مقالة منهجية

إعداد نشط إيقاعي في الحبل الشوكي الدماغ القوارض الولدان المختبر وشريحة رقيقة

DOI:

10.3791/58870

⸱

مارس 23, 2019

 ,  ,  , 
1Center for Perinatal Biology, Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 2Department of Biology, The College of New Jersey, 3Department of Neurosurgery, Loma Linda University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول على حد سواء بصريا يتصل إعداد الحبل الشوكي الدماغ وتوضح إعداد شرائح عرضية جذع الدماغ بطريقة تدريجية شاملة. أنه صمم لزيادة إمكانية تكرار نتائج وتعزز احتمال الحصول على شرائح قابلة للاستمرار، وطويلة الأمد، إيقاعي نشطة لتسجيل الإخراج العصبية من مناطق الدماغ الجهاز التنفسي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إنشاء إيقاع الشهيقيه الثدييات من شبكة الخلايا العصبية في منطقة لب يسمى preBötzinger في مجمع (pBC)، التي تنتج إشارة القيادة الإيقاعي انكماش العضلات الشهيقيه. النشاط العصبي الإيقاعية المتولدة في لجنة البرنامج والميزانية وإلى تجمعات الخلايا العصبية الأخرى لمحرك الأقراص قد درس عضلات التنفس باستخدام مختلف النهج، بما في ذلك كتلة من الأعصاب التسجيلات والتسجيلات شريحة عرضية. ومع ذلك، أساليب سبق نشرها لا على نطاق واسع وصف عملية تشريح النخاع الشوكي الدماغ بطريقة شفافة واستنساخه للدراسات المستقبلية. هنا، يقدم نظرة شاملة لأسلوب يستخدم لتكاثر قطع شرائح الدماغ النشطة إيقاعي يحتوي على الدوائر العصبية ضرورية وكافية لتوليد ونقل محرك الأقراص الشهيقيه. يستند هذا العمل إلى الحبل الشوكي الدماغ الكهربية البروتوكولات السابقة تعزيز احتمال موثوق بها الحصول على شرائح قابلة للاستمرار وايقاعي نشطة لتسجيل إخراج الخلايا العصبية من لجنة البرنامج والميزانية، الخلايا العصبية premotor hypoglossal (المجنحة الثاني عشر)، و هيبوجلوسال الخلايا العصبية الحركية (بالمليون الثاني عشر). ويتوسع العمل قدم الطرق المنشورة السابقة بتقديم توضيحات مفصلة، خطوة بخطوة للتشريح، من الفئران كله ألجرو، إلى شريحة في المختبر الذي يحتوي على rootlets الثاني عشر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتوفر الشبكة العصبية الجهاز التنفسي من جذع الدماغ مجال خصبة لفهم الخصائص العامة للشبكات العصبية الإيقاعي. على وجه الخصوص، المصلحة في تطوير القوارض الولدان في التنفس، وفهم كيفية تطور إيقاع التنفس. وهذا قد يكون تم استخدام نهج متعدد المستويات، بما في ذلك فيفو بليثيسموجرافي الحيوان كله، في المختبر كتلة تسجيلات العصبية، وفي المختبر شريحة التسجيلات التي تحتوي على مولد إيقاع التنفس. الاختزالية في المختبر أون الكتلة وشريحة التسجيلات طريقة مفيدة للاستخدام عند استجواب الآليات وراء رهيثموجينيسيس الجهاز التنفسي والدوائر العصبية في منطقة الحبل الشوكي الدماغ النامية القوارض. ويشمل تطوير الجهاز التنفسي تقريبا أنواع الخلايا 40، تتميز بإطلاق النار النمط، بما في ذلك الجهاز التنفسي المركزي1،2. وتشمل الشبكة الجهاز التنفسي وسط مجموعة من الخلايا العصبية نشطة إيقاعي يقع في لب فينترولاتيرال روسترال،من13. يتم إنشاء رهيثموجينيسيس الرئوي الثدييات من أوتورهيثميك إينتيرنيورون الشبكة التي يطلق عليها اسم preBötzinger معقدة (pBC)، التي كانت مترجمة تجريبيا عن طريق التحضير الكتلة شريحة واون من الثدييات حديثي الولادة جذع الدماغ-الشوكي الحبال3،4،،من56،،من78. يؤدي وظيفة مماثلة للعقدة sinoatrial (SA) في القلب هذه المنطقة ويقوم بإنشاء نظام توقيت الشهيقيه للتنفس بالسيارة. ويتم إيقاع الشهيقيه من لجنة البرنامج والميزانية، إلى مناطق أخرى في جذع الدماغ (بما في ذلك نواة موتور hypoglossal) وتجمعات السيارات العمود الفقري (مثل فرنك الخلايا العصبية الحركية التي تدفع الحجاب الحاجز)9.

النشاط الإيقاعي يمكن الحصول عليها باستخدام جذع الدماغ الحبل الشوكي أون الكتلة الاستعدادات أو شرائح من مجموعة متنوعة من السكان الخلية، بما في ذلك C3 C5 العصب rootlets، rootlets العصب الثاني عشر، نواة موتور hypoglossal (بالمليون الثاني عشر)، والخلايا العصبية premotor hypoglossal (ثاني عشر المجنحة)، و لجنة البرنامج والميزانية3،10،،من1112. بينما نجحت هذه أساليب جمع البيانات عبر عدد قليل من المختبرات، العديد من البروتوكولات لا تعرض بطريقة يتم استنساخه بالكامل للباحثين الجديد دخول الميدان. يتطلب الحصول على قابلة للاستمرار وايقاعي نشطة في التحضيرات الكتلة وشريحة اهتمام حاد بالتفصيل من خلال جميع الخطوات للتشريح وبروتوكول قطع شريحة. البروتوكولات السابقة على نطاق واسع تصف مختلف إجراءات التسجيل والكهربية، ولكن تفتقر إلى التفاصيل في الجزء الأكثر أهمية للحصول على إعداد أنسجة قابلة للتطبيق: تنفيذ إجراء تشريح وشريحة الحبل الشوكي جذع الدماغ.

يتطلب كفاءة الحصول على تحضير الكتلة أو شريحة إيقاعي نشطة وقابلة للتطبيق في الحبل الشوكي الدماغ الكهربية تسجيلات إجراء جميع الخطوات بشكل صحيح، بعناية وسرعة (عادة، الإجراء برمته ذات الصلة يمكن أن تكون هنا إجراء حوالي 30 دقيقة). وتشمل النقاط الحرجة البروتوكول الكهربية الحبل الشوكي الدماغ التي قد لا مسبقاً كذلك وصفت تشريح العصب rootlets وإجراء تشريح على فيبرتوم. هذا البروتوكول الأول من التدرجي مرئي تشريح النخاع الشوكي الدماغ جديد من الباحثين والخبراء في هذا المجال. ويوضح هذا البروتوكول أيضا دقة التقنيات الجراحية، والمعالم، وغيرها من الإجراءات لمساعدة الباحثين مستقبلا في توحيد شرائح و كتلة الأعمال التحضيرية لاحتواء الدوائر الدقيقة المطلوبة في كل تجربة. يمكن استخدام الإجراءات المعروضة هنا في الجراء الولدان الجرذ والفأر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم قبول البروتوكول التالي ووافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة لوما ليندا. يتم اتباع المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة للمعاملة الأخلاقية للحيوانات في جميع التجارب على الحيوانات في المختبر. وقد أيدت جميع المعايير الأخلاقية الأفراد الذين يؤدون هذا البروتوكول.

1-الحلول

  1. تحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام).
    1. إعداد جديدة قام مساء اليوم أمام تجربة في دفعات 1 لتر باستخدام ما يلي وصفه: 7.250 ز كلوريد الصوديوم (124 ملم)، 0.224 ز بوكل (3 مم)، 2.100 ز ناكو3 (25 مم)، 0.069 ز نة2بو4 • ح2س (0.5 ملم)، 0.247 ز مجسو4 • 7 ح2 O (1.0 مم)، و 5.410 ز د-الجلوكوز (30 مم)، ز 0.221 كاكل2 • 2 ح2س (1.5 مم). دائماً إضافة كاكل2 • 2 ح2س آخر.
    2. يذوب المكونات في 1 لتر مياه. يحرك لمدة 20-30 دقيقة.
    3. قياس درجة الحموضة من قام وضبط إلى 7.40 ± 0.02 استخدام كميات صغيرة (عادة < 0.5 مل) من هيدروكسيد الصوديوم أو كوه أو HCl مخفف.
      ملاحظة: يمكن تخزينها في الثلاجة (4 درجات مئوية، ودرجة الحموضة 7.40 ± 0.02) قام مستعدا لمدة ثلاثة أيام قبل أن يؤثر النمو البكتيري على صلاحية الأنسجة أثناء تجربة. استخدم 0.2 ميكرون المرشحات لتقليل التلوث بالفطريات أو البكتيريا الموجودة في المختبر منذ التجارب يمكن أن تستمر ما يصل إلى 36 س. للكفاءة، قد الارتقاء بوصفه قام وصف لدفعات ل 4 بعد البروتوكول نفسه، وهذا الحجم سوف تستمر لمدة تصل إلى ثلاثة أيام تجارب.

2-إعداد التشريح وتلاعب فيبرتوم

  1. إعداد شفرة.
    1. استخدام شفرات الحلاقة الطازج ذو حدين لقطع الأنسجة على فيبرتوم. أغسل الشفرة مع الإيثانول 100% والشطف بالمياه قبل قطع أو العض بليد في نصف وإدراج الشفرة في تصاعد المشبك في فيبرتوم.
    2. تغيير الشفرة كل مرة إعداد أنسجة جديدة هي التي شنت على فيبرتوم لتقطيع أو إذا تخفيضات في لوح البرافين بينما تشريح. أي بقايا البارافين سيجعل من المستحيل تقريبا قطع نظيفة من خلال الأنسجة العصبية في الأطفال حديثي الولادة.
  2. قم بإعداد لوح شمع البارافين.
    1. استخدام أي شمع البارافين أسلوب التضمين. ضع 10 غم من تضمين الوسائط في كوب زجاج تتحمل حرارة واستخدام الحرارة المنخفضة لإذابة الخرز شمع البارافين للسائل.
    2. إضافة حوالي 0.5 غم مسحوق الجرافيت ومزيج حل شامل وموحد في البارافين السائل.
    3. استخدام لوح بلاستيكية صغيرة كالركيزة البارافين. قطع قطعة صغيرة (0.5-1 سم وما يقرب من 2 × 2 سم2 على نطاق واسع) من البلاستيك (البولي أو الألومنيوم يمكن أيضا استخدامها). استخدام الملف في الماكنة الأخاديد التسويد في البلاستيك أستهيس سيضمن أن البارافين تتمسك بالبلاستيك.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدام إبرة حقن ز 18 ساخنة على مكان الزاوية ثقوب في الورقة لضمان أن تلتزم البارافين-الجرافيت المخلوط بالبلاستيك.
    4. استخدام الجزء الخلفي من قضيب نصيحة القطن بالتنقيط مزيج البارافين-الجرافيت على البلاستيك بغمس قضيب في الخليط المنصهر البارافين-الجرافيت مرارا وتكرارا، وتتساقط الملاط على كتلة البلاستيك، وبناء البارافين-الجرافيت إلى حوالي 1.5 سم في سمك على رأس البلاستيكية.
    5. مجرد طبقة سميكة بما فيه الكفاية من مزيج البارافين-الجرافيت مودعة لدى الكتلة، تعيين كتلة جانبا لتبرد ثم الشكل لاستيعاب الحبل الشوكي جذع الدماغ.

3-تشريح وعزله نيوراكسيس

  1. إجراء التشريح الأولى وأنيسثيتيزيشن.
    ملاحظة:     الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة قد تتراوح في حجمها الجنينية يوم 18 (E18) بعد الولادة يوم 10-20 في الفئران أو الجرذان تتراوح E18 يوما بعد الولادة 5/6. يمكن استخدام الجرذان أو الفئران من أي سلالة أو العلاج، أو نوع الجنس، اعتماداً على التصميم التجريبي. إجراء التخدير والتشريح الأولى تحت غطاء دخان حيث يتم استخدام إيسوفلوراني (0.25 مل في دائرة 25 مل).
    1. وزن ألجرو وثم وضعه في دائرة تخدير ليحتوي على 0.25 مل إيسوفلوراني توضع على 2 × 2 بوصة2 قطعة من الشاش. بعد وصول الحيوان إلى طائرة جراحية التخدير (يتم التحقق برشة أخمص القدمين مع لا انسحاب العاكسة)، دبوس الحيوان على طبق بيتري مليئة الاستومر البارافين أو السيليكون.
      ملاحظة: القوارض الولدان أيضا قد تكون تخديره عبر كريوانيسثيسيا13،14, isoflurane تبخير15، أو حقن16 متوازنة مع الأكسجين.
    2. ضع الجانب البطني الحيوان إلى أسفل وجعل شق من خط الوسط من خلف العينين إلى منطقة منتصف القطني في العمود الفقري مع شفرة المبضع عدد 10 أو 11 أو المقص الجراحي. تعكس البشرة وديسيريبراتي الحيوان على مستوى خياطة الجداري/القفوية (انظر الشكل 1) وإزالة الجلد ترانسيكتينج الحيوان تحت الحجاب الحاجز. قم بإزالة الأسلحة بالقطع في مفصل الكتف مع مقص أو مشرط.
    3. بمجرد إزالة الجلد، نقل الحيوان إلى دائرة التروية مع سيليكون الاستوميرين الأسفل لمزيد من التشريح، وإعداد الحبل الشوكي جذع الدماغ.
    4. فقاعة خزان قام (زجاجة الجانب المنفذ 500 مل) بشكل مستمر مع المثلجة (4 درجة مئوية ودرجة الحموضة 7.40 ± 0.02) قام والأوكسجين مع خليط من 95% O2 و 5% أول أكسيد الكربون2 (وتسمى أيضا "كاربوجين"). أثناء التشريح، استخدام قام مبردة لمسح دورياً الدائرة بتوفير قام اﻷوكسيجين الطازجة في جميع أنحاء عزلة الحبل الشوكي جذع الدماغ.
      ملاحظة: يمكن رؤية خلايا الدم الحمراء في الشرايين والاوردة المتبقية، وعندما بما فيه الكفاية اﻷوكسيجين، هذه أحمر.
    5. استخدام نضح خطورة التدفق عبر الأنابيب ومحبس الحنفية، إلى بشكل متقطع أو بشكل مستمر نتخلل الأنسجة مع اﻷوكسيجين قام (بلعه وحدة التخزين، أو عن طريق بطيئة بالتنقيط استخدام محبس الحنفية, حوالي 0.5-1.0 مل/دقيقة). وهذا الأكسجين في الأنسجة ويحافظ على حقل جراحية واضحة.
    6. إزالة السوائل الزائدة حسب الحاجة بنظام الترشيح شفط فراغ.
    7. إجراء التشريح استخدام مجهر تشريح. ويفضل نموذج تكبير مستمر للسماح بتسوية غرامة للتكبير، والسماح للتصور الأمثل لمنطقة الاهتمام خلال كل خطوة من التشريح.
      ملاحظة: أدوات الجراحة أوصى تشمل طائفة من ملقط مسنن الأنسجة، الملقط حادة، الملقط #5، ملقط الأنسجة المائلة، طائفة من مقص تشريح الصغرى (مقص الربيع)، والحشرات منتظمة ودبابيس تشريح الصغرى.
    8. كشف الدماغ عبر خط منتصف الجزء من الجمجمة على طول خياطة السهمي ثم دبوس أسفل اللوحات ينعكس مع دبابيس صغيرة تشريح ودبوس في العمود الفقري في نهاية والذيلية إلى أسفل قاعة التشريح باستخدام ز 27 المغطاة سيليكون إبرة.
      ملاحظة: ويتطلب بقية التشريح مجهر تشريح توفير صورة أوضح للأنسجة والمعالم المستخدمة لضمان أقصى احتمال الحصول على إخراج وهمية الإيقاعي في rootlets الجمجمة للدماغ والعمود الفقري rootlets. تنفيذ الخطوات التالية للتشريح باستخدام مقص الربيع متوسطة أو قزحية مقص وملقط غرامة.
  2. على الفور نقل جذع معزولة من الحيوان إلى غرفة تشريح التهوية. ضع الجانب الأنسجة الظهرية يصل مع نهاية روسترال (الدماغ) التي تواجه جبهة الدائرة. دبوس الأنسجة في الكتفين ونهاية والذيلية أكثر من الحبل الشوكي.
    1. جعل شق منتصف السهمي عن طريق الجمجمة بعد خياطة الجدارية لتجنب إتلاف اللحاء والدماغ الكامنة في الجمجمة.
      ملاحظة: نسيج العظام الأطفال حديثي الولادة هو ليس كاملا متكلسة وهو هش جداً. نسيج العظام/ستكون مرنة إلى حد ما، ولكن أكثر صرامة من الضامة المحيطة وأنسجة العضلات.
    2. استخدام مقص الربيع أو القزحية المتوسط لقص خيوط والقفويه الجمجمة، بدءاً خياطة السهمي وتعمل أفقياً. سيؤدي هذا إلى إنشاء "اللوحات" للجمجمة التي يمكن أن تنعكس والمثبتة لترسيخ الجزء روسترال من الجمجمة وتوفير بعض الاستقرار للأنسجة (انظر الشكل 2أ).
    3. بعد تعكس اللوحات الجمجمة، وقطع بقية قشرة الدماغ، تاركاً الجزء والذيلية من المخيخ (ودودة) سليمة نسبيا (الشكل 2ب).
  3. أداء الصفيحة الظهرية.
    1. إزالة العضلات المحيطة بالجمجمة والعمود الفقري باستخدام مقص الربيع الصغير والملقط. إزالة الأنسجة على طول الجانب الظهرية من القفص الصدري، ترك القفص الصدري سليمة، كما أن هذا سوف يعلق لاحقاً إلى ربط الأنسجة أثناء الاستئصال البطني، تقليل فرصة الضرر للحبل الشوكي.
    2. قص بعناية بعيداً عمليات الأفقي عن العمود الفقري باستخدام مقص الربيع متوسطة أو مقص آيريس غرامة. قص بعيداً أي أنسجة تغمر بونس ولب. الآن ستكون مرئية بوضوح (الشكل 2ج) ودودة، المخيخ، بونس، وبداية من الحبل الشوكي.
  4. إجراء الاستئصال البطني.
    1. رفض الجانب الأنسجة الظهرية ودبوس في القفص الصدري والأكثر والذيلية نهاية العمود الفقري. دبوس في الجانب روسترال من الأنسجة باستمرار استخدام اللوحات الجمجمة (الشكل 3أ).
    2. إزالة النصف البطني من القفص الصدري، بما في ذلك القص، وجميع أجهزة البطن باستخدام نفس المقص والملقط. تشريح الأنسجة اللينة بعيداً يعلق على القفص الصدري فضح الأضلاع والحبل الشوكي (الشكل 3ب).
    3. إزالة اللسان المريء والقصبة الهوائية، والحنجرة، وجميع الآخرين الأنسجة اللينة وعضلات تعلوها قاعدة الجمجمة والعمود الفقري (كما يتضح في الشكل 3ج).
    4. تشريح الأنسجة السطحية البالته الثابت. تحديد الحنك الصلب عن طريق تحديد موقع لوحة مستطيلة من العظام في قاعدة الجمجمة مع المسافة بادئة شكل الخامس على ذلك (الشكل 3ج). قص على طول خط الوسط للحنك، بعناية رفعه إلى أعلى، وأداء عرضية قطع لإزالته (الشكل 4أ).
    5. تبدأ الاستئصال البطني عن طريق إزالة عن تعريض السطح البطني جذع الدماغ والحبل الشوكي من أول فقرة سرطان عنق الرحم لحوالي الصدر فقرة 7 (T7) كما هو موضح في الشكل 4ب.
    6. وفي هذه المرحلة، سوف تكون rootlets البطني مرئية. استخدام تشريح مايكرو الصغيرة أو مقص الربيع، الحرص على جعل التخفيضات أقرب عن وكما بعيداً عن الأصل جذور في الحبل الشوكي قدر الإمكان؛ تجنب تمتد الجذور.
    7. 5-10 ملم على طول جانبي العمود الفقري في عن القصاصة. لا تقطع قريبة جداً للنخاع الشوكي أو في الفقرات. تسمح هذه الخطوة إزالة فقرات عنق الرحم للكشف عن الحبل الشوكي. تجنب قطع في rootlets.
    8. قص rootlets حوالي 20-25 مم (ثنائي) على طول العمود الفقري (T7 تقريبا). في جميع أنحاء هذا الإجراء تجنب قطع في الحبل الشوكي والتلاعب بحواف الفقرات كما هو موضح في الشكل 4ج.
    9. إزالة C1 و C2 و C3 برفع حافة روسترال لكل من الفقرات بعناية والقطع عن كثب تحت العظم. أقرب إلى عظم القص بذل، ويعد في روتليت. استخدام مدمن مخدرات أو بنت الملقط للمساعدة في تحقيق من أحكام قبضتهم على كل فقرة عنق الرحم أثناء إجراء تخفيضات (الشكل 4ج).
    10. حالما يتم عزل الطول المطلوب للحبل الشوكي وتشريح من العمود الفقري، جعل قطع عرضية لإزالة الحبل الشوكي (الشكل 5A و الرقم 5ب).
  5. إزالة الأم الجافية.
    ملاحظة:     الحبل الشوكي الدماغ معزولة يمكن استخدامها لتسجيل كتلة في المختبر كما تم وصفه سابقا3،7. مع الحبل الشوكي الدماغ إزالتها من العمود الفقري، يجب إزالة دوراً توفير الوصول الأمثل لأقطاب شفط لإجراء التسجيلات من قطع الجمجمة والعمود الفقري روتليس. بالإضافة إلى ذلك، إزالة دوراً يجعل من الممكن نظيفة شريحة جذع الدماغ، والحصول على شرائح رقيقة إيقاعي نشطة لتسجيل في المختبر.
    1. عناية روتليس دبوس معزولة جذع الدماغ-الشوكي الحبل الأنسجة الظهرية الجانبية يصل السماح بالوصول إلى بلده دوراً المحيطة الجمجمة (الشكل 5ب). وينبغي تطبيق دبابيس من خلال الهامش الجانبي من جذع الدماغ، روسترال إلى rootlets الثاني عشر.
    2. إزالة دوراً من سطح الظهرية جذع الدماغ برفع في بلده دوراً بالملقط غرامة (#5) في الهامش الظهرية دوراً وقطع من جانبية للأنسي عبر طول جذع الدماغ مع مقص الربيع الجميلة. كن حذراً لتجنب قطع في الدماغ نفسه. بلطف رفع الأوعية الدموية من سطح الدماغ وقطع لتجنب عائق النصل فيبرتوم عند تقطيع جذع الدماغ.
    3. عناية تشريح دوراً من الجوانب الآنسي والوحشي للدماغ، كما rootlets الأعصاب القحفية يمر بلده دوراً وسهولة وقع بعيداً عندما يرفع دوراً. تقليل احتمالية حدوث rootlets يجري اقتلع بقطع بلطف حولها مع مقص الربيع الصغيرة.
    4. الوجه الحبل الشوكي الدماغ حيث أن يواجه السطح البطني و rootlets الجمجمة مرئية بوضوح. تشريح دوراً من الجهة الظهرية من جذع الدماغ رفع في بلده دوراً بلطف مباشرة عبر postrema المنطقة، قطع من روسترال إلى والذيلية. سوف تظهر postrema المنطقة الوردي قليلاً بسبب العدد الكبير من ميكروكابيلاريس بيرفوسينج في هذه المنطقة.
    5. استخدام pin الحشرات الجميلة لندف بعيداً أي دوراً المتبقية وإزالة المتبقي من الأوعية الدموية بالقرب من rootlets الجمجمة وسرطان عنق الرحم.

4-شريحة البروتوكول

  1. بعد إزالة في دوراً، مكان في الدماغ في وسط منصة البارافين على كتلة البلاستيك (يشار إليه فيما يلي "كتلة قطع"). دبوس والذيلية نهاية الدماغ عن طريق الحبل الشوكي القاصي استخدام دبابيس الحشرات الدقيقة التي تم اقتطاعها بطول لا يزيد عن 1 سم كما هو موضح في الشكل 5ج.
  2. محاذاة الكتلة قطع البارافين المغطاة جذع الدماغ المثبتة في حامل كتلة فيبرتوم حيث أن الشفرة تخفيضات التعامد على وجه روسترال جذع الدماغ.
  3. جعل شريحة أولى لإزالة الأنسجة متفاوتاً، دخيلة على نهاية روسترال معظم. يمكن أن يكون هذا الخفض الأولى 200-300 ميكرون عادة ولكن بعناية تجنب إزالة rootlets الجمجمة التاسع والعاشر والثاني عشر. هذه الخطوة عادة ما تكشف عن مدى والذيلية نواة الوجه (السابع) و rootlets جلوسوفارينجيل ويجعل من الممكن لمحاذاة جذع الدماغ حيث يكون الوجه الاسمية المستوية إلى شفرة فيبرتوم. إجراء تعديلات صغيرة عند الاقتضاء لكفالة قدم المساواة-بلاناريتي وإجراء تخفيضات صغيرة لإزالة أنسجة غير متكافئ.
    ملاحظة: Rootlets Glossopharyngeal (تاسعا) ستكون مرئية في الحافة الجانبية للدماغ واحدة يقطع كل شريحة المتعاقبة، وهذه توفر معلما لمسافة rostro والذيلية للدوائر العصبية جذع الدماغ اللازمة لتوليد الإيقاع. على الجانب البطني من الدماغ، rootlets هيبوجلوسال (ثاني عشر) ينبغي أيضا مرئية والذيلية طفيفة في الوجه قطع عرض rootlets التاسع. ستكون معلما نهائي obex (نقطة في الدماغ البشري الذي يضيق البطين الرابع لتصبح القناة المركزية للحبل الشوكي) في وجه الظهرية جذع الدماغ. مع هذه النقاط الثلاث من مرجع مرئي، الصحيح القطع المنشأة (انظر الشكل 6A) وسيتم الحصول على شريحة نشطة إيقاعي موثوق بها.
  4. يستمر قطع روسترال إلى والذيلية rootlets التاسع بالقرب من سطح قطع وجه جذع الدماغ.
  5. الرجوع إلى الرقم 6 للمعالم والتوجه الصحيح. ضبط البارافين-لوح في المشبك فيبرتوم حيث أن زاوية ترانسيكشن القادم سوف إنشاء شكل طفيف جداً "آسفين" لقص الشريحة وقطع شرائح من حوالي 100-200 ميكرون حتى يمكن أن تكون معالم وصف يرى بوضوح (الشكل 6A).
    ملاحظة: قطع هذا آسفين طفيفا يزيد من العدد من الخلايا العصبية الحركية الثاني عشر أسر في الشريحة ويزيد من احتمال الحصول على النشاط الإيقاعي أثناء التسجيل. باستخدام المعالم الموصوفة (rootlets روسترال من حزمة العصب glossopharyngeal، rootlets من حزمة العصب هيبوجلوسال، obex) سوف تضمن أن الشريحة تحتوي على تكاثر على الأقل جزء كبير من لجنة البرنامج والميزانية (الشكل 6ب).
  6. قص شريحة 300-500 ميكرون من جذع الدماغ من هذه العلامات نيورواناتوميكال روسترال للقبض على لجنة البرنامج والميزانية، وانتقال الدوائر المرتبطة.
    ملاحظة: سيحتوي شريحة "مثالية" روتليت روسترال أكثر من حزمة روتليت هيبوجلوسال للحصول على نشاط الشهيقيه موثوق بها دون اللجوء إلى التسجيلات السطحية باستخدام شفط كهربائي عبر المكاني إيقاع-توليد/يحيل بها داخل جذع الدماغ.

5-تسجيل الإجراءات

  1. ضع الشريحة في دائرة تسجيل ونتخلل باستمرار مع قام (0.5-1.0 مل/دقيقة) واستخدام أقطاب شفط أو خارج الخلية للنشاط السكاني سجل من rootlets الثاني عشر، أو من لجنة البرنامج والميزانية، "بمنس الثاني عشر"، أو الثاني عشر موتونيورونس. للحصول على إجراءات تسجيل مفصلة، انظر المنشورات السابقة في الحبل الشوكي الدماغ الكهربية والتصحيح لقط10،11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطريقة المعروضة هنا يسمح باحث المهتمة في الحصول على شرائح إيقاعي النشطة من جذع الدماغ تكاثر وموثوق بها قص شريحة قابلة للحياة وقوية تتيح تسجيل الإخراج موتور وهمية لعدة ساعات. ويمكن التقاط جميع عناصر الدارة العصبية الحد الأدنى اللازم لتوليد ويحيل بها إيقاع الشهيقيه في شريحة رقيقة باستخدام هذا الأسلوب. وتشمل هذه العناصر: preBötzinger معقدة، والخلايا العصبية بريموتور توقع للخلايا العصبية الحركية hypoglossal (بكسي MNs) والخلايا العصبية الحركية hypoglossal (MNs الثاني عشر) والعصب هيبوجلوسال ro...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكييف البروتوكول المقدمة هنا إلى كتلة en أو شريحة سير العمل مفيد للمختبرات والدراسات التي تود أن تستخدم أما جذع الدماغ الشوكي كتلة و/أو رقيقة شريحة الأعمال التحضيرية للتسجيلات الكهربية. طريقة التشريح وشريحة عرض، جنبا إلى جنب مع الأساليب التي ذكرت سابقا قبل الآخرين17،،من1819، سيتيح إعداد استنساخه من أنسجة قوية وقابلة للتطبيق التي قابلة للتكيف على نطاق واسع لمجموعة من تجارب باستخدام hindbrain القوارض أو الحبل الشوكي. تشريح المقدمة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.B.P هو أحد المستلمين من "زمالة البحوث الجامعية الصيفية جامعة لوما ليندا".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كلوريد الصوديومفيشر العلميS271-500
KClسيجما ألدريتشP5405-1KG
NaHCO3فيشر ScientificBP328-1
NaH2PO4 & bull; H2OSigma AldrchS9638-25G
CaCl2& bull; 2H2OSigma AldrichC7902-500G
MgSO4& bull; 7H 2 < / sub >Oسيجما ألدريتشM7774-500G
D-GlucoseSigma AldrichG8270-1KG
مصباح هالوجين مصدر الضوء البارد 150 واطAmScopeH2L50-AY
تشريح المجهرLeicaM-60
Vibratome 1000 PlusVibratomeW3 69-0353
القاعدة المغناطيسيةKaneticMB-B-DG6C
Isoflurane ، USPPatterson VeterinaryNDC 14043-704-06
Sword Classic Double EdgeBlades Wilkinson97573
HistoclearSigma-AldrichH2779
Dumont # 5 أدوات العلوم الدقيقة الملقطالدقيقة 11254-20
Dumont # 5/45العلوم الدقيقة11251-35
شفرات مشرط # 10أدوات العلومالدقيقة 10010-00
مشرط هاندل # 3أدوات العلوم الدقيقة10003-12
مقص زنبركي مستقيم  أدوات العلوم الدقيقة15024-10
ملقط نمط ضيق مسننة / مستقيمةأدوات العلوم الدقيقة11002-12
Castroviejo مقص زنبركي تشريح صغير ؛ مقص RobozRS-5650
Vannas مستقيم 3 "دبابيس حشرات منحنيةRobozRS-5621
، 0أدوات العلوم الدقيقة / 884060426000-35   ؛
دبابيس الحشرات ، 0 ، أدوات العلوم الدقيقةSS 26001-35
دبابيس الحشرات ، 00أدوات العلوم الدقيقة26000-30
دبابيس الحشرات ، 00 ، أدوات العلوم الدقيقةSS 26001-30
دبابيس الحشرات ، 000أدوات العلوم الدقيقة26000-25
دبابيس الحشرات ، 000 ، أدوات العلوم الدقيقة SS26001-25
دقيقة دبابيس ، أدوات العلوم الدقيقة 0.10 مم26002-10
دبابيس دقيقة ، أدوات العلوم الدقيقة 0.15 مم26002-15
دبابيس دقيقة ، 0.2 ممأدوات العلوم الدقيقة26002-20
فيشر الأنسجة الإعدادية Parafin   ؛فيشرT56-5
الجرافيت فيشر G67-500
Delrin Plastic Grainger3HMT2
18 مقياس إبرة تحت الجلدBD305195
أدوات الملقط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
  2. Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6(2000).
  3. Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
  4. Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
  5. Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
  6. Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
  7. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
  8. Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
  9. Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113(2000).
  10. Rousseau, J. -P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071(2015).
  11. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
  12. Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
  13. Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
  14. Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
  15. Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
  16. Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
  17. Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
  18. Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island". Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
  19. Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
  20. Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
  21. Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
  22. Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
  23. Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
  24. Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
  25. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (1997).
  26. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press, Inc. (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PreB tzinger

مقالات ذات صلة