغروس] هلام في المخزن المؤقت تريس-خلات-يدتا (تاي). لهذا الغرض، تزن 1 غرام من [اغروس] وتخلط مع 100 مل من المخزن المؤقت تاي في قارورة زجاج والميكروويف حتى تماما يذوب في [اغروس]، يحوم قارورة كل 30-40 ثانية. السماح للتبريد إلى حوالي 50 درجة مئوية وإضافة 2-3 ميليلتر اثيديوم بروميد (أو ما يعادل صبغ الحمض النووي) وصب في علبة جل مع امشاط جيدا المطلوب.
    تنبيه: اثيديوم بروميد مطفر معروفة، وضمان استخدام المعدات الواقية المناسبة.
  3. بعد الانتهاء من تفاعل PCR، إضافة ميليلتر 4 6 x الحمض النووي تحميل المخزن المؤقت في كل أنبوبة. إدراج 1% [اغروس] هلام في وحدة التفريد، وتغطي مع تاي المخزن المؤقت وتحميل العينات بعناية في جل جنبا إلى جنب مع سلم وزن الجزيئي.
    ملاحظة: في وقت التحميل، الأفضل أن تترك فارغة الممرات بين العينات لتسهيل استرداد الحمض النووي بعد ذلك.
  4. تشغيل الجل الخامس 80-120 ل 20-45 دقيقة.
    ملاحظة: عادة ما تكون اليكتروفوريسيد عصابات تحت 000 1 قاعدة زوج إلا في حوالي 20 دقيقة في 120 الخامس، بينما أكبر العصابات سوف تتطلب وقت أطول لتشغيل.
  5. إيقاف تشغيل وحدة التفريد وتأخذ بها [اغروس] هلام وتصور العصابات تضخيم الحمض النووي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. باستخدام شفرة حلاقة، قطع أجزاء الحمض النووي الفردية من الهلام، ونقلها إلى المسمى 2 مل [ميكروفوج] أنابيب.
    ملاحظة: تقليل زمن التعرض للأشعة فوق البنفسجية تفاديا لضرر الحمض النووي.
  6. استخدام بكر تنظيف كيت (انظر الجدول للمواد) لتنقية الحمض النووي أجزاء مختلفة.
    1. إضافة 500 ميليلتر نتي المخزن المؤقت المقدمة من عدة لكل أنبوبة تحتوي على جزء هلام. نقل إلى ثيرموميكسير في 50-55 درجة مئوية وتهتز عند 1000 دورة في الدقيقة حتى يذوب الجل تماما في المخزن المؤقت.
    2. نقل كل حل لعمود مجموعة مسماة وتدور في ميكروسينتريفوجي (30-60s، س 11,000 ز) وتجاهل في فلووثرو. إضافة 700 ميليلتر الطقم NT3 يغسل المخزن المؤقت والطرد المركزي مرة أخرى تحت نفس الإعدادات وتجاهل في فلووثروغ. الطرد المركزي أعمدة 1-2mins في 11,000 س ز لتجفيف الغشاء والسليكا داخل العمود مرة أخرى.
    3. نقل العمود إلى أنبوب [ميكروفوج] مسمى 1.5 مل، بيبيت 30 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس في العمود، اسمحوا الوقوف لمدة دقيقة واحدة والطرد المركزي 30-60s في 11,000 س ز الوت الحمض النووي.
  7. تحديد مقدار الحمض النووي استردادها عن طريق قياس امتصاص العينة في 260 nm و 340 نانومتر في جهاز المطياف الضوئي (انظر الجدول للمواد). يتم حساب تركيز الحمض النووي عن طريق طرح القراءة نانومتر 340 من الرقم 260 شمال البحر الأبيض المتوسط، ثم ضرب النتيجة بالحمض النووي للانقراض معامل (50 ميكروغرام/مل)23.
    ملاحظات: قياسات إضافية في 230 نيوتن متر و 280 نانومتر تسمح لتقييم درجة نقاء الحمض النووي: 260/280 و 260/نسب 230 أعلاه 1.8 تعتبر عموما نقية للحمض النووي. يمكن أن يكون مؤقتاً على البروتوكول بعد هذه الخطوة، تخزين الحمض النووي التيد في 4 درجات مئوية (قصيرة الأجل) أو-20 درجة مئوية (طويلة الأجل).

4-[بكر] تضخيم لإنشاء تسلسل الحمض النووي تشيميريك

  1. إعداد 50 ميليلتر من فعل PCR للصمامات مكونات منفصلة الوهم. اتبع نفس الخطوات بالتفصيل في 3.1، توظف الإشعال الطرفي ن والمحطة الطرفية ج جنبا إلى جنب مع 10 نانوغرام لكل من الحمض النووي عدد الأجزاء التي تم الحصول عليها في الخطوة 3، 7.
    ملاحظة: يمكن تعيين في المساء تفاعل PCR وتشغيل بين عشية وضحاها.
  2. كرر الخطوات من 3.2 إلى 3.7 لاسترداد وتحديدها كمياً بلغة الحمض النووي المنقاة في 30 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس. يحتوي هذا الجزء على تسلسل الحمض النووي تشيميريك، يحف به تقييد المواقع المدرجة في كبسولة تفجير المحطة الطرفية.

5-إدخال الحمض النووي تشيميريك في متجه التعبير

  1. تسمية اثنين 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب وبيبيت الكواشف مختلفة في الترتيب المبين في الجدول 4، إضافة 1 ميكروغرام للتعبير المحدد الموجه في أنبوب واحد و 1 ميكروغرام الجزء الحمض النووي المستردة في الآخر. احتضانها ح 1-4 في 37 درجة مئوية لأداء الهضم مع إنزيمات التقييد الذي تم اختياره.
    ملاحظات: تكفل كل إنزيمات التقييد متوافقة مع المخزن المؤقت المستخدمة. في حالة أنها تتطلب مخازن مختلفة تماما، تنفيذ هذه الخطوات أولاً مع واحد فقط من الإنزيمات وتكرار. الوقت اللازم الهضم يمكن أن تختلف تبعاً للإنزيمات القيد المحدد: الرجوع إلى إرشادات الشركة المصنعة للحصول على معلومات مفصلة.
  2. كرر الخطوات من 3.2 إلى 3.7 لتنقية واسترداد ناقلات يفتت والتعبير الحمض النووي هضمها في 30 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس. تحديد مقدار الحمض النووي استردادها كما كان من قبل.
  3. حساب كمية الحمض النووي إدراج المطلوبة لنسبة 3:1 إدراج/ناقل مولى في رد فعل ربط، باستخدام المعادلة التالية.

    إدراج (الحرس الوطني) = نسبة المولى * المتجهات (الحرس الوطني) * أدخل الحجم (bp)/ حجم ناقلات (bp)

    ملاحظة: نسب المولى إدراج/ناقلات مختلفة يمكن اختبارها، على الرغم من أن عادة كافية للحصول على نتائج كافية بنسبة 3:1.
  4. قم بإعداد 20 ميليلتر من فعل ربط في أنبوب [ميكروفوج] 1.5 مل مع 40 نانوغرام التعبير متجهة كمية الحمض النووي تشيميريك المحسوبة في الخطوة 5، 3 والمخزن المؤقت ليجاسى T4 الحمض النووي بعد الترتيب المبين في الجدول 5، واحتضان بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
    ملاحظة: عموما هو زيادة كفاءة عملية ربط بالقيام برد فعل بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية، ولكن بدلاً من ذلك يمكن المحتضنة رد فعل ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
  5. تحويل 5-10 ميليلتر من خليط ربط إلى كيميائيا المختصة الإشريكيّة القولونية (كولاي) أعدت عقب البروتوكولات القياسية24 تنمو في لوحات مختارة، واختيار واحدة من مستعمرات للتوسع وبلازميد الحمض النووي العزل وفقا للبروتوكولات المعمول بها25.
    ملاحظة: سلالة كولاي XL1 الأزرق تم توظيفهم لهذا البروتوكول، ولكن يمكن أيضا استخدام متغيرات أخرى كولاي .
  6. هضم 1 ميكروغرام والبلازميدات معزولة مع إنزيمات التقييد المناسب اتباع الإرشادات التي تظهر في الخطوة 5، 1، وتقييم وجود عصابة الحمض النووي من حجم المقابلة للتسلسل تشيميريك بالتفريد في [اغروس] هلام (انظر خطوات 3.2 3.5).
    ملاحظة: من المستحسن أن يتم التحقق من التسلسل المدرج عن طريق خدمة تسلسل الحمض النووي.
  7. عند التحقق من تسلسل ناجحة، يمكن أنتجت بكميات أكبر البلازميدات وتستخدمهم في نظام تعبير الثدييات التالية بروتوكولات راسخة26،27.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وسوف تجسد البناء وتوليد بروتين تشيميريك (الشكل 1) مع اثنين من أعضاء الأسرة سيتوكين انترلوكين-6، OSM وليف، والتي كانت موضوع دراسة نشرت مؤخرا6. ويبين الشكل 2 هيكل ثلاثي الأبعاد لهذه البروتينات. كلا جزيئات اعتماد هيكل الثانوية المميزة لفئة أنا السيتوكينات، مع أربعة لوالب (يطلق عليه أ إلى د) معبأة في حزمة، وانضم إليها الحلقات28. هياكل الانحياز من الأحماض الأمينية البروتينات البشرية يتبي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكل توليد بروتينات تشيميريك تقنية متعددة الاستعمالات، وقادرة على تجاوز حدود البروتينات مبتوراً بمعالجة مسائل مثل الجزئية سيتوكين-مستقبلات ملزم المجالات13. تصميم التركيبات هو خطوة أساسية في هذا النوع من الدراسات، ويتطلب دراسة متأنية. الدراسات الأولية إنشاء مجالات وظيفية عموما سيتطلب الاستعاضة عن مناطق واسعة في مرحلة أولى، بينما البدلاء أصغر من الأطوال المتغيرة أكثر ملاءمة لدراسات تفصيلية لمنطقة واحدة. ينبغي إيلاء اهتمام خاص لوجود زخارف المصانة الصغيرة داخل أسرة بروتين في هذه الخطوة، إذ كثيرا ما ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أيد هذا العمل جمعية ماكس بلانك، و Schüchtermann-العيادة (روثينفيلدي سيئة، ألمانيا). وكان نشر جزء من هذه البحوث في "مجلة الكيمياء البيولوجية". أدريان-سيغارا، ج. م. شندلر، نون، جاجودا، ص، Lörchner، حاء، براون، ت. & Pöling، ج. حلقة AB ود-الحلزون في ربط الموقع الثالث من م Oncostatin البشرية (OSM) مطلوبة من أجل تنشيط مستقبلات OSM. ج. محاضرة الكيمياء عام 2018؛ 18:7017-7029. © المؤلفين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Labcycler thermocyclerSensoquest011-103يمكن استخدام أي آلة تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية لتنفيذ هذا البروتوكول
NanoDrop 2000c UV-Vis مقياس الطيف الضوئيThermoFisher ScientificND-2000C & nbsp ؛قياس الحمض النووي
سلم الحمض النووي GeneRuler 100 نقطة أساسسلم الحمض النووي ThermoFisher ScientificSM0241
GeneRuler سلم مزيجسلم الحمض النووي ThermoFisher ScientificSM0331
إنزيم تقييد AscIنيو إنجلاند بيولابيسR0558
إنزيم تقييد PacIنيو إنجلاند بيولوجيزR0547
فوسيون هوت ستارت II بوليميراز الحمض النوويThermoFisher ScientificF-549S
مجموعة dNTP (100 ملم)Invitrogen10297018
T4 DNA ligasePromegaM1804
NucleoSpin Gel ومجموعة تنظيف PCRMacherey-Nagel740609
MGC Human LIF Sequence-Sequence-Verified (CloneId: 7939578) ، مخزون الجلسرينThermoFisher ScientificMHS6278-202857165
LE agaroseBiozym840004
الاشعالSigma-Aldrichطلب مخصص
الإنسان Oncostatin M cDNAهدية للدكتور هايكه هيرمانز (قسم أمراض الكبد ، المستشفى الجامعي W & uuml; rzburg, Germany) 
متجه pCAGGS مع مواقعهدية الدكتور أندر & eacute; شنايدر (معهد ماكس بلانك لأبحاث القلب والرئة ، باد نوهايم ، ألمانيا)
تقييد PacI و AscI

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
  2. Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
  3. Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
  4. Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
  5. Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787(2017).
  6. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
  7. Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
  8. Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
  9. Kim, K. -W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
  10. Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
  11. Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
  12. Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
  13. Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
  14. Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
  15. Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, Database issue 297-303 (2014).
  16. Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980(2003).
  17. Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 252-258 (2014).
  18. Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
  19. Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
  20. Davis, M. W. ApE, A Plasmid Editor. , Available from: http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ (2018).
  21. Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539(2011).
  22. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  23. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351(2018).
  27. Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
  28. Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
  29. Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
  30. Huyton, T., Zhang, J. -G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
  31. Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
  32. Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82(2015).
  33. McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
  34. Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
  35. Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
  36. Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
  37. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  38. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  39. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA

مقالات ذات صلة