سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لوصف الجسيمات نوكليوسومي على مستوى جزيء مفرد باستخدام مجهر القوة الذرية ثابتة والوقت الفاصل بين (فؤاد) تقنيات التصوير. يسمح أسلوب الروغان السطحية ووصف للقبض على بنية وديناميات nucleosomes في الاستبانة في النانو.

Abstract

الكروماتين، وسلسلة طويلة من مفارز nucleosome، هو نظام ديناميكي الذي يسمح لمثل هذه العمليات الحرجة كتكرار الحمض النووي، والنسخ أخذ مكان في الخلايا حقيقية النواة. ديناميات nucleosomes يوفر الوصول إلى الحمض النووي بالأجهزة النسخ المتماثل، والنسخ، والأهمية يسهم في الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظائف الكروماتين. دراسات جزيء واحد مثل مجهر القوة الذرية (AFM) التصوير ساهمت إلى حد كبير فهمنا الحالي لدور هيكل نوكليوسومي والديناميات. البروتوكول الحالي يصف الخطوات التي تمكن تقنيات التصوير فؤاد عالي الاستبانة لدراسة الخصائص الهيكلية وديناميكية من nucleosomes. ويتجلى في البروتوكول فؤاد البيانات التي تم الحصول عليها ل nucleosomes السنترومير الذي يتم استبداله هيستون H3 نظيره السنترومير البروتين (سينب-أ). يبدأ البروتوكول مع جمعية مونو-نوكليوسوميس باستخدام أسلوب تمييع مستمر. إعداد الركيزة ميكا فونكتيوناليزيد مع سيلاتراني أمينوبروبيل (وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا) الذي يتم استخدامه للتصوير نوكليوسومي أمر حاسم للتصور فؤاد من نوكليوسوميس الموصوفة ويرد الإجراء الذي يعد الركيزة. يتم تصويرها nucleosomes المودعة على سطح APS-ميكا أولاً استخدام فؤاد ثابت، الذي يلتقط لقطة للسكان نوكليوسومي. من تحليل هذه الصور، يمكن أن تقاس هذه المعلمات كحجم الحمض النووي الملتفة حول نوكليوسوميس وهو أيضا تفاصيل هذه العملية. يتم وصف فؤاد الوقت الفاصل بين التصوير الداخلي في السائل لفؤاد الوقت الفاصل بين السرعة التي يمكن التقاط عدة إطارات لديناميات نوكليوسومي في الثانية الواحدة. وأخيراً، تحليل ديناميات nucleosome تمكن الوصف الكمي للعمليات الدينامية الموصوفة والمصور.

Introduction

في الخلايا حقيقية النواة، والحمض النووي مكثف للغاية ومنظم في الكروموسومات. ¹ هو المستوى الأول للمنظمة الحمض النووي داخل كروموسوم جمعية نوكليوسوميس في أي 147 شركة بريتيش بتروليوم للحمض النووي هو محكم ملفوفة حول نواة أوكتامير هيستون. ^{2 , 3} تجميع جزيئات نوكليوسومي في جزيء الحمض النووي طويلة تشكيل مجموعة الكروماتين ثم تنظيمها حتى يتم تشكيل وحدة كروموسوم ضغط عالية. ⁴ تفكيك الكروماتين وصولاً إلى مجاناً الحمض النووي تتطلبها العمليات الخلوية الحرجة مثل النسخ المتماثل النسخ والجينوم الجينات، مما يوحي بأن الكروماتين نظام شديد حيوية. ^{5 ,} <....

Protocol

1. الجمعية تمييع المستمر من nucleosomes مونو

1. توليد وتنقية bp حوالي 400 الركازة الحمض النووي الذي يحتوي على نوكليوسومي 601 اضعيه قبالة محورها التسلسل لتحديد المواقع. ⁵⁵
   ملاحظة: للحد من تشكيل دي-نوكليوسوميس غير المرغوب فيها، كل 'الذراع' المرافقة تسلسل المواقع لا ينبغي أن تتجاوز ~ 150 شركة بريتيش بتروليوم.
   1. استخدام بلازميد pGEM3Z-601 جنبا إلى جنب مع كبسولة تفجير تصميم وتضخيم الحمض النووي الركيزة باستخدام PCR. للركيزة bp 423 مع أطوال الذراع 122 و 154 bp المستخدمة هنا، استخدم قدما (5 '-كاجتجاتجتاتاكجاكتك-3')، وعكس (5 '-أكاجكتاتجاككاتجاتاك-3') كبسولة تفجير.
   2. إضافة أنابيب تحتوي على خليط رد فعل cycler حرارية يسخن إلى 95 در....

Results

تعد نوكليوسوميس مونو أولاً لفؤاد التصوير تجارب باستخدام أسلوب الجمعية تمييع مستمر (الشكل 1). تم فحص nucleosomes استعداد ثم استخدام متقطع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الشكل 2). وكان فونكتيوناليزيد على سطح ميكا التالية استخدام وكالة الأنباء الجزائرية، الذي يلتقط nucleosomes في السطح مع الحفاظ على خلفية سلس لتصوير عالي الدقة (الشكل 3). وأودع في وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا نوكليوسوميس وتم تصويرها في وقت لاحق استخدام ثابت فؤاد تصوير. ك.......

Discussion

مباشرة بدلاً من ذلك البروتوكول، المذكورة أعلاه وتقديم النتائج استنساخه بدرجة عالية، على الرغم من أن يمكن التركيز على عدد قليل من القضايا الهامة. وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا فونكتيوناليزيد ركيزة رئيسية للحصول على نتائج موثوقة واستنساخه. استقرار عالية لوكالة الأنباء الجزائرية-ميكا هي واحدة من السمات الهامة لهذه الركيزة التي يسمح أحد لإعداد الركيزة التصوير مسبقاً للاستخدام التي يمكن أن تستخدم على الأقل أسبوعين بعد إعدادها. ^{59 , 61} بيد السطح يمكن أن تتلف بالابخرة غر.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
البلازميد pGEM3Z-601	Addgene ، كامبريدج ، ماساتشوستس	26656
PCR Primers	IDT ، كورالفيل ، IA	الطلب المخصص	(FP) 5'- CAGTGAATTGTGTAATACGACTC-3 '(RP) 5'-ACAGCTATGACGATTAC-3'DreamTaq
polymerase	ThermoFischer Scientific ، Waltham ، MA	EP0701	رقم الكتالوج ل 200 وحدة
طقم تنقية PCR	Qiagen ، هيلدن ، ألمانيا	28104	رقم الكتالوج ل 50 وحدة
تريس	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	10708976001	رقم الكتالوج ل 250 جم
EDTA	ThermoFischer Scientific ، Waltham ، MA	15576028	رقم الكتالوج ل 500
جم (CENP-A / H4) 2 ، مؤتلف الإنسان	EpiCypher ، دورهام ، نورث كارولاينا	16-0010	رقم الكتالوج ل 50 ug
H2A / H2B ، مؤتلف الإنسان	EpiCypher ، دورهام ، NC	15-0311	رقم الكتالوج ل 50 ug
H3 Octamer ، مؤتلف بشري	EpiCypher ، دورهام ، نورث كارولاينا	16-0001	رقم الكتالوج ل 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit ، 10K MWCO ، 0.1 مل	ThermoFischer Scientific ، Waltham ، MA	69574	رقم الكتالوج ل 10 أجهزة
كلوريد الصوديوم	سيجما-ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	S9888-500G	رقم الكتالوج ل 500 مجم
Amicon Ultra-0.5  مرشحات الطرد المركزي مل مل	Millipore-sigma، Burlington، MO	رقم الكتالوج UFC501008	ل 8 أجهزة
HCl	Sigma-Aldrich، St. Louis، MO	258148-25ML	رقم الكتالوج ل 25 مل
Tricine	Sigma-Aldrich، St. Louis، MO	T0377-25G	رقم الكتالوج ل 25 جم
SDS	Sigma-Aldrich، St. Louis، MO	11667289001 رقم	الكتالوج ل 1 كجم
بيرسلفات الأمونيوم (AmmPS)	رقم الكتالوج Bio-Rad ، Hercules ، CA	1610700	ل 10 جم
30٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1	Bio-Rad ، Hercules ، CA	1610158	رقم الكتالوج ل 500 مل
TEMED	Bio-Rad ، هرقل ، CA	1610800	رقم الكتالوج ل 5 مل
4x عازلة عينة بروتين Laemmli ل SDS-PAGE	Bio-Rad ، Hercules ، CA	1610747	رقم الكتالوج ل 10 مل
2-ME	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	M6250-10ML	رقم الكتالوج ل 10 مل
من العمر سلم البروتين الملون المسطرة   ؛	ThermoFischer Scientific ، Waltham ، MA	26616	رقم الكتالوج ل 500 uL
Bio-Safe & Trade ؛ Coomassie Stain	Bio-Rad ، Hercules ، CA	1610786	رقم الكتالوج
لمناديل غرف الأبحاث غير المنسوجة سعة 1 لتر: TX604 TechniCloth   ؛	TexWipe ، Kernersvile ، NC	TX604
Muscovite Block Mica	AshevilleMica ، Newport News ، VA	Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS)	تم تصنيعه كما هو موضح في 22
HEPES	Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO	H4034-25G	رقم الكتالوج ل 25 جم
Scotch Tape	Scotch-3M ، سانت بول ، مينيسوتا
مسبار TESPA-V2 afm (للتصوير الثابت)	مسبار Bruker AFM ، Camarillo ، CA
MSNL-10 afm (للتصوير بفاصل زمني قياسي)	مجسات Bruker AFM ، Camarillo ، CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue	Toagosei America ، West Jefferson ، OH	AA480	رقم الكتالوج لأنبوب 2 جرام
MgCl2	Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO	M8266-100G	رقم الكتالوج ل 100 جرام
مرشح Millex-GP ، 0.22   ؛ ومايكرو. م	سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري	SLGP05010	رقم الكتالوج ل 10 أجهزة
مسبار BL-AC10DS-A2 AFM (ل HS-AFM)	أوليمبوس ، مجمع اليابان
FG-3020C-20 & nbsp ؛	شركة FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
مركب FS-1010S135-0.5	شركة FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
مجهر القوة الذرية متعدد الأوضاع	Bruker-Nano / Veeco ، سانتا باربرا ، كاليفورنيا
الفحص المجهري للقوة الذرية ذات اللقطات المتتابعة عالية	السرعة توشيو أندو ، معهد علوم الحياة النانوية ، جامعة كانازاوا ، كاكوما ماتشي ، كانازاوا ، اليابان