نقدم هنا، بروتوكولا لوصف الجسيمات نوكليوسومي على مستوى جزيء مفرد باستخدام مجهر القوة الذرية ثابتة والوقت الفاصل بين (فؤاد) تقنيات التصوير. يسمح أسلوب الروغان السطحية ووصف للقبض على بنية وديناميات nucleosomes في الاستبانة في النانو.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الكروماتين، وسلسلة طويلة من مفارز nucleosome، هو نظام ديناميكي الذي يسمح لمثل هذه العمليات الحرجة كتكرار الحمض النووي، والنسخ أخذ مكان في الخلايا حقيقية النواة. ديناميات nucleosomes يوفر الوصول إلى الحمض النووي بالأجهزة النسخ المتماثل، والنسخ، والأهمية يسهم في الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظائف الكروماتين. دراسات جزيء واحد مثل مجهر القوة الذرية (AFM) التصوير ساهمت إلى حد كبير فهمنا الحالي لدور هيكل نوكليوسومي والديناميات. البروتوكول الحالي يصف الخطوات التي تمكن تقنيات التصوير فؤاد عالي الاستبانة لدراسة الخصائص الهيكلية وديناميكية من nucleosomes. ويتجلى في البروتوكول فؤاد البيانات التي تم الحصول عليها ل nucleosomes السنترومير الذي يتم استبداله هيستون H3 نظيره السنترومير البروتين (سينب-أ). يبدأ البروتوكول مع جمعية مونو-نوكليوسوميس باستخدام أسلوب تمييع مستمر. إعداد الركيزة ميكا فونكتيوناليزيد مع سيلاتراني أمينوبروبيل (وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا) الذي يتم استخدامه للتصوير نوكليوسومي أمر حاسم للتصور فؤاد من نوكليوسوميس الموصوفة ويرد الإجراء الذي يعد الركيزة. يتم تصويرها nucleosomes المودعة على سطح APS-ميكا أولاً استخدام فؤاد ثابت، الذي يلتقط لقطة للسكان نوكليوسومي. من تحليل هذه الصور، يمكن أن تقاس هذه المعلمات كحجم الحمض النووي الملتفة حول نوكليوسوميس وهو أيضا تفاصيل هذه العملية. يتم وصف فؤاد الوقت الفاصل بين التصوير الداخلي في السائل لفؤاد الوقت الفاصل بين السرعة التي يمكن التقاط عدة إطارات لديناميات نوكليوسومي في الثانية الواحدة. وأخيراً، تحليل ديناميات nucleosome تمكن الوصف الكمي للعمليات الدينامية الموصوفة والمصور.
المقدمة
في الخلايا حقيقية النواة، والحمض النووي مكثف للغاية ومنظم في الكروموسومات. 1 هو المستوى الأول للمنظمة الحمض النووي داخل كروموسوم جمعية نوكليوسوميس في أي 147 شركة بريتيش بتروليوم للحمض النووي هو محكم ملفوفة حول نواة أوكتامير هيستون. 2 , 3 تجميع جزيئات نوكليوسومي في جزيء الحمض النووي طويلة تشكيل مجموعة الكروماتين ثم تنظيمها حتى يتم تشكيل وحدة كروموسوم ضغط عالية. 4 تفكيك الكروماتين وصولاً إلى مجاناً الحمض النووي تتطلبها العمليات الخلوية الحرجة مثل النسخ المتماثل النسخ والجينوم الجينات، مما يوحي بأن الكروماتين نظام شديد حيوية. 5 , <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الجمعية تمييع المستمر من nucleosomes مونو
- توليد وتنقية bp حوالي 400 الركازة الحمض النووي الذي يحتوي على نوكليوسومي 601 اضعيه قبالة محورها التسلسل لتحديد المواقع. 55
ملاحظة: للحد من تشكيل دي-نوكليوسوميس غير المرغوب فيها، كل 'الذراع' المرافقة تسلسل المواقع لا ينبغي أن تتجاوز ~ 150 شركة بريتيش بتروليوم.- استخدام بلازميد pGEM3Z-601 جنبا إلى جنب مع كبسولة تفجير تصميم وتضخيم الحمض النووي الركيزة باستخدام PCR. للركيزة bp 423 مع أطوال الذراع 122 و 154 bp المستخدمة هنا، استخدم قدما (5 '-كاجتجاتجتاتاكجاكتك-3')، وعكس (5 '-أكاجكتاتجاككاتجاتاك-3') كبسولة تفجير.
- إضافة أنابيب تحتوي على خليط رد فعل cycler حرارية يسخن إلى 95 در....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تعد نوكليوسوميس مونو أولاً لفؤاد التصوير تجارب باستخدام أسلوب الجمعية تمييع مستمر (الشكل 1). تم فحص nucleosomes استعداد ثم استخدام متقطع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الشكل 2). وكان فونكتيوناليزيد على سطح ميكا التالية استخدام وكالة الأنباء الجزائرية، الذي يلتقط nucleosomes في السطح مع الحفاظ على خلفية سلس لتصوير عالي الدقة (الشكل 3). وأودع في وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا نوكليوسوميس وتم تصويرها في وقت لاحق استخدام ثابت فؤاد تصوير. ك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
مباشرة بدلاً من ذلك البروتوكول، المذكورة أعلاه وتقديم النتائج استنساخه بدرجة عالية، على الرغم من أن يمكن التركيز على عدد قليل من القضايا الهامة. وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا فونكتيوناليزيد ركيزة رئيسية للحصول على نتائج موثوقة واستنساخه. استقرار عالية لوكالة الأنباء الجزائرية-ميكا هي واحدة من السمات الهامة لهذه الركيزة التي يسمح أحد لإعداد الركيزة التصوير مسبقاً للاستخدام التي يمكن أن تستخدم على الأقل أسبوعين بعد إعدادها. 59 , 61 بيد السطح يمكن أن تتلف بالابخرة غر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
الكاتب الاشتراكات: سنوات العمر المفقودة و MSD تصميم المشروع؛ نوكليوسوميس MSD تجميعها. MSD وزينب صالح إجراء تحليلات فؤاد التجارب والبيانات. وكتب جميع المؤلفين وتحرير المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| البلازميد pGEM3Z-601 | Addgene ، كامبريدج ، ماساتشوستس | 26656 | |
| PCR Primers | IDT ، كورالفيل ، IA | الطلب المخصص | (FP) 5'- CAGTGAATTGTGTAATACGACTC-3 '(RP) 5'-ACAGCTATGACGATTAC-3'DreamTaq |
| polymerase | ThermoFischer Scientific ، Waltham ، MA | EP0701 | رقم الكتالوج ل 200 وحدة |
| طقم تنقية PCR | Qiagen ، هيلدن ، ألمانيا | 28104 | رقم الكتالوج ل 50 وحدة |
| تريس | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري | 10708976001 | رقم الكتالوج ل 250 جم |
| EDTA | ThermoFischer Scientific ، Waltham ، MA | 15576028 | رقم الكتالوج ل 500 |
| جم (CENP-A / H4) 2 ، مؤتلف الإنسان | EpiCypher ، دورهام ، نورث كارولاينا | 16-0010 | رقم الكتالوج ل 50 ug |
| H2A / H2B ، مؤتلف الإنسان | EpiCypher ، دورهام ، NC | 15-0311 | رقم الكتالوج ل 50 ug |
| H3 Octamer ، مؤتلف بشري | EpiCypher ، دورهام ، نورث كارولاينا | 16-0001 | رقم الكتالوج ل 50 ug |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit ، 10K MWCO ، 0.1 مل | ThermoFischer Scientific ، Waltham ، MA | 69574 | رقم الكتالوج ل 10 أجهزة |
| كلوريد الصوديوم | سيجما-ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري | S9888-500G | رقم الكتالوج ل 500 مجم |
| Amicon Ultra-0.5 مرشحات الطرد المركزي مل مل | Millipore-sigma، Burlington، MO | رقم الكتالوج UFC501008 | ل 8 أجهزة |
| HCl | Sigma-Aldrich، St. Louis، MO | 258148-25ML | رقم الكتالوج ل 25 مل |
| Tricine | Sigma-Aldrich، St. Louis، MO | T0377-25G | رقم الكتالوج ل 25 جم |
| SDS | Sigma-Aldrich، St. Louis، MO | 11667289001 رقم | الكتالوج ل 1 كجم |
| بيرسلفات الأمونيوم (AmmPS) | رقم الكتالوج Bio-Rad ، Hercules ، CA | 1610700 | ل 10 جم |
| 30٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1 | Bio-Rad ، Hercules ، CA | 1610158 | رقم الكتالوج ل 500 مل |
| TEMED | Bio-Rad ، هرقل ، CA | 1610800 | رقم الكتالوج ل 5 مل |
| 4x عازلة عينة بروتين Laemmli ل SDS-PAGE | Bio-Rad ، Hercules ، CA | 1610747 | رقم الكتالوج ل 10 مل |
| 2-ME | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري | M6250-10ML | رقم الكتالوج ل 10 مل |
| من العمر سلم البروتين الملون المسطرة ؛ | ThermoFischer Scientific ، Waltham ، MA | 26616 | رقم الكتالوج ل 500 uL |
| Bio-Safe & Trade ؛ Coomassie Stain | Bio-Rad ، Hercules ، CA | 1610786 | رقم الكتالوج |
| لمناديل غرف الأبحاث غير المنسوجة سعة 1 لتر: TX604 TechniCloth ؛ | TexWipe ، Kernersvile ، NC | TX604 | |
| Muscovite Block Mica | AshevilleMica ، Newport News ، VA | Grade-1 | |
| Aminopropyl silatrane (APS) | تم تصنيعه كما هو موضح في 22 | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO | H4034-25G | رقم الكتالوج ل 25 جم |
| Scotch Tape | Scotch-3M ، سانت بول ، مينيسوتا | ||
| مسبار TESPA-V2 afm (للتصوير الثابت) | مسبار Bruker AFM ، Camarillo ، CA | ||
| MSNL-10 afm (للتصوير بفاصل زمني قياسي) | مجسات Bruker AFM ، Camarillo ، CA | ||
| Aron Alpha Industrial Krazy Glue | Toagosei America ، West Jefferson ، OH | AA480 | رقم الكتالوج لأنبوب 2 جرام |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO | M8266-100G | رقم الكتالوج ل 100 جرام |
| مرشح Millex-GP ، 0.22 ؛ ومايكرو. م | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري | SLGP05010 | رقم الكتالوج ل 10 أجهزة |
| مسبار BL-AC10DS-A2 AFM (ل HS-AFM) | أوليمبوس ، مجمع اليابان | ||
| FG-3020C-20 & nbsp ؛ | شركة FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan | ||
| مركب FS-1010S135-0.5 | شركة FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan | ||
| مجهر القوة الذرية متعدد الأوضاع | Bruker-Nano / Veeco ، سانتا باربرا ، كاليفورنيا | ||
| الفحص المجهري للقوة الذرية ذات اللقطات المتتابعة عالية | السرعة توشيو أندو ، معهد علوم الحياة النانوية ، جامعة كانازاوا ، كاكوما ماتشي ، كانازاوا ، اليابان |
المراجع
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
