مقالة منهجية

عزل ووصف البشرية المستمدة من الحبل السري الخلايا الجذعية الوسيطة من الخدج والرضع الناضجين

DOI:

10.3791/58806

⸱

يناير 26, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2Department of Pathology, Kobe Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, Hyogo College of Medicine, 4Department of Developmental Pediatrics, Shizuoka Children's Hospital, 5Department of Pediatrics, Nihon University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحبل السري البشري (UC) يمكن الحصول عليها خلال فترة ما حول الولادة نتيجة للأجل قبل الأوان، ومن بوستتيرم التسليم. في هذا البروتوكول، يصف لنا بعزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إمكانيات علاجية كبيرة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) وجذب اهتمام متزايد في مجال الطب الحيوي. MSCs هي أصلاً معزولة تتسم من نخاع العظم (بي أم)، ثم اكتسبت من الأنسجة بما في ذلك الأنسجة الدهنية والزليلي، والجلد، ولب الأسنان والملاحق الجنينية مثل المشيمة، دم الحبل السري (UCB)، والحبل السري (UC). MSCs عدد سكان خلية غير متجانسة مع القدرة على (1) التمسك بالبلاستيك في ظروف الثقافة القياسية، علامة (2) سطح التعبير عن CD73+/CD90+/CD105+/CD45/CD34––/CD14/CD19– تعمل/HLA-DR– –، والتمايز تريلينيجي (3) في adipocytes، أوستيوسيتيس، وتشوندروسيتيس، التي حددها "المجتمع الدولي" حاليا للعلاج الخلوي (إيست). على الرغم من أن بي أم هو المصدر الأكثر استخداماً من MSCs، طبيعة الغازية تطلع BM أخلاقيا يحد إمكانية الوصول إليها. قدرة الانتشار والتفرقة من MSCs التي تم الحصول عليها من BM الانخفاض عموما مع سن الجهة المانحة. وفي المقابل، الجنين MSCs التي تم الحصول عليها من جامعة كاليفورنيا بمزايا مثل انتشار قوي وقدرة التمايز. هناك لا قلق أخلاقية لأخذ العينات من جامعة كاليفورنيا، كما أنها تعتبر عادة النفايات الطبية. تفرد الإنسان يبدأ مع استمرار نمو تجويف السلي في 4-8 أسابيع الحمل ويبقى المتزايد حتى وصلت إلى 50-60 سم في الطول، وأنها يمكن أن تكون معزولة أثناء فترة أسرة الوليد تسليم. إلى التبصر في الفسيولوجيا المرضية للأمراض المستعصية، وقد استخدمنا MSCs المستمدة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الرضع وألقى في الإعمار الحملية المختلفة. في هذا البروتوكول، يصف لنا بعزل وتوصيف UC-MSCs من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي أصلاً معزولة وتتميز من نخاع العظم (بي أم)1،2 ولكن يمكن أيضا الحصول على مجموعة متنوعة من الأنسجة بما في ذلك الأنسجة الدهنية والزليلي، والجلد، ولب الأسنان وملحقات الجنين 3-MSCs هي المعترف بها كمحتوى خلية غير متجانسة التي يمكن أن تنتشر وتفرق في adipocytes وأوستيوسيتيس وتشوندروسيتيس. وباﻹضافة إلى ذلك، MSCs تمتلك القدرة على الهجرة إلى مواقع الإصابة وقمعها وتعدل الاستجابات المناعية، وإعادة تشكيلها، وإصلاح الضرر. حاليا، MSCs من مصادر مختلفة وقد اجتذبت اهتمام متزايد كمصدر للخلايا العلاج ضد عدد من الأمراض المستعصية، بما في ذلك الاختلاس – مقابل – المضيف المرض واحتشاء عضلة القلب، واحتشاء دماغي4،5 .

على الرغم من أن بي أم هو المصدر الأكثر تميز جيدا من MSCs، اختزاع تطلع BM أخلاقيا يحد من إمكانية الوصول إليها. قدرة الانتشار والتفرقة من MSCs التي تم الحصول عليها من BM الانخفاض عموما مع سن الجهة المانحة. وفي المقابل، MSCs الأجنة التي تم الحصول عليها من الملاحق الجنينية مثل المشيمة، دم الحبل السري (UCB)، ويكون الحبل السري (UC) المزايا بما في ذلك الشواغل الأخلاقية أقل فيما يتعلق بانتشار أخذ العينات وقوية وتمايز القدرات6 , 7-بين الجنين الملاحق التي عادة ما يتم إهمالها كالنفايات الطبية، UCB وتفرد تعتبر جهازا للجنين، في حين تعتبر المشيمة فيتوماتيرنال. وبالإضافة إلى ذلك، تحتاج المشيمة و UCB أخذ عينات منها وجمعها في هذه اللحظة الدقيقة من تسليم الأطفال حديثي الولادة، بينما المشيمة وتفرد يمكن جمعها ومعالجتها بعد الولادة حديثي الولادة. تبعاً لذلك، تفرد مصدرا واعداً من لجنة السلامة البحرية لخلية العلاج8،9.

تفرد الإنسان يبدأ تطوير مع التوسع التدريجي في تجويف السلي في 4-8 أسابيع الحمل وما زال ينمو حتى 50-60 سم في الطول، ويمكن أن تكون معزولة خلال كامل فترة الوليد تسليم10. إلى التبصر في الفسيولوجيا المرضية للأمراض المستعصية، ونحن استخدام MSCs المستمدة من جامعة كاليفورنيا (UC-MSCs) من الرضع في مختلف الإعمار الحملية11،12. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية عزل وتوصيف UC-MSCs من الأجنة/الرضع في 19-40 أسبوعا من الحمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام العينات البشرية لهذه الدراسة كانت أقرتها اللجنة الأخلاقية من "كوبي خريج كلية الطب بجامعة" (الموافقة رقم 1370 و 1694) وتجري وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.

1-العزلة وثقافة UC-MSCs

ملاحظة: جامعة كاليفورنيا-MSCs قد تم عزل بنجاح، مثقف، والموسعة (أكثر من الممر رقم 4) من أكثر من 200 UCs تعرضوا لهذا البروتوكول. من بين أكثر من 200 UCs، أظهرت 100 ٪ ناجحة UC-ماجستير العزلة، أقل من 5% قد أظهرت تلوث عرضي، أقل من 15% وقد أظهرت القبض على النمو، وأكثر من 80% وقد أظهرت نجاح UC-ماجستير التوسع.

  1. جمع UC.
    1. إعداد أنبوب بلاستيكي 50 مل، وتعديل مقص العقيم، وزجاجة 500 مل من ألفا المتوسطة النسر الأساسية الدنيا (ألفا MEM) في 4 درجات مئوية.
    2. أسيبتيكالي قطع الاتصالات الموحدة مع مقص جراحي في حوالي 5-10 سم في الطول وجمع قريبا بعد الولادة حديثي الولادة بالعملية القيصرية.
    3. فورا مكان في جامعة كاليفورنيا في أنبوب بلاستيكي 50 مل وإضافة 20-30 مل ألفا MEM في الأنبوب.
    4. تخزين في جامعة كاليفورنيا في درجة حرارة الغرفة (RT) إلى حين نقلها إلى المختبر.
      ملاحظة: يمكن تخزين UC العقيم في المتوسط خالية من المصل في RT لمدة تصل إلى 2 يوما. ولذلك، يمكن جمعها جامعة كاليفورنيا التي تم الحصول عليها من المستشفيات المجاورة إذا كان يتم إرسالها إلى المختبر خلال يومين.
  2. تشريح جامعة كاليفورنيا.
    1. إعداد علبة بلاستيكية، معقمة المقص والملقط، ماصات 10 مل, 25 مل الممصات، اثنين الأطباق 60 ملم زراعة الأنسجة، الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ويمزج إنزيم المنقي (انظر الجدول للموادوتشكيلها مع PBS العقيمة في تركيز 13 Wünsch وحدة/مل وتخزينها في-80 درجة مئوية)، وزجاجة 500 مل من المصل انخفاض المتوسط (انظر الجدول للمواد).
    2. الاحماء في برنامج تلفزيوني، إنزيم المنقي يمزج، وخفضت مصل المتوسطة، والمتوسطة الثقافة [ألفا MEM تحتوي على 10% الجنيني البقري المصل (FBS) وحل مضاد حيوي فطري 1% (أإ) المخزنة في 4 درجات مئوية] إلى الرايت
    3. إخراج UC من الأنبوب ثم ضعه في علبة بلاستيكية.
    4. تزن وتشريح 5 غ من جامعة كاليفورنيا مع مقص معقم.
    5. صب 10 مل إيثانول 70% على تفرد للتعقيم باستخدام ماصة 10 مل.
    6. أغسل UC مع 10 مل من برنامج تلفزيوني مرتين باستخدام ماصة 10 مل.
    7. ضع تفرد في طبق زراعة أنسجة معقمة 60 مم (انظر الشكل 1، الخطوة 1).
    8. أضف 10 مل من المصل انخفاض المتوسط إلى الطبق.
    9. إضافة 0.5 مل مزيج إنزيم المنقي للوصول إلى تركيز نهائي لنحو 0.62 Wünsch وحدة/مل.
      ملاحظة: استخدام إنزيم المنقي يمزج بدلاً من كولاجيناز التقليدية قد ثبت أن تحسين الغلة واستمرارية UC-MSCs المعزولة من جامعة كاليفورنيا.
    10. قطع جامعة كاليفورنيا إلى قطع 2-3 مم مع تعقيم المقص والملقط (انظر الشكل 1من الخطوة 2).
      ملاحظة: وتستغرق هذه العملية حوالي 30 دقيقة.
    11. احتضان قطع الاتصالات الموحدة على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حاضنة2 CO 5%.
    12. قص القطع UC هضمها جزئيا إلى أجزاء أصغر التي تتدفق بسهولة عن طريق ماصة 25 مل.
      ملاحظة: وتستغرق هذه العملية حوالي 30 دقيقة.
    13. احتضان القطع UC أصغر في 37 درجة مئوية لمدة 15-45 دقيقة في حاضنة2 CO 5%.
      ملاحظة: الحضانة يحتاج إلى أن يستمر هوموجيناتيس تصبح لزج. لقد حان وقت الهضم مجموع ما يقرب من 120 دقيقة. في حالة استخدام UCs من الخدج، ومع ذلك، وقت الهضم يمكن اختصارها نظراً لأن تلك هي سهولة قص وهضمها.
  3. عزل UC-MSCs.
    1. إعداد أربعة أنابيب بلاستيكية 50 مل و 500 مل زجاجة متوسطة الثقافة.
    2. تقسيم هوموجيناتي جامعة كاليفورنيا إلى اثنين من أنابيب بلاستيكية 50 مل باستخدام ماصة 25 مل، مع ما يقرب من 7.5 مل في كل أنبوبة.
    3. إضافة 20 مل متوسطة الثقافة في كل أنبوب ومزيج جيد.
    4. تصفية كل هوموجيناتي من جامعة كاليفورنيا من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر وضعت على رأس أنبوب جمع 50 مل جديدة، باستخدام ماصة 25 مل لجمع الخلايا المستمدة من جامعة كاليفورنيا.
      ملاحظة: وتستغرق هذه العملية حوالي 15 دقيقة بكل منهما، كما مثبت حل UC هضمها.
    5. الطرد المركزي أنبوبين في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق.
    6. نضح المادة طافية وتخلص منه بعناية.
    7. ريسوسبيند الكريات الخلية في أنبوبين مع 5 مل من الثقافة المتوسطة.
    8. نقل تعليق خلية إلى لوحات 60 ملم الجديدة والثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5% (انظر الشكل 1من الخطوة 3).
  4. الثقافة UC-MSCs.
    1. الاحماء في برنامج تلفزيوني، التربسين-يدتا (0.25 w/v%)، والثقافة المتوسطة (ألفا MEM التي تحتوي على 10% FBS و 1% AA) إلى الرايت
    2. عندما خلايا متصلة لوح 60 ملم, إزالة المتوسطة الثقافة وتغسل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني مرتين لإزالة الحطام وخلايا الدم الحمراء.
      ملاحظة: عادة ما تظهر الخلايا المرفقة في 3-5 أيام بعد الطلاء الأولى (انظر الشكل 1من الخطوة 4).
    3. استبدال ثقافة المتوسط مرتين في الأسبوع واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة حتى كونفلوينسي 90-100%.
      ملاحظة: وهذا عادة ما يستغرق 7-14 يوما بعد الطلاء الأولى.
    4. تغسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني مرتين وإضافة 0.5 مل يدتا التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
    5. عندما الخلايا تصبح تقريب ومنفصلة، إضافة 9 مل من الثقافة المتوسطة ومزيج جيد لإلغاء تنشيط التربسين.
    6. نقل تعليق خلية إلى لوحات 100 ملم الجديدة والثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5% (انظر الشكل 1، الخطوة 5).
    7. استبدال ثقافة المتوسط مرتين في الأسبوع واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة حتى كونفلوينسي 90-100%.
      ملاحظة: وهذا عادة ما يستغرق 4-8 أيام بعد الطلاء الأولى.
    8. تغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني مرتين وإضافة 1 مل من التربسين-يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
    9. عندما الخلايا تصبح تقريب ومنفصلة، إضافة 9 مل من الثقافة المتوسطة ومزيج جيد لإلغاء تنشيط التربسين.
    10. نقل تعليق خلية في اثنين اللوحات الجديدة 100 مم والثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5% (انظر الشكل 1، الخطوة 5).
    11. كرر ثقافة فرعية (تقسيمات 1:2) حتى سن العاشرة (انظر الشكل 1، الخطوة 5).
      ملاحظة: لأن الخلايا المزروعة تحت شروط أقل المتلاقية تميل إلى التوصل إلى توقيف انتشار سابق، من المهم أن خلايا المرور بنسبة 1:2 تقسيم.
    12. استخدام الخلايا في سن الخامسة إلى الثامنة للخلية علامة سطحية التحليل وخلية تحليل التمايز وتجارب أخرى.
      ملاحظة: للحفاظ على انتشار قوي لأطول فترة ممكنة، تستزرع خلايا عموما تحت أكثر من ظروف المتلاقية 70-80%.

2-العلامة سطح التعبير عن UC-MSCs

  1. إعداد الخلايا في صفيحة 100 مم وننأى بها مع 1 مل من التربسين-يدتا في 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
  2. إضافة مل 9 الثقافة المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق.
  3. نضح المادة طافية وتجاهل ذلك.
  4. ريسوسبيند الكريات الخلية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز للحد الأدنى 5 كرر هذه الخطوة الغسيل مرتين.
  5. ريسوسبيند الخلايا مع التدفق الخلوي (FCM) المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني يتضمن يدتا 2 مم وكاشف حظر 10%) في ~ 1 × 106 خلايا/مل.
  6. نقل 50-100 ميليلتر من تعليق خلية في أنبوب 1.5 مل؛ إضافة فيكوريثرين (PE)-مترافق الأجسام المضادة ضد CD14، CD19، CD34، CD45، CD73، CD90، CD105، أو هلا-الدكتور؛ واحتضان على الجليد لمدة 45 دقيقة.
  7. أغسل الخلايا مع FCM المخزن المؤقت مرتين وإضافة 50-100 ميليلتر من 0.2% صلاحية صبغ الحل (انظر الجدول للمواد).
  8. احتضان على RT لمدة 15 دقيقة ويغسل خلايا مع المخزن المؤقت FCM مرتين وتصفية الخلايا عن طريق مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
  9. تشغيل الخلايا عن طريق FCM وتحليل النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام البرمجيات FCM وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.

3-تريلينيجي التفريق بين UC-MSCs

  1. أداء أديبوجينيسيس.
    1. إعداد تعليق خلية في المتوسط الثقافة بتركيز3 5 × 10 خلايا/مل.
    2. بلايت 1 مل تعليق خلية في صفيحة 12-جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة ح ~ 24.
    3. استبدال الثقافة المتوسطة بمتوسطة التمايز أديبوجينيك (انظر الجدول للمواد)، واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لمدة 2-3 أسابيع. تغيير متوسطة التمايز أديبوجينيك مرتين في أسبوع.
    4. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    5. احتضان خلايا في 4% فورمالدهايد الحل لمدة 30 دقيقة في الرايت
    6. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات والايزوبروبانول 60% ثلاث مرات.
    7. إعداد 0.5% زيت أحمر س الحل بتذويب ملغ 84 من النفط س أحمر في 10 مل من الكحول 100% وأضاف مل 6.7 من الماء المقطر. وصمة عار الخلايا مع 1 مل من الزيت الأحمر 0.5% O الحل في RT لمدة 20 دقيقة.
    8. غسل الخلايا بالكحول 60% ثلاث مرات وتصور تحت مجهر.
  2. أداء تكون العظم.
    1. إعداد تعليق خلية في المتوسط الثقافة بتركيز 1 × 104 خلايا/مل.
    2. بلايت 1 مل تعليق خلية في صفيحة 12-جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة ح ~ 24.
    3. استبدال الثقافة المتوسطة بمتوسطة التمايز أوستيوجينيك (انظر الجدول للمواد)، واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لأسابيع 1-2. تغيير متوسطة التمايز osteogenic مرتين في أسبوع.
    4. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    5. احتضان خلايا في 4% فورمالدهايد الحل لمدة 30 دقيقة في الرايت
    6. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    7. إعداد الأليزارين الأحمر 2% S الحل عن طريق تذويب 200 مغ اليزارين الأحمر S مع 10 مل ماء المقطر. وصمة عار الخلايا مع 1 مل من الأليزارين الأحمر 2% S الحل في RT لمدة 3 دقائق.
    8. غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وتصور تحت مجهر.
  3. أداء تشوندروجينيسيس.
    1. إعداد تعليق خلية في المتوسط الثقافة بتركيز 1.6 × 107 خلايا/مل.
    2. وضع معالجة تجميعية 5 ميليلتر من تعليق خلية في وسط بئر في لوحة 12-جيدا (الثقافات ميكروماس) واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة ح 2-3.
    3. أضف 1 مل متوسطة التمايز تشوندروجينيك برفق (انظر الجدول للمواد)، واحتضان في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لمدة 4-7 أيام. تغيير متوسطة التمايز تشوندروجينيك مرتين في أسبوع.
    4. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    5. احتضان خلايا في 4% فورمالدهايد الحل لمدة 30 دقيقة في الرايت
    6. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    7. تحضير 0.05% أزرق تولويدين الحل بتذويب 250 ملغ تولويدين الأزرق مع 500 مل مخزن خلات الصوديوم 0.1 M مع الأس الهيدروجيني 4.1. وصمة عار الخلايا مع 1 مل من محلول أزرق تولويدين 0.05% على RT لمدة 30 دقيقة.
    8. تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وتصور تحت مجهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراءات التي من جمع UC ماجستير الثقافة يرد في الشكل 1. ويمكن جمع UC لحوالي 5-10 سم في الطول من جميع الأطفال حديثي الولادة بالعملية القيصرية. UC يبدأ وضع في 4-8 أسابيع الحمل، وما زال ينمو حتى 50-60 سم في الطول، كما هو مبين في الشكل 2. هناك اثنين من الشرايين (A) والسياق واحد (V) وبطانة الحبل (CL) وجيلي (WJ في وارتون) في جامعة كاليفورنيا، كما هو مبين في الشكل 3 و 4 الشكل....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن أن تكون معزولة من مجموعة متنوعة من الأنسجة MSCs السكان غير متجانسة من الخلايا التي تفعل إكسبرس ليس كل العلامات المظهرية نفس. هنا، نحن المبينة بروتوكول أن أدلة جمع والتشريح من جامعة كاليفورنيا من الرضع الخدج والمدة ويمكن عزلة وثقافة UC-MSCs. وفي أعقاب هذا البروتوكول، نحن بنجاح معزولة UC-MSCs التي تفي بمعايير ISCT19 من الأجنة/الرضع ألقاه في 19-40 أسبوعا من الحمل، وأثبتت أنها تمثل بعض الجوانب من الأمراض المستعصية الفيزيولوجيا المرضية وخلال تطور الجنين11،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل بمعونة عن Scientific Research (C) (منح رقم: 25461644) والعلماء الشباب (ب) (منح أرقام: 15 ك 19614، 26860845، 17 ك 16298) من كاكينهي JSPS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب بلاستيكي سعة 50 ملAS One Coporation ، أوساكا ، اليابانViolamo 1-3500-22
لوحة 12 بئرAGC Techno Glass ، طوكيو ، اليابانIwaki 3815-012
طبق 60 ممAGC Techno Glass ، طوكيو ، اليابانمصفاة خلية Iwaki 3010-060
(100 & mu ؛ م)ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس & nbsp ؛Falcon 35-2360
(70 & mu; م)ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس & nbsp ؛Falcon 35-2350
Alpha MEMWako Pure Chemical ، أوساكا ، اليابان135-15175
مصل الأبقار الجنينيSigma Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري172012
مصل منخفض متوسطThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MAOPTI-MEM Gibco 31985-070
ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA & nbsp ؛Gibco 15240-062
Trypsin-EDTAWako Pure Chemical ، أوساكا ، اليابان209-16941
PBSTakara BIO ، Shiga ، اليابانT900
يمزج الإنزيم المنقىRoche ، Mannheim ، ألمانياLiberase DH من الدرجة البحثية 05401054001
الجسم المضاد الأساسي للفأر المترافق ب PE ضد CD14BD Bioscience ، Franklin Lakes ، NJ347497Lot: 3220644، RRID: AB_400312
الجسم المضاد الأساسي للفأر المترافق ب PE ضد CD19BD Bioscience ، Franklin Lakes ، NJ340364Lot: 3198741 ، RRID: AB_400018
الجسم المضاد الأساسي للفأر المترافق ب PE ضد CD34BD Bioscience ، Franklin Lakes ، NJ555822Lot: 3079912 ، RRID: AB_396151
الجسم المضاد الأساسي للفأر المترافق ب PE ضد CD45BD Bioscience ، Franklin Lakes ، NJ555483الكثير: 2300520 ، RRID: AB_395875
الجسم المضاد الأساسي للفأر المترافق ب PE ضد CD73BD Bioscience ، Franklin Lakes ، NJ550257Lot: 3057778 ، RRID: AB_393561
الجسم المضاد الأساسي للفأر المترافق ب PE ضد CD90BD Bioscience ، Franklin Lakes ، NJ555596Lot: 3128616 ، RRID: AB_395970
الجسم المضاد الأساسي للفأر المترافق ب PE ضد CD105BD Bioscience ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي560839القطعة: 4339624 ، RRID: AB_2033932
الجسم المضاد الأساسي للفأر المترافق ب PE ضد HLA-DRBD BIOSCIENCE ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي347367القطعة: 3219843 ، RRID: AB_400293
الماوس المترافق PE IgG1 k النمط الإسويBD Bioscience ، Franklin Lakes ، NJ555749Lot: 3046675 ، RRID: AB_396091
الماوس المترافق PE IgG2a k النمط الإسويBD Bioscience ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي555574القطعة: 3035934 ، RRID: AB_ 395953
الماوس المترافق PE IgG2b k النمط المتماثلBD Bioscience ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي555743القطعة: 3098896 ، RRID: AB_396086
صبغة الجدوىBD Bioscience ، Franklin Lakes ، NJFixable Viability Stain 450 562247
كاشف حجبDainippon Pharmaceutical ، أوساكا ، اليابانBlock Ace UKB80
FCMBD Bioscience ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسيBD FACSAria  III Cell Sorter
FCM softwareBD Bioscience ، Franklin Lakes ، NJBD FACSDiva
Adipogenic التمايز المتوسطInvitrogen ، Carlsbad ، CAStemPro مجموعة تمايز Adipogenesis A10070-01
وسط التمايز العظميInvitrogen ، Carlsbad ، CAStemPro مجموعة تمايز العظم A10072-01
التمايز الغضروفي متوسط Invitrogen ، Carlsbad ، CAمجموعة تمايز الغضروف StemPro A10071-01
الفورمالديهايدPolyscience ، واريجتون ، بنسلفانيا16٪ فورمالديهايد فائق النقاء EM الصف # 18814
زيت أحمر OSigma Aldrich ، سانت لويس ، MOO0625
Arizarin Red SSigma Aldrich ، سانت لويس ، MOA5533
تولويدين بلوسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري198161
المجهرKeyence ، أوساكا ، اليابانBZ-X700
مصفاة خلوية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194(2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751(2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة