Method Article

التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي

DOI:

10.3791/58844

⸱

January 9th, 2019

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة طريقة قوية تحديد حجم الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في الخلايا الحية. مزيج الأصباغ يحلول أو الميتوكوندريا محددة مع الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي ضد علامات السطح يسمح التحديد الكمي لهذه العضيات في الخلايا المختلطة السكان، مثل الخلايا الابتدائية تحصد من عينات الأنسجة، باستخدام قياس التدفق متعدد الألوان.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا T الاستفادة من البرامج الأيضية المختلفة لتتناسب مع احتياجاتها الوظيفية خلال التمايز وانتشارها. الميتوكوندريا عناصر حاسمة الخلوية المسؤولة عن إمداد الطاقة الخلية؛ ومع ذلك، تنتج الميتوكوندريا الزائدة أيضا أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) التي يمكن أن تتسبب في موت الخلايا. ولذلك، يجب تعديل عدد الميتوكوندريا باستمرار لتناسب احتياجات الخلايا. ويتحقق هذا التنظيم الحيوي في الجزء من خلال وظيفة lysosomes إزالة الفائض/تلف العضيات والجزيئات. ومن ثم، محتويات mitochondrial وتعويض الخلوية مؤشرات أساسية لتقييم التكيف الأيضي للخلايا. مع تطور التحقيقات العضيات، يحلول تتسم جيدا أو الأصباغ الميتوكوندريا على حدة قد أصبحت متاحة في أشكال مختلفة لتسمية lysosomes الخلوية والميتوكوندريا. قياس التدفق متعدد الألوان هي أداة مشتركة لتعمل الخلية الشخصية، ولديها القدرة على أن تكون متكاملة مع فحوصات أخرى. نقدم هنا، على بروتوكول مفصلة لكيفية الجمع بين الأصباغ عضية على حدة مع السطح علامات تلطيخ لقياس مقدار lysosomes والميتوكوندريا في السكان مختلفة تي خلية على سيتوميتير تدفق.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التنشيط وتكاثر الخلايا T خطوات حاسمة لتركيب الاستجابات المناعية ناجحة. التقدم الذي أحرز مؤخرا تشير إلى أن الأيض الخلوية يرتبط محكم مع كل من التنمية ووظائف خلايا تي. على سبيل المثال، خلايا السذاجة تي تعتمد إلى حد كبير على الفسفرة (أوكسفوس) لتلبية الطلب على الطاقة خلال تداولها فيما بين الأجهزة اللمفاوية الثانوية. عند التنشيط، الخضوع السذاجة تي خلايا جذرية الأيضية إعادة البرمجة، بما في ذلك تنظيم دورات تعريفية لتحلل الهوائية لزيادة إنتاج ATP والوفاء بمطالب الأيضية هائلة خلال تمايز الخلايا وانتشارها. الخلايا التي لا تتبع من خلال احتياجات الأيضية يموت قبل المبرمج1،2. أثناء إعادة برمجة التمثيل الغذائي، الميتوكوندريا ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ماوس الأنسجة الحصاد الإجراء الموضح هنا قد أقرها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة يانغ مينغ الوطنية.

1-إعداد تعليق اللمفاويات من الأجهزة اللمفاوية

  1. Euthanize الماوس بطريقة معتمدة مثل استنشاق أول أكسيد الكربون2 في دائرة اكريليك شفافة تليها التفكك عنق الرحم التأكد من الوفاة.
    ملاحظة: الاحتفاظ بمعدل تدفق CO2 لتشريد 20% في الدقيقة الواحدة من الدائرة، ولا يزيد عن 5 رطل/بوصة مربعة (رطل لكل بوصة مربعة). يستغرق 2-3 دقيقة لماوس ليفقد وعيه. الإبقاء على تدفق2 CO على الأقل 1 دقيقة بعد توقف الحيوان في التنفس (5-7 دقيقة عموما).
  2. ضع الماوس على ظهرها على متنها نظيفة (مثل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد مجموعات فرعية رئيسية تي الخلية في الطحال والغدة الصعترية

وباختصار، تعليق خلية مفردة من الطحال والغدة الصعترية تم تفكيك خلايا الدم الحمراء، المحتضنة مع المادة طافية 2.4G2، متبوعاً بصبغة محددة عضية وعلامة السطحية تلطيخ مع الأجسام المضادة مترافق الفلورية (الجدول 1). يمكن وصف التقدم التنموي من الثيموسيه باستخدام الأجسام المضادة لمستقبلات المشارك CD8 و CD4. لا تعبر عن خلايا CD4 أو CD8 الثيموسيه.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجمع هذا البروتوكول الأصباغ عضية على حدة وعلامة السطحية تلطيخ لتحديد مقدار الميتوكوندريا أو ليسوسوميس في السكان مختلفة تي الخلية. تم تطوير هذا الأسلوب للتغلب على الحد متطلبات الخلية عدد والتجانس للأساليب التقليدية، مثل الميكروسكوب الإلكتروني وتحليل إيمونوبلوت. أنها مفيدة بشكل خاص في تحليل الخلية نادرة السكان، ودراسة أنواع خلايا متعددة في وقت واحد في نفس الوقت.

مدة الإجراءات، ودرجة حرارة الحضانة هي أهم العوامل في هذا البروتوكول. وسم عضية السليم يتطلب معايرة دقيقة من الأصباغ عضية على حدة. ينبغي .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد وضع هذا البروتوكول المنح التي تقدمها "تايوان وزارة العلوم" والتكنولوجيا (معظم) NSC103-2320-B-010-002-MY2 و MOST104-2628-B-010-002-MY4 إلى هسو البنود. وي C.W. مستلم "ممتازة أطروحة جائزة من معهد لعلم الأحياء الدقيقة" وعلم المناعة، جامعة يانغ مينغ الوطنية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ملقط Graefe 10 سم (مستقيم ومسنن)مقص قزحية Dimeda
11 سم (مستقيم برؤوس حادة / حادة)أنبوب طرد مركزي Dimeda
15 ملThermo Fisher Scientific339650
5 مل حقنةTERUMO 
بتري 6 سم& ألفا ؛ - زائد
70 & م مصفاة خلايا النايلونSPL Lifesciences93070
كلوريد الأمونيوم (NH4< / sub>Cl)    استنساخ SigmaA9434
المضاد للفأر CD25Biolegend102007: PC61
مضاد للفأر CD4Biolegend100453استنساخ: GK1.5
مضاد للفأر CD44Biolegend103029استنساخ: IM7
مضاد للفأر CD62LBiolegend104407استنساخ: MEL-14
مضاد للفأر CD8Biolegend100713استنساخ:53-6.7
مكافحة الماوس TCR & بيتا ؛استنساخBiolegend109233: H57-579
BD LSR فورتيساBD Biosciences
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)بيو بيسك6381-92-6
فالكون 5 مل أنبوب البوليسترين المستدير القاع (أنبوب FACS) BDBiosciences352052
مصل الأبقار الجنيني (FBS) HycloneATD161145
Flowjo، LLCBD Biosciences
هيدروكسي إيثيل بيبيرازين إيثان سلفونيك حمض (HEPES)سيجماH4034
L-جلوتامين (200 ملم)GibcoA2916801
LysoTracker Green DND26Thermo Fisher ScientificL7526
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X)Gibco11140050
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514
البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل)بيكربوناتالبوتاسيوم 15140122
(KHCO3) جيتي بيكر298-14-6
محلول يوديد البروبيديومسيجما25535-16-4
RPMI 1640 متوسط (مسحوق)بيكربوناتالصوديوم 31800089
جيبكو (NaHCO3)سيجماS5761
بيروفات الصوديوم (100 ملم)11360070جيبكو
طبق جيبكو

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
  2. Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: i....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multicolor Flow CytometryMitochondria QuantificationLysosome DetectionT Cell AnalysisOrganelle specific DyesSurface Marker StainingFlow Cytometry ProtocolCell Surface MarkersPropidium Iodide StainingAuto Compensation Setting

Related Articles