نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتقنية زيموجرافيك معدلة التي تستخدم الببتيدات فلوري كالركيزة القابلة للتحلل بدلاً من البروتينات الأصلية. التفريد العينات البيولوجية في الببتيد نيون زيموجرامس تمكن من كشف طائفة أوسع من البروتياز تقنيات زيموجرافيك السابقة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
والغرض من هذا الأسلوب لقياس النشاط proteolytic العينات البيولوجية المعقدة. يتم فصل العينات بالوزن الجزيئي باستخدام التفريد من خلال حل جل المضمنة مع ركيزة القابلة للتحلل. يختلف هذا الأسلوب عن زيموجرافي هلام التقليدية في ببتيد فلوروجينيك مروي تساهمي أدمجت في جل حل بدلاً من كامل طول البروتينات، مثل الجيلاتين أو الكازين. استخدام الببتيدات فلوروجينيك تمكن من كشف مباشرة من نشاط proteolytic دون خطوات إضافية المصبوغة. الإنزيمات في عينات بيولوجية تنشق الببتيد فلوروجينيك مروي، أدى إلى زيادة في الأسفار. إشارة مضيئة في المواد الهلامية ثم تصويرها مع ماسح ضوئي جل فلورسنت قياسية وكمياً باستخدام قياس كثافة. استخدام الببتيدات كالركيزة القابلة للتحلل يوسع إلى حد كبير البروتياز المحتملة القابلة للاكتشاف مع تقنيات زيموجرافيك.
المقدمة
زيموجرافي هلام تقنية بيولوجية المستخدمة لقياس النشاط proteolytic داخل العينات البيولوجية، مثل سوائل الجسم أو الخلية وسائط الثقافة1،،من23. يتم فصل العينات أوزانها الجزيئية مع التفريد خلال جل polyacrylamide المضمنة مع ركيزة القابلة للتحلل. وتشمل مشتركة الركازات التحلل الجيلاتين، الكازين، الكولاجين والايلاستين، التي استخدمت لقياس نشاط ميتالوبروتيناسيس مصفوفة (يتولى)-1،-2،-3،-7،-8،-9، و-11، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من كاثيبسينس1،2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8-بعد التفريد، الإنزيمات ريناتوريد وسمحت للحط من البروتين داخل الجل. في زيموجرافي هلام التقليدية، الهلام هو ملطخة بصبغة بروتين، مثل أخذ الأزرق، وتم الكشف عن نشاط البروتياز كفقدان إشارة، وعصابات (تحلل البروتين) أي أبيض على خلفية زرقاء داكنة.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لطريقة بديلة لجل زيموجرافي، الذي الركيزة القابلة للتحلل قصيرة، الببتيد فلوروجينيك تساهمي أدرجت في جل polyacrylamide (الشكل 1). الاستعاضة عن الببتيدات الاصطناعية كركائز للتحلل تمكن من كشف مجموعة أوسع نطاقا من البروتياز بالمقارنة مع زيموجرافي هلام التقليدية مع البروتينات الأصلية9. الروابط التساهمية من الببتيد فلوروجينيك يمنع نشر الببتيد والهجرة أثناء التفريد جل لاحظ مع الأساليب السابقة9،10. علاوة على ذلك، يمكن استخدام الركيزة فلوروجينيك الكشف المباشر لنشاط البروتياز دون تلطيخ إضافية وخطوات إزالة المصبوغة. والهدف العام لهذا الأسلوب هو الكشف عن نشاط البروتياز في العينات البيولوجية عن طريق إدماج الببتيدات فلوروجينيك في الهلام زيموجرام التساهمية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد طبقة جل حل
- إعداد polyacrylamide 10% من حل حل جل وفقا الجدول 1. إضافة تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) وفوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) مباشرة قبل سكب الهلام كما يبدأ إضافة رد فعل البلمرة.
- ملء كاسيت جل مصغرة فارغة 1.5 مم نصف الطريق (5 مل) مع حل جل حسم 10 في المائة.
- إضافة طبقة رقيقة من الايزوبروبانول (~ 500 ميليلتر) إلى الجزء العلوي من جل polyacrylamide لإنتاج هلام مستوى ومنع الفقاعات. استخدم الحل polyacrylamide بقايا لتتبع التقدم المحرز في تفاعل البلمرة. عندما بولياكريلاميدي في الأنبوب قد وطدت تماما، رد فعل كاملة (~ 40 دقيقة).
2-إعداد الجزيء رابط أزيدو-PEG3-ماليميدي
- بينما حل جل الطبقة الأولى هو مبلمرة، استرداد كيت أزيدو-PEG3-ماليميدي من التخزين-20 درجة مئوية والسماح للمكونات لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. تجدر الإشارة إلى أن هناك عنصرين في كل مجموعة. قنينة 1 يحتوي إستر ماليميدي--دائرة الصحة الوطنية، البيض إلى رمادي صلب. فيال 2 يحتوي على أزيدو-PEG3-أمين، زيت أصفر قليلاً.
ملاحظة: يقترح المؤلفون استخدام كيت أزيدو-PEG3-ماليميدي 25 ملغ كما يمكن تخزينه فقط لفترات قصيرة من الوقت (1-2 ساعة) في-20 درجة مئوية بعد إعداده قبل أن تبدأ أن تتحلل. 25 ملغ كافية لإنتاج 10 الببتيد الهلام. استخدام المواد الهلامية في غضون 3 أسابيع التحضير. - حل مكونات 2 قنينة في الشركة المصنعة وأوصى حجم ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) ودوامه لمدة 30 s لضمان السوائل متفاوتة أيضا.
- نقل محتويات 1 قنينة إلى قارورة مستديرة قاع نظيفة وجافة 100 مل التي تحتوي على شريط إثارة.
ملاحظة: شطف قارورة مع الأسيتون وجاف تماما قبل الاستخدام لمنع الرطوبة من التداخل مع رد فعل. - فورا إدراج سداده الغشاء المطاطي مع غشاء يمكن تثقيب مع حقنه في فم قارورة. العمل بسرعة للحيلولة دون دخول في قارورة الرطوبة.
- إدراج اثنين 18 قياس المحاقن الإبر إلى الحجاب الحاجز والاتصال واحد إلى خزان غاز خامل (مثل غاز الأرجون). السماح غاز خامل لملء قارورة للحد الأدنى 3 مزيج مكونات قنينة 1 و 2 تحت غاز خامل لمنع منتجات رد فعل غير مرغوب فيها.
تنبيه: إبرة حقنه الثاني توفير تنفيس، مما يسمح للهواء الجوي داخل قارورة تتدفق من قارورة حيث يملأ بغاز خامل. لا تنسى أن تدرج إبرة تنفيس! - إيقاف غاز خامل ويفصله من الإبرة. استخدام المحاقن، حقن كامل محتويات قنينة 2 قارورة.
- إزالة الإبر والمحاقن، والسماح للعناصر المزيج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بينما التحريك.
- إزالة سداده الغشاء المطاطي ونقل المحتويات إلى أنبوب الطرد مركزي نظيفة 5 مل. يجب أن تستخدم الحل أزيدو-PEG3-ماليميدي 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
3-إعداد الببتيد حل طبقة هلام
- بمجرد حل أول جل قد بلمرة طبقة، من أجل إيقاف طبقة الايزوبروبانول. شطف الجزء العلوي من الجل من بيبيتينج 1 مل من المياه على رأس الجل وثم صب قبالة المياه.
- استرداد الببتيد نيون فونكتيوناليزيد ثيول من مخزن-80 درجة مئوية، والسماح لها بالذوبان في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن تحضير الببتيد فونكتيوناليزيد ثيول كما هو موضح سابقا11،12. الببتيدات متوفرة تجارياً يمكن أن تستخدم أيضا ولكن تتطلب إضافة بقايا سيستين المحطة الطرفية لتمكين ماليميدي-ثيول انقر فوق رد. حل الببتيد إلى تركز أسهم من 10 ملم وتخزينها في-80 درجة مئوية في مختبرين (30 ماي) الصغيرة للحد من دورات تجميد أذاب المتكررة. - إعداد 10 ٪ حل جل محلول يحتوي على جزيء رابط أزيدو-PEG3-ماليميدي والببتيد الفلورسنت وفقا الجدول 1. إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية فورا قبل سكب الهلام كما يبدأ إضافة رد فعل البلمرة.
- ملء نصف الجزء المتبقي من كاسيت هلام (3 مل) مع الببتيد حل جل الحل.
ملاحظة: اتباع نهج متعدد الطبقات جل حل يقلل من كمية الببتيد ورابط اللازمة لكل جيل. يمكن ضبط حجم طبقة جل حل الببتيد لاستيعاب أكبر مجموعة من الأوزان الجزيئية حسب الحاجة. - "الماصة؛" طبقة رقيقة من الايزوبروبانول (~ 500 ميليلتر) إلى الجزء العلوي من جل polyacrylamide لإنتاج هلام مستوى ومنع الفقاعات. استخدم الحل polyacrylamide بقايا لتتبع التقدم المحرز في تفاعل البلمرة. عندما بولياكريلاميدي في الأنبوب قد وطدت تماما، رد فعل كاملة (~ 40 دقيقة).
ملاحظة: الببتيد نيون حساسة للضوء. الحفاظ على المواد الهلامية مغطاة برقائق الألومنيوم لمنع فوتوبليتشينج أثناء إعداد جل والتفريد والغسيل والتنمية. - من أجل إيقاف طبقة الايزوبروبانول وشطف الجزء العلوي من الببتيد حل جل مع المياه. كما في الخطوة 3، 1.
- إذا كان استخدام المواد الهلامية على الفور، انتقل إلى الخطوة 4، خلاف ذلك، تزج استعداد المواد الهلامية في 100 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجات مئوية في علبة بلاستيكية لمنع المواد الهلامية من الجفاف. التفاف المربع في رقائق الألومنيوم لمنع فوتوبليتشينج. ويمكن تخزين المواد الهلامية في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى 3 أسابيع قبل الاستخدام.
4-إعداد التراص هلام
- إعداد حل جل تراص 5% وفقا الجدول 1. إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية فورا قبل سكب الهلام كما يبدأ إضافة رد فعل البلمرة.
- ملء الجزء المتبقي فارغة من كاسيت هلام (~ 2 مل) مع حل جل التراص.
- بسرعة إدخال مشط جل 1.5 مم في طبقة جل التراص، والتأكد من أي فقاعات لا تزال المحاصرين تحت الآبار. استخدم الحل polyacrylamide بقايا لتتبع التقدم المحرز في تفاعل البلمرة. عندما بولياكريلاميدي في الأنبوب قد وطدت تماما، رد فعل كاملة (~ 10 دقيقة).
- إزالة بلطف المشط والشريط من الجزء الخلفي كاسيت هلام.
5-إعداد العينات البيولوجية للتفريد
- إعداد الوسائط المحمولة مكيفة وخلية ليساتيس، homogenates الأنسجة ومعايير نظام التمثيل التناسبي المختلط كما هو موضح في مكان آخر تحت ظروف غير الحد2. لا تسخين عينات.
- على سبيل المثال، تعد الخلية مكيفة وسائل الإعلام على النحو التالي:
- لوحة 40,000 الخلايا/سم2 الخلايا الموجودة في لوحة 6-جيدا في 10% مصل بقرى الجنين (FBS) ثقافة الإعلام. احتضان خلايا في دائرة هوميديفيد (5% CO2 في 37 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة، والسماح لهم بالوصول إلى التقاء 70-80%.
ملاحظة: إذا لم يبلغوا الخلايا كونفلوينسي المرجوة بعد 24 ساعة، تسمح لهم بالنمو في 10% FBS ثقافة وسائل الإعلام عن 24 ساعة إضافية. - تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل وسائط ثقافة خالية من المصل. احتضان الخلايا في دائرة هوميديفيد (5% CO2 في 37 درجة مئوية) ل 24 ساعة إضافية.
- استخدام ماصة مصلية، جمع وسائل الإعلام مكيفة من كل بئر. الطرد المركزي وسائط الإعلام 1200 لفة في الدقيقة لمدة 3 دقائق لإزالة أي حطام الخلايا. تأخذ المادة طافية والتركيز على استخدام 15 مل، والوزن الجزيئي كاتشين 10 قطع تصفية الطرد المركزي وحدة. الطرد المركزي وحدات التصفية في 4000 x ز لمدة 15 دقيقة في دوار دلو يتأرجح أو 5,000 ز س لمدة 15 دقيقة في دوار زاوية ثابتة.
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ولكن يمكن تعزيز كثافة العصابات proteolytic في الهلام زيموجرافي الببتيد. - نقل filtrate تتركز على أنبوب الطرد مركزي طازجة 1.5 مل. قاسمة وتخزين العينات في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاث دورات تجميد أذاب.
- لوحة 40,000 الخلايا/سم2 الخلايا الموجودة في لوحة 6-جيدا في 10% مصل بقرى الجنين (FBS) ثقافة الإعلام. احتضان خلايا في دائرة هوميديفيد (5% CO2 في 37 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة، والسماح لهم بالوصول إلى التقاء 70-80%.
- التحديد الكمي لمحتوى البروتين باستخدام تحليل الكمي بروتين قياسية (مثل اتفاق التعاون الأساسي، "مقايسة برادفورد"، إلخ).
6-التفريد البيولوجية عينات في الهلام زيموجرافي الببتيد
- حل عينات في المخزن المؤقت لنموذج زيموجرافي التقليدية (62.5 مم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8، والغليسيرول 25%، 4% الحزب الديمقراطي الصربي، 0.01 ٪ بروموفينول الأزرق). لعينات الخلايا والأنسجة، من المستحسن ~ 30 ميكروغرام من البروتين الكلي للبئر، و 50-100 نانوغرام من البروتين لمعايير نظام التمثيل التناسبي المختلط.
- إضافة 400 مل 1 × تريس-جليكاين "الحزب الديمقراطي الصربي تشغيل المخزن المؤقت" لجهاز هلام. تحميل يصل إلى 35 ميليلتر للعينة الواحدة جيدا. تشغيل العينات في 120 V في 4 درجات مئوية لمدة 1.5 ساعة أو حتى بمعايير الوزن الجزيئي تشير إلى أن البروتياز الاهتمام داخل الببتيد حل طبقة هلام (التي لون برتقالي مرئية).
ملاحظة: يتولى معظم وأشكالها تقع ضمن نطاق كاتشين 35-100. عندما معايير الوزن الجزيئي تشير إلى أن هذه الأوزان داخل الببتيد حل طبقة هلام، يمكن إيقاف التفريد. يمكن تطبيق نفس المبدأ على فئات أخرى من البروتياز مع الأوزان الجزيئية المعروفة. إذا لم يكن هناك مصلحة في الكشف عن البروتياز متعددة على نطاق أكبر من الأوزان الجزيئية، تقليل حجم طبقة جل حل وزيادة حجم طبقة جل حل الببتيد. - وبعد التفريد، إزالة المواد الهلامية من الكاسيت البلاستيك وتغسل الجل ثلاث مرات لكل 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت الانفعالات لطيف في المخزن المؤقت ريناتورينج التي تحتوي على 2.5% X-100 تريتون و 1 ميكرومتر زنكل2و 5 مم كاكل2 في 50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5.
- نقل المواد الهلامية إلى حل نامية المخزن مؤقت الذي يحتوي على 1% X-100 تريتون، 1 ميكرومتر زنكل2 والمخزن المؤقت الحل كاكل 5 مم2 في 50 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5 لاستبدال 15 دقيقة مع وضع جديد واحتضان المواد الهلامية في 37 درجة مئوية تحت الانفعالات لطيف لمدة 24 ساعة ، مع التأكد من أن المواد الهلامية هي سوبميرسيد تماما في الحل.
7-تصوير زيموجرافي الببتيد والهلام
- بعد 24 ساعة، جل الجل الصورة فلوري باستخدام الماسح الضوئي/جهاز التصوير باستخدام عوامل التصفية المناسبة الإثارة والانبعاثات. على سبيل المثال، المواد الهلامية الببتيد سيظهر في نتائج الممثل هي مترافق مع Fluorescein وتم تصويرها باستخدام عامل تصفية إثارة من 488 نانومتر وعامل تصفية انبعاثات من 521 شمال البحر الأبيض المتوسط. استخدام عوامل التصفية المناسبة لجهاز فلوروفوري سوف تعظيم الكشف عن نشاط بروتيوليتيك.
ملاحظة: يمكن أن تؤخذ الصور أيضا مع تصوير جل مجهزة ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية، غالباً ما تستخدم لتصوير الحمض النووي الهلام الملون مع اثيديوم بروميد. صورة الجل استخدام ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) الإعداد وعامل تصفية انبعاثات من 590 نانومتر. - إجراء تقييم دينسيتوميتريك للفرقة كثافات استخدام إيماجيج كما هو موضح في مكان آخر من13.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدام الطريقة الموصوفة هنا، واثنين من الببتيدات حوزتي التحلل الفلورسنت أدرجت في الهلام polyacrylamide: GGPQG↓IWGQK(PEG)2ج (مختصر النحو قجيو في جميع أنحاء النص والأرقام) و GPLA↓CبميوبزلWARK(PEG)2 (ج) (مختصر النحو لاكو طوال النص والأرقام). ↓ يشير إلى الموقع للانقسام. قجيو هو الكولاجين--أنا مشتقة تسلسل مصممة للكشف عن collagenases الخلوية14. لاكو هو سلسلة التي تم الأمثل للكشف عن نظام التمثيل التناسبي المختلط-14 ونظام التمثيل التناسبي ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقنيات زيموجرافيك الحالية تعتمد على إدماج ركائز الأصلية في المواد الهلامية polyacrylamide للكشف عن بروتيوليسيس. بينما حصل هذه التقنيات على استخدامها على نطاق واسع، أنها لا تزال محدودة في عدد البروتياز أنها يمكن الكشف عن. هنا، كان وصف بروتوكول في الببتيدات الفلورسنت، والقابلة للتحلل البروتياز التي تدمج polyacrylamide حل جل. التساهمية اقتران باستخدام جزيء رابط أزيدو-PEG3-ماليميدي تمكين فصل والكشف عن مجموعة أوسع من البروتياز مما يمكن تحقيقه حاليا مع ركائز الأصلي. طبيعة الانضباطي درجة عالية من الببتيدات الفلورسنت يتيح للباحث...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
يوفر التمويل ولاية أوهايو الدولة جامعة كلية الهندسة وقسم الهندسة الطبية الحيوية، ومركز السرطان الشامل-آرثر ج. جيمس مستشفى السرطان وريتشارد ج. سلف معهد البحوث.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مم كاسيت جل فارغة | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 مم ، 10 أمشاط كاسيت جل فارغة | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x فوسفات مخزن محلول ملحي | فيشر Scientific | 10-010-049 | |
| 20٪ حل SDS | Ambion | AM9820 | |
| 3x عينة التصوير بالزيوگرافيا عازلة | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40٪ (وزن / حجم) أكريلاميد / مكرر (19: 1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 ألواح لزراعة أنسجة الآبار | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 وحدة تصفية الطرد المركزي (10 كيلو دالتون MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | انقر فوق الكيمياء أدوات | AZ107 | |
| كلوريد الكالسيوم | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | فيشر Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N 'N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein ثنائي اللون قياسي | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide تحت الجلد إبر | فيشر Scientific | 14-826 | |
| قارورة سفلية مستديرة (100 مل) | فيشر ساينتفيك | 50-873-144 | |
| سدادة مطاطية الحاجز | فيشر سيانتيفيك | 50-872-546 | |
| حقنة طرف انزلاق معقمة (1 مل) | فيشر سينتيفيك | 14-823-434 | |
| تريتون X-100 | سيجما ألدريتش | X100 | |
| تريزما هيدروكلرويد | سيجما ألدريتش | T5941 | |
| تايفون 9410 تصوير جزيئي | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| كلوريد الزنك | سيجما ألدريتش | 208086 |
المراجع
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
- Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
- Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
- Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
- van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
- Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
- Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
- Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
- Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
- Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
- Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
