Method Article

التحديد الكمي للتوزيع غير متجانسة من البروتين متشابك في الدماغ الماوس استخدام الفلورة

DOI:

10.3791/58940

⸱

January 29th, 2019

 ,  , 
1Institute of Anatomy and Embryology, University Medical Center Göttingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يمكننا وصف نهج كمي لتحديد توزيع البروتين متشابك بالنسبة للبروتين علامة استخدام الفلورة تلطيخ والفحص المجهري [كنفوكل]، والتحليل القائم على الحاسوب.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وجود أو عدم وجود، أو مستويات معينة من البروتينات متشابك يمكن التأثير على شدة انتقال متشابك. بالإضافة إلى توضيح وظيفة البروتين، من الضروري أيضا تحديد توزيعها. هنا، يمكننا وصف بروتوكول استخدام الفلورة والفحص المجهري [كنفوكل]، والتحليل القائم على الحاسوب لتحديد توزيع البروتين متشابك المحرك (تسمى أيضا تبرجل أو SVAP30). نحن مقارنة توزيع المحرك لأن سينابتوفيسين البروتين حويصلة متشابك، وبالتالي تحديد توزيع المحرك بطريقة كمية مقارنة بوفرة حويصلات متشابك. جدير بالذكر أن يحتمل أن يكون تنفيذ هذا الأسلوب للسماح للمقارنة بين توزيع البروتينات باستخدام الأجسام المضادة المختلفة أو المجاهر أو عبر دراسات مختلفة. لدينا طريقة تلتف تقلب الملازمة لمن ستينينجس إيمونوفلوريسسينت بالغلة بنسبة بدلاً من المستويات المطلقة الأسفار. بالإضافة إلى ذلك، يتيح الأسلوب يصف لنا الباحث لتحليل توزيع البروتين على مستويات مختلفة: من شرائح المخ كله لمناطق الدماغ لمختلف المناطق دون الإقليمية في مجال المخ واحد، مثل طبقات مختلفة من قرن آمون أو حسية كورتيسيس. المحرك هو بروتين فقاريات محددة مقترنة حويصلات متشابك. مع هذا الأسلوب، ونظهر أن المحرك هو موزعة بين مناطق الدماغ، مع مستويات عالية في المكورة البطني ونواة الحاجز في اللوزة، وأيضا داخل مناطق الدماغ واحدة، مثل طبقات مختلفة من الحصين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدث الاتصال بين الخلايا العصبية في مواقع اتصال متخصصة تسمى نقاط الاشتباك العصبي. الاشتباكات العصبية تحتوي على عدد ضخم بروتينات المختلفة التي تنسق انتقال متشابك. بعض من تلك البروتينات تظهر توزيعاً غير متجانسة في جميع أنحاء النظام العصبي وليست موجودة في كل المشبك1. مثال واحد لهذا بروتين هو Munc13، الذي يشارك في عملية فتيلة من حويصلات متشابك. وهناك isoforms مختلفة من Munc13، التي توزع في جميع أنحاء الدماغ2تقوم، ويمكن أن تؤثر على وجود أو عدم وجود isoforms محددة قصيرة الأجل اللدونة متشابك وحويصله متشابك ديناميات3، 4 , 5-لذلك، أنها ذات أهمية حيوية ليتمكن من تحديد وجود البروتينات متشابك المختلفة عبر مناطق الدماغ.

أساليب اختيار للتحديد الكمي للبروتينات متشابك-حتى الآن-هي الكتلي والغربية النشاف، بدلاً من إيمونوهيستوتشيميستري6،7،،من89. وفي بعض الحالات، يتم استخدام عدة أساليب يكمل كل منهما الآخر لتقييم الكمية وإضفاء الطابع المحلي على البروتينات المحددة (أي، فيلهلم et al. 10)-الأسلوب يصف لنا هنا يسمح للتعريب والتحديد الكمي للبروتينات للفائدة دون الحاجة إلى استخدام أي أسلوب البيوكيميائية، ببساطة استخدام ستينينجس إيمونوفلوريسسينت. هنا ميزة أخرى هي أنه يمكن أن يتم التحديد الكمي على مناطق أصغر بكثير، ولذلك أكثر تحديداً، من تلك التي تحققت بأساليب أخرى. ومع ذلك، يتعين على المرء أن يأخذ في الاعتبار ضرورة بروتين مرجع موثوق بها لتقييم توزيع بروتين الفائدة.

صبغة الفلورسنت ب immunohistochemistry يسمح لنا بتحديد إضفاء الطابع المحلي على البروتينات بصورة روتينية عبر مناطق الدماغ وكذلك داخل الأقسام العصبية المختلفة. للتعرف على الأقسام المختلفة، يتم استخدام علامات محددة. عادة، يمكن استخدام أجسام مضادة ضد سينابسين وسينابتوفيسين11 لتسمية حويصلات متشابك، بينما الأجسام المضادة ضد عزف تسمية منطقة نشطة من المحطة الطرفية presynaptic12. الناقلين حويصلية، مثل الناقلين غلوتامات حويصلية (فجلة) أو الناقل غابا حويصلية (فجأت)، تستخدم لتسمية ضادات13 و المثبطة14 محطات presynaptic، على التوالي. من ناحية بوستسينابتيك، يمكن أن تستخدم الأجسام المضادة ضد بروتين هوميروس بمناسبة بوستسينابتيك المحطات الطرفية، والأجسام المضادة ضد الكثافة بوستسينابتيك البروتين 95 (PSD95)15،،من1617 أو جيفيرين18 , 19 , ويمكن تسمية 20 محطات بوستسينابتيك ضادات أو المثبطة، على التوالي. باستخدام الأجسام المضادة ضد بروتين الفائدة وعلامات مثل تلك المذكورة أعلاه، واحد تحدد إضفاء الطابع المحلي على هذا البروتين. العديد من الدراسات لتاريخ فعلنا ذلك في طريقة نوعية21. بيد لتحديد توزيع التفاضلية بروتين متشابك محددة موثوق بها، واحدة يجب أن لا فقط تحديد وجودها أو غياب لكن تركيزه النسبي أيضا. عدم تجانس أحجام وكثافة الاشتباكات العصبية يجعل من المهم إثبات نسبة بين علامة متشابك والبروتين من الفائدة. وبخلاف ذلك، سوف تظهر المناطق الغنية بالمشبك مثل الطبقات غير الهرمية قرن آمون والطبقة الجزيئية المخيخ بكثافة عالية من البروتينات متشابك، فقط بسبب كثافة أعلى من نقاط الاشتباك العصبي ولكن ليس بسبب وجود قوي لهذا البروتين في كل المشبك (مثلاً، والرافين ودريسباتش1). من ناحية أخرى، البروتينات في سوما العصبية (مثلاً، TGN3822) سوف تظهر عادة حضور قوي في الخلية الهرمي هيبوكامبال طبقة أو طبقة الخلايا الحبيبية هيبوكامبال أو الدماغ بسبب التركيز العالي للهيئات الخلايا العصبية وفي تلك المناطق. ولذلك، هذا التوزيع غير المتجانس للهياكل، وفي هذه الحالة synapses، يمكن أن يؤدي إلى إجراء تقدير كاذبة لتوزيع البروتين الاهتمام نفسه. وعلاوة على ذلك، يوجد التغيرات جوهرية في تلطيخ كثافات عبر العينات في ستينينجس المناعي. البروتوكول هو موضح هنا يأخذ هذا في الاعتبار، ويتجنب هذه الانحيازات، فضلا عن غيرها من المحاذير التي تنشأ من أساليب المناعي.

في مؤخرا دراسة، وقد استخدمت هذا الأسلوب لوصف التعبير التفاضلية من المحرك (تسمى أيضا تبرجل23 أو24من SVAP30) عبر مناطق مختلفة من الدماغ 161. المحرك هو بروتين متشابك فقاريات محددة يمكن العثور في الرابطة إلى حويصلات متشابك ويؤثر العصبي الإفراج عن25،،من2627. نحن تتعلق بالتعبير المحرك لوفرة حويصلات متشابك، تلطيخ سينابتوفيسين كعلامة مرجعية حويصلة متشابك. وجدنا مستويات عالية للمحرك خاصة في نواة الحاجز، المكورة البطني وفي اللوزة. ضمن قرن آمون، وجدنا توزيعاً غير متجانسة من المحرك، مع مستويات عالية في الطبقات المرتبطة بعملية حسابية داخل هيبوكامبال، ومستويات منخفضة في طبقات الإدخال والإخراج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول لا تنطوي على إجراء التجارب على الحيوانات الحية. التجارب التي تنطوي على يوثانيزينج من الحيوانات للحصول على عينات المخ بموافقة السلطات المحلية حماية الحيوانات (غوتنغن تيرشوتزكوميشن der Universitätsmedizin) تحت رقم الموافقة تي 10/30.

ملاحظة: لهذا البروتوكول، استخدمت 3 الفئران الذكور البالغين في C57BL/6.

1. إعداد نموذج

  1. إعداد مثبت و 0.1 متر العازلة الفوسفات (PB) (انظر الجدول 1).
  2. إصلاح الحيوان نضح ترانسكارديال كما هو موضح في سبر et al. 28-أولاً تغسل الدم مع 0.9% محلول كلوريد الصوديوم، ثم نتخلل مع 30 مل من 4% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين).
  3. فتح الجمجمة مع المقص وعزل الدماغ باستخدام ملعقة ذات حواف حادة لتجنب إتلاف الأنسجة بدقة.
  4. ملء أنبوب رد 50 مل مع مثبت و postfix الدماغ في 4% منهاج عمل بيجين في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  5. إزالة مثبت وغسل الدماغ في 50 مل م 0.1 pb على شاكر مدة 30 دقيقة.
  6. بعد الغسيل، احتضان الدماغ في أنبوب 50 مل رد فعل في السكروز 30% في الجريدة الرسمية 0.1 م لح 48 أو حتى أنه يغرق في الأنبوب في 4 درجات مئوية عن كريوبروتيكشن.
  7. تقليم المخ كريوبروتيكتيد بشفرة حادة ووضعه في كريومولد، وتضمين ذلك مع قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مجمع. تجنب الفقاعات. توجيه الدماغ وتجميد كريومولد في الثلاجة-80 درجة مئوية.
  8. جبل الأنسجة المجمدة لتمزيقها. حجته الأنسجة إلى درجة حرارة كريوميكروتومي لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل تمزيقها.
  9. قسم الدماغ إلى 25 ميكرومتر سميكة شرائح الاكليلية. لمسة OCT بعناية مع ربط زجاج دون لمس أنسجة المخ. جمع 3 شرائح متجاورة كل بئر في 24 لوحة جيدا وتخزينها في الجريدة الرسمية 0.1 متر عند 4 درجة مئوية حتى تلطيخ.
    ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا لمدة تصل إلى أسبوعين. أوقات أطول في التخزين يمكن أن تتداخل مع نوعية الأنسجة وبالتالي التأثير على نتائج هذه التجربة.

2-الفلورة

  1. إعداد الحلول بما في ذلك حظر المخزن المؤقت، جسم المخزن المؤقت، غسل المخزن المؤقت 1، والغسيل العازلة 2 (انظر الجدول 1).
  2. شطف شرائح مرة بالجريدة الرسمية لإزالة الزائدة OCT.
    1. إزالة الحل مع ماصة بلاستيكية دون مص شرائح المخ. إضافة 250 ميليلتر من PB الطازجة مع ماصة 1000 ميليلتر.
      تنبيه: شرائح يجب أن لا تجف، حتى إزالة وإضافة سوائل ببئر.
  3. إزالة الجريدة الرسمية مع ماصة بلاستيكية وإضافة 250 ميليلتر من المخزن المؤقت حظر كل جيدا مع ماصة 1000 ميليلتر. احتضانها ح 3 في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر.
  4. خلال فترة حضانة المرض، يؤدي إلى تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت لجسم في أنبوب رد فعل. استخدام 250 ميليلتر جسم العازلة لكل بئر وإضافة المقدار المناسب من جسم (انظر الجدول 2) التي بيبيتينج أنها مباشرة إلى الحل باستخدام ماصة 2 ميليلتر من. مزيج الحل بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات. دوامة قريبا بعد ذلك لضمان خلط السليم.
    ملاحظة: لتحديد الأسفار الخلفية، ستينينجس ينبغي أيضا إجراء دون إضافة جسم الأولية. لذلك، واحتضان الشريحة في جسم الحل دون الأجسام المضادة الأولية وفقا للبروتوكول.
  5. بعد فترة الحضانة، إزالة المخزن المؤقت حظر مع ماصة بلاستيكية وإضافة 250 ميليلتر من جسم محلول يحتوي على الأجسام المضادة الأساسي للبئر الواحد. احتضان الشرائح مع جسم الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر.
  6. وفي اليوم التالي يغسل الشرائح مع الغسيل المخزن المؤقت 1 3 x ل 10 دقيقة في RT على شاكر.
    1. إزالة المتوسطة مع ماصة بلاستيكية وإضافة 300 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت 1 كل بئر. احتضان في الرايت 10 دقيقة كرر 3 مرات.
  7. خلال خطوات الغسيل، تضعف الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب فلوروفوري في جسم المخزن المؤقت في أنبوب رد فعل. استخدام 250 ميليلتر جسم العازلة لكل بئر وإضافة المقدار المناسب من جسم (انظر الجدول 2) التي بيبيتينج أنها مباشرة إلى الحل باستخدام ماصة 2 ميليلتر من. مزيج الحل بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات. دوامة قريبا بعد ذلك لضمان خلط السليم.
    تنبيه: نظراً لأن الأجسام المضادة التي تكون حساسة للضوء، جميع الخطوات من هذه النقطة تحتاج إلى القيام بها في الظلام.
  8. بعد خطوات الغسيل، إزالة الغسيل المخزن المؤقت مع ماصة بلاستيكية وإضافة 250 ميليلتر من جسم محلول يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية كل بئر. احتضان الشرائح مع الجسم المضاد الثانوي لمدة 90 دقيقة في RT في الظلام.
  9. تغسل الشرائح مع الغسيل المخزن المؤقت 2 3 x لمدة 10 دقائق في الرايت
  10. وخلال خطوات الغسيل، تمييع 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) في الجريدة الرسمية م 0.1 في تركيز 1:2000.
  11. إزالة المخزن المؤقت الغسيل 2 مع ماصة بلاستيكية وإضافة 250 ميليلتر لحل DAPI كل بئر. احتضان لمدة 5 دقائق في RT على شاكر.
  12. إزالة الحل DAPI مع ماصة بلاستيكية وإضافة 500 ميليلتر من PB 0.1 متر الواحد جيدا مع ماصة 1000 ميليلتر.
  13. تحميل الشرائح على شرائح المجهر.
    1. ضع شريحة مجهر تحت ستيريوسكوبي. بفرشاة الجميلة، إضافة ثلاث قطرات منفصلة من 0.1 م PB على الشريحة. ضع شريحة واحدة كل قطره ماء على شريحة المجهر.
    2. استخدم الفرشاة الجميلة لتسطيح وتوجيه الشرائح على شريحة المجهر.
    3. عندما يتم وضع كل الشرائح بشكل صحيح، إزالة الزائدة PB مع أنسجة وجاف الشريحة بعناية.
      تحذير: تجنب تجفيف شرائح المخ تماما.
    4. إضافة 80 ميليلتر لتضمين المتوسطة على الشريحة. بدقة أقل ساترة على الشريحة، ثم تضمين شرائح المخ.
    5. اترك الشرائح لتجف في غطاء الدخان ح 1-2 (غطاء لهم لتجنب التعرض للضوء) وتخزينها في مربع شريحة مجهر عند 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

3-تصوير

  1. بعد تضمين الوسيطة في حالة تصلب تماما، مكان الشريحة المجهر تحت المجهر [كنفوكل].
    ملاحظة: ينبغي أن تسفر عن الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي جنبا إلى جنب مع برامج deconvolution مماثلة من جودة الصورة.
  2. ضبط إعدادات الليزر بزيادة أو تقليل كثافة الليزر لكل قناة حيث أنه يتم تعريض قليلة بكسل لضمان توزيع الحد الأقصى من قيم رمادية.
  3. الحصول على أنسجة الظاهري من شريحة الدماغ كله لقنوات مختلفة.
    1. في برامج التصوير (انظر الجدول للمواد)، حدد الخيار البلاط ويدويًا تحديد شريحة الدماغ مع بلاط منطقة الإعداد.
    2. توزيع نقاط الدعم في جميع أنحاء منطقة بلاط وضبط التركيز لنقاط الدعم المختلفة عن طريق الضغط على التحقق من بلاط المناطق/مواقف...
    3. قم بضبط الإعدادات في اكتساب وضع وفقا لحجم الملف والقرار المطلوب للصورة الناتجة وبدء المسح الضوئي.
  4. عند الانتهاء من المسح الضوئي، استخدم الدالة Stitching لمعالجة الأنسجة الظاهري. تصدير الملف .tif باستخدام الدالة تصدير الصورة.

4-جهاز الكمبيوتر على أساس تحليل

  1. تحميل جميع قنوات واحد لصورة واحدة في فيجي29 بواسطة النقر فوق الملف | فتح.
  2. باستخدام أداة التحديد اليدوي ، ترسم واحد نصف الكرة الأرضية في DAPI-القناة. إنشاء قناع التحديد بالنقر فوق تحرير | اختيار | إنشاء قناع.
  3. تحديد كثافة fluorescence يعني لقنوات فردية (المحرك وسينابتوفيسين) بواسطة النقر فوق تحليل | قياس.
    ملاحظة: تأكد من تحديد قنوات مختلفة لتحديد قيم الكثافة fluorescence يعني لكل قناة.
  4. نسخ كثافة fluorescence يعني لقنوات واحد في جدول بيانات.
  5. تحديد كثافة fluorescence يعني لقنوات فردية في مجال يحظى بالاهتمام بتحديد المنطقة أيضا باستخدام أداة التحديد اليدوي . استخدام أطلس الدماغ ماوس كمرجع.
  6. كرر الخطوات من 4، 1-4، 5 لكل من نصفي الكرة الأرضية وجميع مجالات الاهتمام.
    ملاحظة: تحديد القيم الخاصة بنصف الكرة الغربي كل على حدة من أجل مقارنة القيم الموجودة في مجال يحظى باهتمام لأن في نصف الكرة الغربي في وقت لاحق (راجع الخطوة 5، 2).

5-بيانات التعامل

  1. وفي حالة الأسفار خلفية عالية (انظر المناقشة)، قد تكون هناك حاجة طرح خلفية. لذلك، تحديد كثافة fluorescence يعني الشريحة معالجتها دون جسم الأولية ضد البروتين الإشارة (هنا: سينابتوفيسين) وطرح هذه القيمة من كافة القيم التي تم الحصول عليها لمناطق الدماغ ونصفي الكرة الأرضية.
  2. عندما تم تحديد كثافات fluorescence يعني لقنوات واحد لكل نصف الكرة الأرضية، وكل مجال من مجالات الاهتمام (انظر الجدول 3)، حساب نسبة انتقال إلى سينابتوفيسين بقسمة القيمة للمحرك بالقيمة (سينابتوفيسين اللون الأصفر في الجدول 3). تنفيذ هذا الإجراء لكل نصف الكرة الأرضية، وكل مجال اهتمام كل على حدة.
  3. تقسيم نسبة الحصول عليها لمنطقة واحدة للاهتمام بنسبة الحصول على نصف الكرة الأرضية المقابل (أورانج في الجدول 3) لتحديد النسبة مجال اهتمام لنصف الكرة الغربي.
  4. لتحديد المحرك الوفرة النسبية، ترجمة نسبة الحصول على 5.2 إلى نسبة مئوية عن طريق تحديد انحرافه عن 1 (الأحمر في الجدول 3). ولذلك سيعطي أي بنسبة 1.25 وفرة نسبية في محرك من 25 في المائة فوق متوسط، ونسبة 0.75 سوف يسفر عن وفرة محرك نسبي من 25% أقل من المتوسط.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن ينظر إليها الممثل تلطيخ الأنماط علامات مختلفة في الشكل 1. يختلف النمط توزيع البروتين. وترد أمثلة على خمسة مستويات rostro والذيلية في الأعمدة من (أ)-(ﻫ). تلطيخ DAPI الممثل هو مبين في الصف الأول: DAPI تتمسك بالحمض النووي للخلية، وهكذا هي الملون الأنوية. هذه النتائج في نمط الشروريه. المناطق ذات كثافة عالية خلية أكثر إشراقا من المناطق ذات الخلية منخفضة الكثافة. يمكن أن تعتبر مثالاً لبروتين موزعة بين في الصف الثاني. المحرك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطريقة المعروضة هنا يهدف إلى التحديد الكمي لتوزيع بروتين فائدة بالنسبة إلى الوفرة من البروتين علامة مع توزيع معروفة. يمكن إظهار تلطيخ الفلورة تقلب عالية لتلطيخ كثافة بين شرائح مختلفة. أن النهج الكمي الموصوفة هنا تلتف هذه المشكلة بتحديد نسبة بروتين الفائدة إلى المتوسط في جميع أنحاء نصف الكرة الغربي. ولذلك، ألغيت كثافات مختلفة المصبوغة عبر شرائح والسماح وصفاً كمياً.

كما هو الحال مع كل بروتوكول الفلورة، النوعية أو الكمية، عدة عوامل يمكن أن تؤثر على نجاح وارباك ذلك التحليل. ولذلك، ينبغي إيلاء اهت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر ارمغارد فايس للمساعدة التقنية الممتازة. الكتاب نعترف بالدعم المقدم من شركة هرمس بوفانتيس وبيتكوفا أندونييا. كما يشكر المؤلفون المعهد الأوروبي لعلم الأعصاب للاستخدام LSM800 وتقديم المساعدة التقنية، لا سيما من جانب الدكتور نيلز هالبسجوت. تم تمويل هذا العمل من "غوتينغن المركز الطبي الجامعي". JSV يقر دعم المركز للفحص المجهري النانو والفيزيولوجيا الجزيئية للدماغ (كنمبب).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 مل أنابيب تفاعلEppendorf30120094
50 مل أنابيب تفاعلGreiner Bio-One227261
multiwell 24 بئرفيشر العلمي& nbsp ؛                                                                                                                                                                                             087721H
ماصة بلاستيكية (يمكن التخلص منها)Sarstedt861،176
1000 مل ماصةRainin  17014382
2 مل ماصةEppendorf3123000012
Vortex Genius 3 & nbsp ؛IKA3340001
Menzel المجهر الشرائحفيشر العلمية                                                                                                                                                                                  10144633CF
مجسمLeica
LSM800Zeissمجهر متحد البؤر
تجميد ميكروتومLeica
PBS (10X)Roche                                                                                                                                                                            11666789001
PFASigma                                                                                                                                                                                      P6148-1kg
كلوريد الصوديومBioFroxx1394KG001
السكروزneoFroxx1104KG001
Tissue TekSakura 4583أكتوبر
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NaH2PO4Merck1،063،460،500
مصل الماعز العاديMerck MilliporeS26-100ML
مصل الحمار العاديMerckS30-100ML
Triton X-100Merck1،086،031،000
مضادة للمحرك للأرانبRRID: AB_10804285
خنزير غينيا المضاد للمتشابك المشبكيRRID: AB_1210382
حمار مضاد للأرانب AF647جاكسون ImmunoResearchRRID: AB_2492288
الماعز المضاد للفأر AF488جاكسون ImmunoResearchRRID: AB_2337438
Mowiol4-88Calbiochem                                                                                                                                                                                                    475904
ZEN2 البرمجيات الزرقاءZeissالمجهر برنامج
FIJIImageJالتحليل
Microsoft ExcelMicrosoft
أنظمة متشابك

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58(2018).
  2. Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
  3. Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
  4. Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
  5. Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
  6. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
  7. Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
  8. Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
  9. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
  10. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  11. Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
  12. Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
  13. Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
  14. Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
  15. Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
  16. Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
  17. Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
  18. Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
  19. Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
  20. Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
  21. Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
  22. Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
  23. Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
  24. Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
  25. Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
  26. Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
  27. Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
  28. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
  30. Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
  31. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
  32. Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
  33. Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synaptic Protein DistributionImmunofluorescence ProtocolConfocal MicroscopyComputer Based AnalysisMover ProteinSynaptophysin ComparisonBrain Slice AnalysisFluorescence Intensity RatioHeterogeneous DistributionHippocampal Layers

Related Articles