يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران

10K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58930

⸱

فبراير 22, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

في هذه المقالة

ملخص

هنا نقدم بروتوكولا أنيقة في فيفو التقييم للقاح الاستجابات المناعية فعالية والمضيف. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لنماذج اللقاح تلك الدراسة الفيروسية، البكتيرية، أو مسببات الأمراض الطفيلية.

الملخص

اللقاحات معجزة طبية قرنال 20. قد قلل جداً من معدلات الاعتلال والوفيات الناجمة عن الأمراض المعدية، وأسهم في زيادة ملفتة للنظر في متوسط العمر المتوقع العالم. ومع ذلك، تحديد فعالية اللقاح لا يزال يمثل تحديا. ظهور أدلة تشير إلى أن اللقاح اللاخلوي الحالية (aPV) السعال الديكي بورديتيلا (باء-السعال الديكي) الحث على الحصانة دون الحد الأمثل. ولذلك، تحديا كبيرا هو تصميم لقاح الجيل القادم الذي يستحث الحصانة الواقية دون الآثار الجانبية السلبية للقاح كامل الخلية (شلل). هنا يمكننا وصف بروتوكول التي استخدمت لاختبار فعالية واعدة، ورواية أخرى الأعشاب يشوه الاستجابات المناعية للنمط الظاهري Th1/Th17 واقية ويعزز تصريح أفضل من السعال الديكي باء- التحدي من الجهاز التنفسي مورين. توضح هذه المقالة بروتوكول للماوس التحصين والتلقيح البكتيري والأنسجة الحصاد وتحليل الاستجابات المناعية. باستخدام هذا الأسلوب، داخل نموذجنا، نحن قد شرحت بنجاح الآليات الحاسمة بلقاح السعال الديكي اللاخلوي واعدة، والجيل القادم. يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي نموذج من نماذج الأمراض المعدية من أجل تحديد فعالية لقاح.

المقدمة

اللقاحات تمثل واحدة من أعظم إنجازات الصحة العامة القرن العشرين، ومع ذلك لا تزال لا نفهم تماما الآليات التي تحفز اللقاحات ناجحة الحصانة الواقية. تحديد تواقيع الجزيئية (مثلاً.، علامات خلية التنشيط، والتوسع في المخططات الخلوية، وأنماط التعبير الجيني) التي يسببها بعد التطعيم يوفر مجموعة كبيرة معلومات للتنبؤ وتوليد نجاعة الاستجابة المناعية. تعقد استجابات المضيف الممرض لا يمكن تكرارها على نحو كاف تستخدم في المختبر نظم الثقافة الخلية1. في فيفو لقاح نماذج مصممة لتقييم أنواع الخلايا المناعية متعددة داخل البلد المضيف في الوقت ذاته. وهذا يوفر ميزة عندما وصف تجهيز مستضد لقاح والعرض التقديمي وإفراز سيتوكين التفاضلية، وتوسيع نطاق من الخلايا المناعية. ينص البروتوكول على وصف هنا طريقة مفصلة لتحديد فعالية اللقاحات عن طريق تقييم الاستجابات المناعية النظمية والمحلية والتحديد الكمي لعبء الممرض في الأنسجة للفائدة. المثال المتوفرة هنا اختبارات كفاءة لقاحاً تجريبيا لمسببات المرض بورديتيلا السعال الديكي (السعال الديكي (ب)).

باء-السعال الديكي هو بكتيريا سلبية الغرام الذي هو عامل المسببة للمرض الرئوي السعال الديكي (السعال الديكي)2،3. اتصال وثيق مع الأفراد المصابين (أعراض أو أعراض) يؤدي إلى انتقال العدوى، والاستعمار، والمرض. على الرغم من التغطية العالمية للقاحات هامة4، السعال الديكي يعتبر مرض مكافحتها في العديد من الدول في أنحاء العالم، ويشكل سببا رئيسيا للطفولة التي يمكن الوقاية منها وفاة5،،من67، 8-في عام 2015، باء-السعال الديكي والسعال الديكي وأدرجت في "المعهد الوطني للحساسية" والأمراض المعدية (نييد) الناشئة قائمة مسببات المرض/الأمراض المعدية، وإذ تشدد على الحاجة إلى تطوير لقاح أفضل أن يمنح الحصانة الواقية طويلة الأمد.

حاليا، منطقة نشطة للتحقيق للتحكم في ظهور السعال الديكي تطوير لقاح السعال الديكي اللاخلوي الجيل التالي (aPV) مع مزيج أمثل من رواية مأمونية ومولدات المضادات لتقليد الاستجابة المناعية بأسرها-الخلية السعال الديكي لقاح (شلل)9. أننا باستخدام بروتوكول وصف، ذكرت مؤخرا أن تعديل الحالي وافقت إدارة الأغذية والعقاقير aPV بإضافة adjuvant الرواية، عامل الاستعمار بورديتيلا A (بكفا)، أسفر عن تخفيض أكثر كفاءة من السعال الديكي (ب) الحمولة البكتيرية من ماوس الرئتين10،11. ورافق هذه الحماية زيادة انحراف المستحثة الشب Th1/Th2 استجابة مناعية إلى مزيد من الحماية الشخصية محصنة Th1/Th1710. هذا البروتوكول مفصل وشامل، تمكين المحقق للحصول على معلومات القصوى من خلال التقييم المتزامنة للمضيف والاستجابات المناعية لمجموعة متنوعة من العوامل الممرضة.

البروتوكول هو موضح هنا فيما يلي الجدول الزمني لقاح الممثل، هو مبين في الشكل 1، لكفالة الاستجابات المناعية المضيف الأمثل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب مع الحيوانات الحية بعد بروتوكول أقرته "الدولة ولاية أوهايو جامعة إياكوك" وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك. واستخدمت الفئران C57BL/6 في جميع التحصينات والالتهابات. وتستخدم الفئران الذكور والإناث على حد سواء في كل مجموعة وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة. العدد من الحيوانات كل مجموعة تحددها السلطة عمليات حسابية استناداً إلى الاختلافات المتوقعة في النتائج بين المجموعات التجريبية. على سبيل المثال، سوف تسفر عن الفئران 8 كل مجموعة الطاقة 80% في α = 0.05 (الوجهين) ل العينة 2 تي-اختبار للكشف عن الاختلافات في نتائج الاهتمام بالانحرافات المعيارية 1.33 (الحزب الديمقراطي الصربي).

1-تحصين الفئران

  1. إعداد مزيج لقاح رئيسي في المخزن مؤقت فسيولوجية عقيمة مثل المياه المالحة أو توزيعات أرباح.
    ملاحظة: ينبغي أن تشمل الحجم الإجمالي في المزيج 10% أكثر من ذلك العدد المطلوب لتحصين المجموعة بأكملها. التركيزات في تكوين اللقاح بالتفصيل أدناه في الخطوات 1.1.1 و 1.1.2. نقل العناصر إلى فيفاريوم على الجليد.
    1. السعال الديكي (ب) دراسات، وتشمل المجموعات اللقاح التالية: أبف وأبف + بكفا. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام الشب ولقاح المستضدات وحدها (FHA و Prn) والفئران (غير المحصنين) ساذجة كمجموعات التحكم.
      ملاحظة: أبف هو 1/5th الجرعة البشرية من aPV وافقت إدارة الأغذية والعقاقير، وهي مؤلفة من ذوفان الكزاز وتوكسيد الدفتيريا المخفضة، ولقاح السعال الديكي (PT)، هيماغلوتينين الخيطية (FHA) وبيرتاكتين (Prn) تمتز إلى أملاح الألمنيوم. واحد الجرعة البشرية الحالية السعال الديكي aPV 0.5 مل، وبالتالي، 1/5th جرعة 0.1 مل. تكون وحدات التخزين aPV + بكفا 0.1 مل من أبف (1/5th الجرعة البشرية) + مل 0.046 من بكفا (30 ميكروغرام) للماوس. حجم الحد الأقصى التي يمكن تسليمها بأمان للعضلات واحد 0.1 مل. لأن aPV + بكفا لقاح حجم أكبر من 0.1 مل، يجب أن يتم تسليم اللقاحات في كلا الكتفين، قسمت تقريبا على قدم المساواة، من أجل أن تدار بأمان.
    2. إعداد لقاحاً تجريبيا، لجرعة واحدة تجمع بين 1 ميكروغرام من FHA و 0.5 ميكروغرام من Prn 50 ميكروغرام لجل هيدروكسيد الألومنيوم في برنامج تلفزيوني العقيمة. السماح aPV التجريبية لخلط في اسطوانة مختبر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). وبعد ذلك، تدور الأنبوب في 18,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وريسوسبيند المحتويات في 1 مل PBS العقيمة.
  2. في فيفاريوم، قم بإعداد الجهاز التخدير (الشكل 2).
    ملاحظة: ضمان وجود مستويات كافية من الأوكسجين وإيسوفلوراني في دباباتهم كل منهما قبل الاستخدام. وزن العلبة الكاسح isoflurane واستبدال عندما يزيد وزنه من 50 جرام.
  3. دقة تنظيف مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC) والدائرة التعريفي النظيفة داخل بكالوريوس العلوم. توصيل خطوط التخدير والكاسح من آلة التخدير إلى الدائرة التعريفي. فتح الأوكسجين الدبابات عن طريق الجهة المنظمة لضمان الأوكسجين يتدفق وتعيين المستوى إلى 1.5-2 لتر في الدقيقة.
  4. ضع فئران عمر المطلوب (6-12 أسبوعا) في قاعة التعريفي. قم بتشغيل isoflurane 2.5-3% من أجل تخدير الفئران طفيفة. مراقبة الحيوانات حتى أنها لا تتحرك في الدائرة وقد تباطأ التنفس.
  5. اختبار مستوى التعريفي بأصبع القدم-معسر، مراعاة لأي حركة انعكاسية. إذا كان هناك لا شيء، ثم على استعداد لحقن الفئران.
    ملاحظة: في هذه التجربة، القفص كله من الحيوانات تم تخديره في وقت واحد. يمكن للمرء أن يختار لتخدير الحيوانات فردياً للحقن أو لحقن الحيوانات دون تخدير. أيا من هذه الأساليب المناسبة.
  6. ومن ناحية أخرى، تعد 1 مل الأنسولين المحاقن (28 1/2) مع 0.1 مل لقاح كل. عندما يتم الكامل الناجم عن الحيوانات، إزالة الحيوان واحد من الدائرة ووضع الماوس بطنيا على وسادة مقعد أو منشفة.
  7. إدارة اللقاحات في العضل. مع المحاقن بزاوية 45 درجة ومواجهة المجسم مشطوف الحواف، إدراج المحاقن ~ 5 ملم في ديلتويد الماوس وحقن اللقاح.
    ملاحظة: هند الربع/الجناح قد تستعمل كموقع حقن بدلاً من ديلتويد.
  8. بعد الحقن، الاحتفاظ إبرة تدخل في العضلات ل s ~ 5-10. حالما يتم تسليم وحدة التخزين، قم بتدوير المحاقن في 180° حيث أن المجسم مشطوف الحواف يواجه بعيداً لإنشاء ختم ومنع تسرب اللقاح. ثم، ببطء سحب الإبرة من موقع الحقن.
  9. العودة الماوس إلى القفص. كرر الإجراء مع جميع الحيوانات في المجموعة المعينة.
  10. إيقاف تشغيل في إيسوفلوراني وتدفق قاعة توجيهي مع الأكسجين قبل أنيسثيتيزينج القفص القادم من الفئران.
  11. مراقبة الحيوانات حتى أنهم جميعا التنبيه وتتحرك في القفص. العودة القفص إلى مكان السكن.
  12. مراقبة الحيوانات كل ح 12 وظيفة التطعيم، وتصل إلى 48 ساعة، للأعراض السريرية للمرض مثل معطف الخام/غير مهذب، بطء مشيه، أو احتملت التنفس. إذا استمرت الأعراض، التشاور مع الطبيب البيطري المؤسسية وإزالة الفئران من الدراسة إذا لزم الأمر.
  13. أربعة أسابيع بعد التحصين الأولى، تعزيز الفئران عن طريق أنيسثيتيزينج والدولة القائمة بالحقن العضلي في ديلتويد الأيمن الماوس مع نفس الصيغة اللقاحات التي أعطيت سابقا.
  14. ومرة أخرى، رصد الحيوان لأي أعراض سريرية. بيت الحيوانات لمدة 2 أسابيع إضافية وثم المضي قدما بالعدوى.

2-نمو سلالات السعال الديكي (ب) وإعداد من الإصابة بالعدوى

  1. من الأرصدة المجمدة [cryopreserved في-80 درجة مئوية في والغليسيرول 15%، المجمدة من نمو العوالق في وسائل الإعلام الملطخ-شولت (SS)12]، تكملها متواصلة من السعال الديكي باء- لوحات13 أجار بورديت-جينجو (حرس الحدود) على 10% ديفيبريناتيد الأغنام الدم و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (10% BG + Sm) للتحديد. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام.
  2. اختيار ~ 8-10 مستعمرات فردية من strain(s) من اللوحة وتطعيم 3 مل الإعلام SS تستكمل مع 22.8 مم L-سيستين، كبريتات الحديدية 3.6 ملم، والنياسين 3.3 ملم، الجلوتاثيون مم 48.8، 227 ملم حمض الأسكوربيك، هيبتاكيس 1 ملغ/مل و 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين. تنمو ثقافة عند 37 درجة مئوية في طبل اسطوانة 60 لفة في الدقيقة ح 16-24.
  3. وفي اليوم التالي تضعف مقاومة الثقافة الأولية، رافعة، 1:120، 1:60، 01:30، و 01:15 في 3 مل من وسائل الإعلام SS المكملة. احتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية في اسطوانة الاسطوانة 60 لفة في الدقيقة ح 16-24.
  4. إجراء قياسات الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) للثقافات البكتيرية. باستخدام جهاز المطياف الضوئي الترعة، تضعف الثقافات 01:10 عن طريق إضافة 0.1 مل ثقافات السائل إلى 0.9 مل PBS العقيمة.
  5. قم بتحديد ثقافة مع OD600≈ 0.8-1.2. حساب حجم اللازمة للحصول على التطوير التنظيمي 1 (الشكل 3). زيادة ونقصان لأسفل وحدة التخزين في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل في 6000 x ز لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلايا البكتيرية في 1 مل PBS العقيمة للحصول على كثافة OD مليلتر 1 [1-3 × 109 مستعمرة تشكيل/mL وحدات (زيمبابوي)].
  6. لإعداد العدوى من ~ 5 × 105 إلى 1.5 x 106 كفوس/الماوس في 40-50 ميليلتر، دوامة ومتسلسل تمييع الحل البكتيرية (من الخطوة 2، 5) معززات في 1 مل PBS العقيمة لتحقيق ~ 1-3 × 107 كفوس مليلتر (الشكل 4أ). نقل العدوى إلى فيفاريوم على الجليد.

3-نموذج العدوى داخل الآنف مورين

  1. في فيفاريوم، قم بتعيين شروط الأوكسجين والتخدير كما هو موضح في الخطوات 1.3 و 1.4. كما هو موضح في الخطوة 1، 5، وضع الفئران في قاعة لتخدير. مراقبة الحيوانات حتى يسري مفعول التخدير.
  2. عندما يتم تخديره من الفئران، إزالة الحيوان واحد في وقت واحد من الدائرة التعريفي. التقاط الماوس بالقفا الصدر الظهرية، خلف ريش الكتف والرقبة. ضع تستقيم الماوس الوصول إلى الآنف.
  3. استخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر، ببطء تطبيق 40-50 ميليلتر من العدوى البكتيرية إلى ناريس الماوس (20-25 ميليلتر في كل نار). أمسك الماوس حتى العدوى أكملها قد تم استنشاقه بالحيوان. إذا كان بعض الفقاعات العدوى بها، جمع الفقاعات وإعادة غرس في ناريس. تسليم مبلغ مساو من PBS العقيمة لمجموعة واحدة من الفئران كمراقبة سلبية.
  4. كما فعلت في الخطوات 1، 1، 10-12، إعادة الحيوانات الملقحين بها القفص ورصد الحيوانات حتى يتم تنبيه وتتحرك. العودة من القفص إلى مساحة السكن الأصلي الخاص به على الرف. مسح قاعة توجيهي مع الأكسجين لإزالة isoflurane المتبقية قبل أنيسثيتيزينج المجموعة التالية من الحيوانات. مراقبة الحيوانات للإصابة بعد 48 ساعة.
  5. في المختبر، تسليم لوحة تخفيف المسلسل من العدوى، في برنامج تلفزيوني عقيمة، للتحقق من كفوس الفعلي للفئران. لوحة 0.1 مل تخفيف 10% BG + لوحات Sm (الشكل 4أ). وضع اللوحات في الحاضنة 37 درجة مئوية وتنمو لمدة 4 أيام. عد وحساب كفوس من العدوى تسليمها للماوس (الشكل 4ب).

4-حصاد الأنسجة الحيوانية بعد الإصابة

  1. إعداد الماوس التشريح والأنسجة الحصاد.
    1. تعقيم كل الأدوات (مقص الخشنة وغرامة ومقص منحنى والملقط غرامة، والمدقات بيليه والموزعات المثلث) اللازمة لتجهيز الأنسجة في اﻷوتوكﻻف. ختم الأدوات في الحقائب التعقيم. لف الخالطون دونس الزجاج في إحباط وإضافة شريط اﻷوتوكﻻف للإشارة إلى العقم.
    2. إعداد أجار لوحات 1 أو 2 أيام قبل الحصاد الأنسجة للتأكد من وجود ألواح الصلب قبل الاستخدام. السعال الديكي (ب)، استخدام 10% BG + لوحات التسمية الدمتوسط الأنفي والقصبة الهوائية والرئة لكل الماوس مع تخفيف المرجوة، يحدد تجريبيا لكل تجربة.
    3. التعبئة وتسمية أنابيب تمييع زيمبابوي. إضافة مل 0.9 من PBS العقيمة لأنابيب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل تعتمد على عدد الأجهزة العملية وتخفيف كل جهاز.
    4. أنابيب التعبئة والتسمية لجمع الأنسجة:
      1. الأنفي والقصبة الهوائية: ملء أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل مع 0.3 مل الكازين 1% العقيمة في برنامج تلفزيوني (Ca2 + و Mg2 +-الحرة). مخزن في 4 درجات مئوية.
      2. الرئتين: إضافة 2 مل معقمة 1% الكازين في برنامج تلفزيوني إلى أنبوب مخروطي العقيمة 15 مل ومخزن في 4 درجات مئوية. حصاد الرئتين للأنسجة، إضافة 2 مل من 10% فورمالين مخزنة محايدة (NBF) وتخزينها في الرايت
      3. الطحال: أضف 3 مل من ربمي + 5% FBS لأنبوب مخروطي 15 مل. مخزن في 4 درجات مئوية.
      4. الدم: تسمية مجموعتين من أنابيب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل، واحدة لكل الدم والآخر للمصل.
    5. ينبغي إعداد جديدة 70% إيثانول لملء الأكواب والرش الزجاجات للتشريح.
  2. نقل جميع المواد إلى فيفاريوم على عربة في يوم الحصاد. تنظيف بكالوريوس العلوم وقم بإعداد الجهاز التخدير كما هو الحال في الخطوات 1.3 و 1.4.
  3. ضع الفئران أن تشريح في قاعة التعريفي، ومع الأكسجين المتدفقة، قم بتشغيل إيسوفلوراني بنسبة 5% وانتظر حتى الحيوانات فاقد الوعي. إزالة الفئران واحد في وقت واحد، وانخلاع سيرفيكالي الحيوان كوسيلة ثانوية لضمان الموت. عقب خلع عنق الرحم، ينبغي تأكيد القتل الرحيم بغياب سعر الجهاز التنفسي و/أو غياب منعكس سحب (تو قرصه الاختبار).
  4. ضع الماوس والجانب البطني التي تواجه، على لوحة التشريح ودبوس الذراعين والساقين مفتوحة. رذاذ أسفل الجسم للماوس مع الإيثانول 70%.
  5. استخدام الملقط، نتصافح الجلد أسفل البطن، في وسط الحوض. باستخدام مقص حاد، جعل خفض رأسي حتى الفك السفلي. ثم تشريح الجلد بعيداً عن الجدار البريتوني عن طريق دفع الطبقتين وبصرف النظر، واستخدام الطلبات الصغيرة مع المقص مغلقة. مكان الجلد إلى جانبي الذبيحة لإنشاء حقل دون عائق لحصاد الجهاز العقيمة.
  6. فهم الصفاق سليمة تحت القفص الصدري في أو حول الكبد وقطع عليه فتح تتحرك صوب القفص الصدري. كشف الجهاز الهضمي السفلي وتحريك القولون إلى اليسار يكشف عن الطحال. استخدام الملقط المنحنية، فهم الطحال وتفتيت النسيج الضام بعيداً مع المقص. مكان الطحال في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 3 مل ربمي + 5% FBS ومكان الأنبوب على الجليد.
  7. استخدام الملقط لتثبيت القفص الصدري في عملية الرهابه وقطع فتح الحجاب الحاجز. وينبغي أن انكماش الرئتين وسقوط نحو العمود الفقري. قص فتح القفص الصدري على الجانبين لإزالة لوحة الثدي.
  8. عزل وإزالة الفص متفوقة من الرئة اليمنى14، قطع الشرايين الرئوية والاوردة. ضع الفص في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 10% NBF ومكان الأنبوب في RT لمالا يقل عن 24 ساعة لإصلاح الأنسجة. عزل الفصوص المتبقية من الرئة اليمنى والرئة اليسرى. وضع الفصوص في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 2 مل الكازين 1% في برنامج تلفزيوني ووضعه على الجليد.
  9. وبعد قطع الأوردة الرئوية والشرايين تشريح خارج الرئتين، والسماح تجويف الصدر لملء مع الدم الماوس اكسسانجويناتيس. استخدام بيبيتمان 1 مل مع تلميح، جمع الدم ونقلها إلى الأنبوبة المسماة مسبقاً 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. ضع الأنبوب على الجليد.
  10. ثم، من العنق، وإزالة الأنسجة الرخوة (الغدد النكفية وتحت اللسان، وسوبماكسيلاري والغدد الليمفاوية) الذي يغطي القصبة الهوائية. افتح وإزالة الأغشية الواقية المحيطة بالقصبة الهوائية. استخدام الملقط غرامة ومقص، فصل دقيق، القصبة الهوائية من المريء وأي غيرها من النسيج الضام من أعلى من كولاربونيس إلى أسفل الفك السفلي.
  11. استخدام الملقط، التمسك بالقصبة الهوائية وقطع القصبة الهوائية في الجزء العلوي من الترقوة. هدم القصبة الهوائية لتحقيق أقصى قدر من المرونة وقطع القصبة الهوائية في الجزء السفلي من الفك السفلي اليمين فوق الحنجرة، عزل بقدر الإمكان (~ 1 سم). ضع الجهاز في أنبوب ميكروسينتريفوجي مسمى مسبقاً 1.5 مل مع 0.3 مل الكازين 1% في برنامج تلفزيوني ووضعه على الجليد.
  12. إزالة تثبيت الماوس ووضع بطنيا، مع الماوس التي تواجه الباحث للوصول واضحة للأنف. رذاذ الرئيس للماوس مع الإيثانول 70%، واستخدام الأيدي، أمسك الماوس مباشرة خلف الجمجمة.
  13. باستخدام مقص، قص بعيداً اللحم اللينة من الآنف، بدءاً من الجزء السفلي من الآنف وتتحرك نحو الأعلى. وبالإضافة إلى ذلك، إزالة الفراء والجلد، وشعيرات حول الآنف. ثم، مع ملقط ومقص منحنى، إدراج نصائح مقص ناريس مع منحنيات أشار إلى الخارج، وقطع فتح ممر الآنف نحو العينين، وخلق تشكيل مثل الخامس.
  14. استخدام الملقط الجميلة، جمع الأنفي والأنسجة اللينة داخل تكوين التي تم إنشاؤها. وضع الأنسجة في أنبوب ميكروسينتريفوجي مسمى مسبقاً 1.5 مل مع 0.3 مل الكازين 1% في برنامج تلفزيوني ووضعه على الجليد.
  15. التخلص من الجثة في حقيبة واقية. قبل تشريح الحيوان القادم، شطف الأدوات مع المياه. ومن ثم ضع في دورق مليئة إيثانول 70%. إزالة الأدوات والتخلص من فائض الإيثانول ثم المضي قدما في تشريح القادم
  16. تشريح الفأر كل اتباع الخطوات 4.3-4.14.
  17. عملية الأنسجة كما هو موضح أدناه.

5-تجهيز الطحال

  1. لننأى الطحال، وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر في طبق استنبات الأنسجة 60 ملم. صب الطحال ووسائل الإعلام المرافقة في عامل التصفية، باستخدام المكبس لحقنه 3 مل. تهرس الجهاز بعناية حتى وهو فصلها تماما وتصفيتها من خلال مصفاة الخلية.
  2. شطف عامل التصفية مع 3 مل ربمي + 5% FBS في طبق استنبات الأنسجة. جمع تعليق خلية ووضعه في أنبوب 15 مل الأصلي لها. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 450 غ س لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه الخلايا.
  3. نضح أو صب المادة طافية وخلايا الدم الحمراء التي ريسوسبيندينج بيليه في 2 مل من كلوريد الأمونيوم البوتاسيوم (ACK) المخزن المؤقت (كلوريد الأمونيوم 150 مم، 10 مم بيكربونات البوتاسيوم، يدتا الصوديوم 0.1 ملم). احتضان لمدة 3 دقائق في الرايت (25 درجة مئوية).
  4. ملء الأنابيب تصل إلى 8 مل مع ربمي + 5% أنابيب FBS وأجهزة الطرد المركزي في 450 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح أو صب المادة طافية. ريسوسبيند الكريات الخلية في 5 مل ربمي + 5% FBS والكونت سبلينوسيتيس باستخدام هيموسيتوميتير والمجهر.
  5. حساب حجم الخلايا اللازمة لحفز 2.5 × 106 خلايا كل بئر. في لوحة 48، حسنا، بذور الخلايا في 0.5 مل من وسائل الإعلام تي خلية (RPMI 1640 + 10% FBS و 10 ميكروغرام/مل الجنتاميسين و 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول) كل بئر.
  6. استناداً إلى العملية الحسابية أعلاه، وضع وحدة التخزين المطلوب من تعليق خلية في أنبوب جديد وبيليه-الخلايا في 450 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  7. ريسوسبيند بيليه في حجم تي خلية الوسائط المطلوبة. لنموذج إصابة السعال الديكي (ب) ، اختبار استجابة محددة مستضد سيتوكين المستضدات لقاح: بيرتاكتين (Prn)، والتصاق هيماغلوتينين الخيطية (FHA). ولذلك، هناك حاجة إلى علاجات 3: 1) أي التحفيز (NS، كالمراقبة السلبية) و 2) Prn 3) FHA. للمقايسة، هو 7.5 × 106 خلايا في 1.5 مل تي خلية الإعلام المطلوبة (2.5 × 106 خلايا كل 0.5 مل).
  8. الكوة 0.5 مل من تعليق خلية في لوحة 48-جيدا.
  9. لتنشيط الخلايا، مزيج من مولدات المضادات في أوقات 2 تركيز المطلوب في وسائل الإعلام تي خلية. تركيزات النهائي Prn و FHA = 1 ميكروغرام/مل و 0.5 ميكروغرام/مل، على التوالي. ولذلك، مزيج 2 ميكروغرام/ملليلتر 1 ميكروغرام/مل FHA في 0.5 مل أو Prn. ثم، الكوة 0.5 مل من المتوسطة التحفيز في كل عين حسنا، تمييع معاملة مستضد العاشر 1 بحجم نهائي في 1 مل في كل بئر.
  10. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2. جمع سوبيرناتانتس في يوم 7 ومل 0.5 الكوة من سوبيرناتانتس في أنابيب ميكروسينتريفوجي المسمى مسبقاً. تخزين العينات في-20 درجة مئوية حتى جاهز لاختبار محددة مستضد السيتوكينات بإليزا (الشكل 6).

6-تجهيز الرئتين

  1. نقل الرئتين (في 2 مل الكازين 1% في برنامج تلفزيوني) في 15 مل عقيمة، دونس الخالطون. استخدام مدقة مجانسة الأنسجة. ننأى حتى تبقى لا جزيئات كبيرة من الأنسجة. ضع تعليق المتجانس في الأنبوب 15 مل الأصلي.
  2. إزالة من 0.3 مل الكوة للطلاء كفوس والطرد المركزي هوموجيناتي على 450 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. جمع وقاسمه أنابيب المادة طافية في مختبرين 0.5 مل في السابق المسمى ميكروسينتريفوجي. تخزين العينات في-20 درجة مئوية حتى تحليل السيتوكينات من أليسا.
  3. إعداد تخفيف المختار بتمييع متسلسل 0.1 مل تعليق الرئة المتجانس في أنابيب التخفيف (0.9 مل PBS العقيمة). لوحة 0.1 مل تخفيف المختارة تجريبيا على المسمى من قبل حرس الحدود 10% + لوحات Sm وانتشار استخدام الناشرة مثلث العقيمة.
  4. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في هواء الغرفة لمدة 4 أيام.
  5. عد وحساب كفوس/الرئة (الشكل 6). بإيجاز، ضرب المستردة زيمبابوي الأرقام على عامل تخفيف اللوحة، ثم أيضا حسب الحجم الإجمالي الذي تمت فيه معالجة الجهاز. الحسابات زيمبابوي ثم تتحول إلى سجل10 قيم لكل الحيوانات ورسوم بيانية.
    1. لوحات مع 30-300 مستعمرة تحسب بسهولة ودقة. ينبغي أن لا تستخدم لوحات مع المستعمرات أقل من 6 للحسابات منذ إدخال هذه الأرقام منخفضة مستعمرة خطأ15. للحصول على حد أدنى من الكشف، ينقسم الحجم الإجمالي الذي كان تجانس جهازا بحجم استخدامها على الفور على صفيحة من هوموجيناتي غير مخفف (مثلاً.، 2 مل الحجم الإجمالي مقسوماً على 0.1 مل هوموجيناتي غير مخفف يساوي الحد الأدنى من 20 كفوس القابلة للاكتشاف).

7-تجهيز الأنفي والقصبة الهوائية

  1. مجانسة الأنسجة في مل 0.3% 1 برنامج تلفزيوني/الكازين مع بيليه مدقة الخالطون السيارات اللاسلكية. مجانسة الأنسجة 0.5-1 دقيقة حتى يتم فصل الأنسجة إلى حد كبير. وينبغي تسليط البكتيريا إلى التعليق.
  2. إعداد المختار 10 × تخفيف بتمييع المسلسل 0.1 مل من تعليق المتجانس في أنابيب تخفيف تحتوي على 0.9 مل PBS العقيمة. قبل المسمى دوت 0.1 مل من كل تخفيف إلى حرس الحدود 10% + Sm لوحات ونشر تعليق استخدام الناشرة مثلث أنه قد تم تعقيمها قبل الغسيل الإيثانول 70% ولهب.
  3. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في هواء الغرفة لمدة 4 أيام.
  4. عد وحساب كفوس/الجهاز كما هو الحال في الخطوة 6، 5 (الشكل 6). للحصول على حد أدنى من الكشف، ينقسم الحجم الإجمالي الذي كان تجانس جهازا بحجم المستخدمة إلى نقطة على طبق من هوموجيناتي غير مخفف (مثلاً.، الحجم الإجمالي 0.3 مل مقسوماً إلى 0.1 مل من غير مخفف يساوي الحد الأدنى من 3 كفوس ديتيكتا بلي).

8-تجهيز الدم

  1. الطرد المركزي هذه الأنابيب التي تحتوي على الدم كله المعزولة في 18,000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه خلايا الدم الحمراء.
  2. بعناية في الإقلاع المصل طافية وبيبيت في أنبوب ميكروسينتريفوجي مصل مسمى مسبقاً. تخزين الأنابيب في-20 درجة مئوية حتى على استعداد لإجراء مزيد من التحليل المتلقين للمعلومات (أي., أليسا Ig المجموع ومحددة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر نموذج وصف أسلوب لتقييم كفاءة اللقاح والاستجابات المناعية خلال التفاعلات المضيف الممرض. ويصور الشكل 1 الجدول الزمني الممثل اللقاحات المستخدمة لتحصين وتصيب الفئران وحصاد الأنسجة لتحليل. يوضح الشكل 2 إعداد نظام التخدير المستخدمة للحث على الفئران، تمكين المحققين لتقديم التحصينات والجرثومي إينوكولومس. ويبين الشكل 3 المثال OD600 القياسات والعمليات الحسابية لتحقيق التطوير التنظيمي 1 تعليق بك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كما سيسمح البروتوكول شاملة الموضحة هنا لدراسة الحصانة التي يسببها اللقاح للإصابة السعال الديكي (ب) تقييم الاستجابات المضيف لمجموعة متنوعة من العوامل الممرضة الأخرى. البروتوكول يناقش أساليب تقديم التحصينات، وتحديد التالي فعالية لقاح الممرض التحدي، وتشريح موازية لوظيفة المناعة. في التكيف مع البروتوكول من أجل دراسة مسببات الأمراض الأخرى، العديد من المعلمات سوف تحتاج إلى تعديل. هذه تشمل، ولكنها لا تقتصر على، طريقة تخدير الحيوان وتركيبة اللقاح والجرعة والتعاطي. وباﻹضافة إلى ذلك، الجرعة والتعاطي الممرض المطعون فيه من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد 1R01AI125560-01 وبدء الأموال من "جامعة ولاية أوهايو" هذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غرفة الحث 2 لترVet Equip941444
FlurisoVet OneV1 501017أي علامة تجارية مناسبة
Bordet Gengou Agar BaseBD bioscience248200
CaseinSigmaC-7078
أحماض الكازامينوVWRJ851-500Gمصفاة مكونات الوسائط Scholte (SS
حمض L-Glutamicالمنتجات البحثية IntG36020-500
L-ProlineResearch Products IntP50200-500
كلوريد الصوديومفيشرBP358-10
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةفيشرBP362-1
كلوريد البوتاسيومفيشرP217-500
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتفيشرM2670-500G
كلوريد الكالسيومفيشرC75-500
قاعدة تريسفيشرBP153-1
L-cysteine HClFisherBP376-100SS وسائل الإعلام
كبريتات الحديدوز سباعي الهيدراتSigmaF-7002
منتجات أبحاث النياسينIntN20080-100
الجلوتاثيونالمنتجات البحثية IntG22010-25
أبحاث حمض الأسكوربيكIntA50040-500
RPMI 1640ThermoFisher Scientific11875093
FBSSigmaF2442-500mL  أي مصدر أمريكي ،
جينتاميسينThermoFisher Scientific15710064
B-mercaptoethanolFisher & nbsp غير معطلة بالحرارة ؛BP176-100
15 مل طاحونة مناديلWheaton357544أي علامة تجارية مماثلة مناسبة
الخالط اليدوياللاسلكي Kontes / Sigma   ؛Z359971-1EAأي علامة تجارية مماثلة مناسبة
الأدوات - مقص ، مقص منحنى ، ملقط ، ملقط دقيق ، موزعات مثلثة، أي علامة تجارية مناسبة
3 مل محاقنBD علم الأحياء309657
أنابيب مخروطية 15 ملفيشر & nbsp ؛339651
أنابيب الطرد الدقيق سعة 1.5 مل مصافيالخلايا DenvilleC2170
70umFisher & nbsp ؛22363548
ألواح 60 ممThermoFisher Scientific130181
ألواح زراعة الأنسجة 48 بئرThermoFisher Scientific08-772-1C
1 مل حقنة الأنسولين 28G1 / 2Fisher Scientific / Excel Int.14-841-31
ماوس IFN-جاما ELISA جاهز للذهاب! كيتInvitrogen / eBioscience50-173-21
ماوس IL-17 ELISA جاهز للذهاب! كيتInvitrogen / eBioscience50-173-77
Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! كيتإنفيتروجين / علم الأحياءالإلكتروني 50-172-09
) منتجات

المراجع

  1. Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
  2. Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
  3. Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
  4. Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
  5. Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
  6. Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
  7. McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
  8. Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
  9. Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
  10. Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
  11. Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
  12. Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
  13. Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
  14. Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
  15. Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
  16. Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
  17. Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
  18. Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
  19. Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
  20. Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
  21. Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
  22. Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
  23. Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178(2010).
  24. Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
  25. Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
  26. Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
  27. Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
  28. Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469(1988).
  29. Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
  30. Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
  31. Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264(2013).
  32. Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
  33. Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
  34. Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
  35. Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359(2012).
  36. Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
  37. Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
  38. Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
  39. Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
  40. Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
  41. Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
  42. Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
  43. Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
  44. Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استجابة المضيف لمسبب المرضتحصين الفئرانالتلقيح البكتيريحصاد الأنسجةتعداد الوحدات المكونة للمستعمرةقياس التدفق الخلويتحليل البقع المناعية (ELISpot)بكتيريا السعال الديكي (Bordetella Pertussis)استقطاب Th1 Th17
تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.