فحوصات لمعدل نمو محددة وملزمة خلية قدرة فيروس الروتا

فيروسات الرنا تشكل سكان متنوعة وراثيا، يعرف باسم كواسيسبيسيس¹، بسبب معدل الطفرات،² وأعلى من الكائنات الحية على أساس الحمض النووي. هيكل السكان في كواسيسبيسيس يتأثر بالعوامل الوراثية السكان، بما في ذلك الطفرة وضغط الانتخاب والانجراف الجينية. قد تظهر سلالات داخل نسب وراثية واحدة تعمل مختلف بسبب التنوع الوراثي. على سبيل المثال، أظهرت رشمدي et al. أن حساسية الكلور الحرة مختلفة بين سلالات نوروفيروس موريني التي نشأت من سلالة تنقية البلاك S7-PP3³.

روتافيروسيس (جنس فيروس الروتا في أسرة ريوفيريداي) هي الفيروسات غير المغلفة س رنا تشكيل كواسيسبيسيس². علاوة على العوامل الوراثية السكان المذكورة أعلاه، إعادة تشكيل جينوم الفيروس يؤثر على التنوع الجيني لفيروس الروتا لأن هذا الفيروس قد جينومات مجزأة 11⁴. روتافيروسيس يسبب الإسهال أساسا بين الأطفال الرضع، ووفيات الرضع في عام 2013 وقدرت حول 250,000⁵. لقاحين قيد الاستخدام في العديد من البلدان، وقد أثبتت فعاليتها في الحد من عبء الإصابة بفيروس الروتا، ولكن بعض الباحثين الآن نناقش وجود لقاح-الهروب طفرات^6،،من^{78، 9}-توصيف هذه طفرات من المهم فهم آليات لقاح-الهروب.

نقدم هنا، بروتوكولات لفحوصات اثنين لتقييم معدل نمو محددة وملزمة خلية قدرة فيروس الروتا بغية فهم الاختلافات المظهرية بين سلالات/طفرات. منحنى النمو روتافيروسيس قد قدمت في السابق تقارير¹⁰، ولكن نمو المعلمات مثل معدل النمو المحددة لا تقاس عادة. ويشمل الإنزيم الخلية ملزم أجرى سابقا تقنية المصبوغة إيمونوفلوريسسينت¹¹. نعرض هنا طرق أسهل من استخدام مقايسة البلاك و RT-قبكر، الذي يسمح لنا بمناقشة الفرق في تعمل الفيروسية كمياً. هذه الأساليب المناسبة لتوصيف تعمل فيروس الروتا، وأخيراً قد تسهم في تشييد لقاحات جديدة فعالة للأنماط الجينية متعددة.

1-إعداد متوسطة

1. لجعل خلية ثقافة متوسطة (المتوسطة المحتوية على مصل)، إضافة 4.7 غرام مسحوق MEM النسر إلى 500 مل ماء المقطر. اﻷوتوكﻻف عند 120 درجة مئوية 20 دقيقة واسمحوا بارد متوسط درجة حرارة الغرفة. إضافة مصل بقرى الجنين (تركيز النهائية: 10 ٪)، لام الجلوتامين (2 مم) والبنسلين والستربتوميسين (1 في المائة) وبيكربونات الصوديوم (1.125 غرام/لتر). تخزين في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
2. إعداد متوسطة خالية من المصل لنشر الفيروسات كما هو موضح في الخطوة 1، 1، ولكن دون المصل البقري الجنين. تخزين في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
3. لفحص اللوحة، تعقيم 100 مل من MEM المتوسطة النسر (غير المحتوية على الفينول الأحمر) قبل التعقيم. اسمحوا المتوسط تبرد لدرجة حرارة الغرفة، ثم قم بإضافة 2% FBS، 2% "البنسلين والستربتوميسين"، 4 مم الجلوتامين لام و 2.25 غرام/لتر ناكو₃. مخزن في 4 درجات مئوية.
4. لفحص اللوحة، تعقيم 100 مل من 2.5% [اغروس] هلام من اﻷوتوكﻻف. تحضير الجل في اليوم نفسه ويجري فحص اللوحة. تخزين الهلام في 47 درجة مئوية في حمام مائي.

2-خلية ثقافة

1. قم بإزالة كريوتوبي التي تحتوي على خطوط الخلايا MA104 من حاوية نيتروجين سائل. وضع في كريوتوبي في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لإذابة الجليد في الخلايا. أضف 1 مل تعليق خلية إلى 20 مل المتوسطة المحتوية على مصل في قارورة T75. احتضان قارورة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ 2 أو 3 أيام.
   ملاحظة: أن تركيز الخلية الأخيرة في التعليق حوالي 10⁶ خلايا/مل.
2. مرة واحدة أحادي الطبقة الخلية يصل إلى 80% كونفلوينسي، إزالة المادة طافية وغسل الخلايا مرتين مع 5 مل 1 × برنامج تلفزيوني في دولبيكو (الفوسفات مخزنة المالحة).
3. إضافة 4 مل من 0.05% التربسين-يدتا قارورة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا من قارورة. نقل تعليق خلية الأنبوبة 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 190 x ز لمدة 5 دقائق.
4. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الأعلاف (10⁶ خلايا) في 1 مل المحتوية على مصل 1.1 المعدة في المتوسط. تمييع الخلايا ريسوسبينديد في معززات مع المتوسط.
5. أضف 3 مل تعليق خلية المخفف لكل بئر 6-جيدا (مقايسة البلاك) أو لوحات 24-جيدا (مقايسة ملزمة خلية)، على التوالي. احتضان اللوحات في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ تحت البخار مشبعة لمدة 2 أو 3 أيام.
   ملاحظة: قارورة T75 مناسبة لجمع العينات الوقت بالطبع لأنه يمكن تجاهل حجم عينة من المادة طافية (1 مل) مقارنة بإجمالي حجم طافية (30 مل). وفي الوقت نفسه، يقاس عيار المعدية الفيروس في كل المادة طافية بمقايسة اللوحة، التي تتم عادة باستخدام لوحة 6-جيدا. يستخدم لوحة 24-جيدا للمقايسة ملزمة خلية.

3-معدل النمو محدد من فيروس الروتا

ملاحظة: فيروس الروتا الريسوسي (RRV، النمط الوراثي: G3P[3]) ويستخدم في هذا البروتوكول لأنه RRV يمكنك بسرعة وسهولة تشكيل لويحات مع الخلايا MA104.

1. مكان أنبوب يحتوي على 1 مل تعليق الفيروس (بفو⁷ 10/مل) في متوسط خالية من مصل الدم المخزنة في-80 درجة مئوية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لذوبان الجليد. إضافة 1 ميكروغرام/ميليلتر التربسين من بنكرياس الخنزير إلى 1 مل تعليق الفيروس (تركيز التربسين النهائي 4 ميكروغرام/مل) ومن ثم دوامة. احتضان تعليق الفيروس في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ تحت البخار مشبعة لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: يمكن استخدام التربسين من المصادر الأخرى، ولكن أثر على العدوى فيروس الروتا بحاجة إلى اختبار مقدما.
2. تمييع تعليق تنشيط الفيروس مع وسيلة خالية من المصل لضبط تعدد العدوى (وزارة الداخلية) إلى 0.1 بفو/خلية.
3. إضافة 1 مل تعليق الفيروس المخفف لخطوط الخلايا MA104 (80% روافد) في قارورة T75 3 أيام بعد خلية الطلاء (2.1) واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1، وتهز بلطف قارورة كل 15 دقيقة.
4. ثم إضافة 30 مل وسيلة خالية من المصل تتضمن 0.13 ميكروغرام/مل من التربسين من بنكرياس الخنزير إلى قارورة. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO₂ تحت البخار المشبعة.
5. جمع 1 مل من المادة طافية في قارورة على 0، 6، 12، 18، 24، و 36 (و/أو 48) ح العدوى بعد (hpi) واستبدال المادة طافية في أنابيب 1.5 مل باستخدام ماصة.
6. إجراء التجميد (-80 درجة مئوية) وتذوب في حمام مائي في 37 درجة مئوية دورة ثلاث مرات. ثم الطرد المركزي هذه الأنابيب في س 12,600 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. جمع المادة طافية.
7. تصفية المادة طافية مع عامل تصفية مقطر 0.2 ميكرون لإزالة الكسر الخلية. تخزين في-80 درجة مئوية طافية في الثلاجة حتى تطبيقه على مقايسة اللوحة لقياس عيار الفيروس.
8. وضع الأنابيب التي تحتوي على المادة التي تم جمعها (الخطوة 3، 5) طافية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. إضافة 4 ميكروغرام/مل التربسين 1 مل عينة المخففة إذ واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
9. أثناء الاحتضان 30 دقيقة في 3.8، يغسل المقايسة اللوحة لقياس عيار الفيروس التي تم الحصول عليها من عينات بالطبع الوقت (الخطوة 3، 5)، أن تبدأ الخلايا MA104 مرتين في صفيحة 6-جيدا مع 2 مل من 1 x برنامج تلفزيوني بعد إزالة المتوسطة المحتوية على مصل.
10. متسلسل تمييع العينات المحتضنة مع وسيلة خالية من المصل وتطعيم 1 مل العينة المخففة في كل بئر. احتضان لوحة لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ تحت البخار المشبعة، وتهز بلطف لوحة كل 15 دقيقة.
11. بعد الحضانة، إزالة العدوى من لوحة 6-جيدا. إضافة 4 ميكروغرام/مل التربسين إلى المتوسطة أعدت في (الخطوة 1، 3). بلطف ولكن فورا أضف 3 مل متوسطة مختلطة مع [اغروس] هلام (النسبة هي 1:1) لكل بئر.
12. تبقى اللوحة في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 10 دقائق (حتى يصبح [اغروس] هلام الصلبة) واحتضانها لمدة يومين في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ تحت البخار المشبعة.
    ملاحظة: من أجل المتوسط مختلطة مع أجار من حافة البئر.
13. أضف 1 مل من محلول الأحمر محايدة في 0.015% المخفف ببرنامج تلفزيوني x 1 لكل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ تحت البخار المشبعة. إزالة الصبغة بعد ح 3 واحتضان لمدة يوم واحد في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ تحت البخار المشبعة.
14. في اليوم التالي، عدد من اللوحات في كل بئر وحساب بفو/مل. فحص دقيق لالتقاء الخلية قبل مقايسة اللوحة لضمان إعداد اللوحة.

4-الخلية ملزم بالانزيم

ملاحظة: ويستند هذا البروتوكول جيلينج للتقرير¹³.

1. إضافة 1 ميكروغرام/ميليلتر التربسين من بنكرياس الخنزير إلى 1 مل تعليق الفيروس (تركيز التربسين النهائي 4 ميكروغرام/مل) ومن ثم دوامة (بنفس الطريقة كما هو الحال في 2.1). تمييع تعليق الفيروس مع وسيلة خالية من المصل لضبط وزارة الداخلية 1 بفو/خلية.
2. يغسل خلايا MA104 مرتين على لوحة 24-جيدا مع 1 مل من المحلول الملحي مخزنة تريس (TBS؛ وقاعدة 2.53 غرام/لتر تريس، 6.54 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 0.3 غرام/لتر بوكل، 0.046 غرام/لتر Na₂هبو₄ إلى 1 لتر بالماء المقطر).
3. تلقيح 100 ميليلتر لوقف الفيروس المخفف لكل بئر من صفيحة 24-جيدا مع الخلايا، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، مع لطيف تهز كل 15 دقيقة.
4. إزالة العدوى الفيروس وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من tbs. لاستخراج المزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل (ds) الجيش الملكي النيبالي لفيروس الروتا، إضافة ميليلتر 140 1 × برنامج تلفزيوني و 560 ميليلتر من المخزن المؤقت استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الجدول للمواد) لكل بئر. يخلط على نحو كاف ماصة (حول 10 x أو حتى لا ينظر إلى الضباب أو الملوث من الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت).
5. بعد استرداد رنا تقطعت بهم السبل مزدوجة (dsRNA) وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، ضع أنابيب 1.5 مل المحتوية على استخراج دسرنا على كتلة حرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتجريدها دسرنا، ثم فورا وضع الأنابيب على الجليد واحتضانها لأكثر من 2 دقيقة.
6. توليف كدنا باستخدام نسخ عكسي كيت (انظر الجدول للمواد). إضافة 4 ميليلتر من التشويه والتحريف حل الجيش الملكي النيبالي الفيروسية PCR أنبوب يحتوي على 16 ميليلتر من خليط (الجدول 1) ومزجها بعناية مع ماصة حتى لا يؤدي إلى توليد فقاعات. تدور إلى أسفل الأنابيب.
7. إجراء النسخ العكسي مع cycler حرارية بشرط هو مبين في الجدول 2. إذا لم يتم استخدام كدنا الفور، تخزين أنابيب PCR تتضمن كدنا في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
8. استخدام في كبسولة تفجير ل PCR الكمي (الأمام-أككاتكتاكاكاتجاكككتك 5 '-3'، عكس؛ 5 '-جتكاكاتاكجكككك-3')¹⁴ وتحقيق تقضي إدراج (qPCR المسابير؛ 5 '-/الاتحاد الماليزي/أتجاجكاكا/يحتوي/أتاجتاااجكتاكاكتجتكا/طمره-3')، واستهداف 963-1049 المنطقة NSP3 الجينوم الجزء من فيروس الروتا (سلالة ST3، بنك الجينات: X81436).
   ملاحظة: يتم إدراج تقضي في التحقيق الذي صممه تسنغ et al.¹⁴
9. تمييع بلازميد القياسية متسلسل (10 من¹ إلى 10⁶ نسخ/مل) مع بكر الصف الماء إلى خليط قبكر (الجدول 3) وجعل مزيج الرئيسي (20 ميليلتر في عينة) qPCR عقب الجدول 4.
10. إضافة 20 ميليلتر من مزيج الرئيسي إلى البئر لصفيحة بكر 96-جيدا، وثم 5 ميليلتر من عينات كدنا أو 5 ميليلتر من بلازميد القياسية مزيج من بيبيتينج 10 مرات. بدء رد فعل النظام qPCR وفقا للشروط المبينة في الجدول 4.
11. لحساب جينوم فيروس الروتا منضمة إلى سطح الخلية MA104، إجراء الانحدار الخطي بين القيم المقطعية وعدد الجينوم المعروفة بلازميد القياسية، وتقدير عدد الجينوم العينة. ثم حساب نسبة virion أرقام ملزمة للخلايا (G_t) لتلك العدوى الأولية (ز₀).

لمحة عامة عن بروتوكولين لمعدل نمو محددة وملزمة خلية التحليل البلاك-تنقية سلالات RRV هو هو موضح في الشكل 1A و 2A، على التوالي.

المقايسة لمعدل نمو محددة، عيار الفيروس نهائي يبلغ أكثر من 107 بفو/مل عند نشر في قارورة T75. إذا كان تركيز أقصى أقل من 107 بفو/mL، لا قد تصبح الخلية MA104 المتلاقية أو لم يتم تنشيط RRV جيدا من قبل التربسين. وتتوفر بعض نماذج النمو لتقدير معدل النمو المحددة باستخدام البيانات وحدة المعدية. يعمل نموذج جومبيرتز معدلة12 هذا البروتوكول، على سبيل مثال؛

حيث ن0 (104 بفو/مل في هذه الدراسة) و Nt (104 إلى 108 بفو/mL) هي عيار الفيروسات المعدية (بفو/mL) في 0 و t (مثال: 0, 6، 12، 18، 24، 36) hpi، على التوالي، هو قيمة مقارب [سجل (N∞/N0 )] (مثال: 3 إلى 4)، μ هو معدل نمو محددة [1/ح]، (ه) هو ثابت نابير و λ هي فترة تأخر [ح]. يتم الحصول على نموذج معلمات بواسطة الدالة solver برمجيات التحليل، مما يقلل من مجموع المربعات للفرق بين القيم الملاحظة وعلى غرار. في المثال في الشكل 1B، يقدر معدل نمو محددة (μ) 0.197 [1/ح] والفترة الفاصلة (λ) هو 6.61 [ح] بتطبيق الأسلوب الأقل مربع نموذج جومبيرتز معدلة، وعيار الفيروس النسبي في مرحلة ثابتة إلى (عيار الأولية تسجيل نطاق) (A) هو 3.15 [سجل (N∞/N0)]. اختبرناها 6 استنساخ فيروس الروتا في المجموع، وتراوحت القيم المقدرة لمعدل نمو محددة 0.19 0.27 [1/h]. هذه المقدرة قيم موثوق بها لأن معامل تحديد القيم في تركيب نموذج أكثر من 0.98.

فيريونس RRV ملزمة على أسطح الخلية كانت حوالي 103 نسخ/مل (ملزمة الكفاءة كان حوالي 1 في المائة) عند استخدام لوحة 24-جيدا مقايسة ربط الخلية (الشكل 2). الفحص يجري عادة ثلاث مرات لكل عينة، وإذا لوحظ تباين كبير في عدد النسخ في عينة، قد تحدث بعض المشاكل مثل التنشيط الغسيل المفرط وغير كافية من RRV بواسطة التربسين. قيمة Ct qPCR تتجاوز حوالي 36.0 ليست الأفضل، ويعتبر أن يكون أقل من حد كشف في حالتنا qPCR.

الجدول 1: ماجستير مزيج التكوين لتوليف كدنا لجينوم فيروس الروتا.

الجدول 2: رد فعل الشرط لتوليف كدنا جينوم فيروس الروتا.

الجدول 3: ماجستير مزيج تكوين PCR الكمي لفيروس الروتا جينوم.

الجدول 4: رد فعل شرط للكمي PCR لفيروس الروتا جينوم.

رقم 1: نظرة عامة التخطيطي لتقدير نمو فيروس الروتا ومنحني نمو فيروس الروتا. (أ) وحدة المعدية لفيروس الروتا يقاس بمقايسة اللوحة. (ب) المنحنى (الخط الأزرق) تم تقريبها بالطراز جومبيرتز المعدلة استناداً إلى بيانات الملاحظة في المختبر (دائرة بيضاء). معدل نمو محددة [μ]؛ 0.197 [h-1]، متخلفة عن الفترة (λ)؛ 6.61 [ح]، عيار الفيروس النسبي في المرحلة ثابتة لعيار الأولية (مقياس لوغاريتمي) (أ)؛ 3.15 [سجل (N∞/N0)]. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: نظرة عامة التخطيطي والممثل نتيجة الفحص ملزمة خلية خمس سلالات RRV تنقيته من لويحات في المختبر. (A) A لوحة الثقافة الخلية تلقيح مع فيروس الروتا هو المحتضنة عند 4 درجة مئوية لمنع غزو الفيروس داخل الخلايا. بعد الاحتضان وإزالة الجسيمات الفيروسية غير منضم إلى الخلايا، تقدير عدد مورثات الناشئة من الجسيمات الفيروسية منضم إلى سطح الخلية مع الرايت qPCR. تم عرض المقايسة (ب) نتيجة للخلية-الربط كربط كفاءة (%)، والتي كانت نسبة الجزيئات الفيروسية المنضم للحاضرين في العدوى. شريط غامق: متوسط، نهاية مربعات: الانحراف الربعي، في نهاية السطر: الحد الأقصى والحد الأدنى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.