مقالة منهجية

نظام التوجيهي "الثغور متفاوت" "السكر الحل العلاج الغمر" في شتلات نبات التمويل

DOI:

10.3791/58951

⸱

فبراير 15, 2019

 , 
1Department of Integrated Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2International Research Organization for Advanced Science and Technology, Kumamoto University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذا البروتوكول إظهار كيفية حمل الثغور متفاوت المسافات في cotyledons شتلات نبات التمويل بمعاملة الغمر بمحلول متوسطة المحتوية على السكر وكيفية مراقبة هياكل داخل الخلايا مثل المعايشة والليزر microtubules في الخلايا الحرس متفاوت المسافات باستخدام [كنفوكل] مجهرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حركة stomatal يتوسط تبادل الغازات في النبات، هو أمر ضروري لعملية التمثيل الضوئي والرشح. ستوماتال فتح وإغلاق يتم إنجازه بزيادة كبيرة وانخفاض في حجم الخلية الحرس، على التوالي. نظراً لحدوث النقل المكوكية من الأيونات والماء بين خلايا الحرس وخلايا البشرة المجاورة أكبر أثناء حركة ستوماتال، يعتبر توزيع الثغور النباتية متباعدة توزيع أمثل لحركة ستوماتال. نظم تجريبية لزعزعة نمط متباعدة من الثغور مفيدة لدراسة أهمية على نمط تباعد. وقد حددت عدة الجينات الرئيسية المرتبطة بتوزيع ستوماتال متباعدة، والثغور متفاوت المسافات يمكن أن يتسبب تجريبيا بتغيير هذه الجينات. بدلاً من ذلك، يمكن أن يتسبب أيضا الثغور متفاوت المسافات بالعلاجات الخارجية دون التعديل الوراثي. في هذه المقالة، يصف لنا نظام تعريفية بسيطة الثغور متفاوت المسافات في شتلات نبات التمويل بمعاملة الغمر مع حل متوسطة التي تحتوي على السكروز. لدينا طريقة سهلة وتسري مباشرة على خطوط المحورة وراثيا أو المسخ. وترد المعايشة أكبر كعلامة مميزة خلية بيولوجية الناجمة عن السكروز خلايا الحرس متفاوت المسافات. وبالإضافة إلى ذلك، يظهر صورة مجهرية [كنفوكل] ممثل microtubules القشرية كمثال للمراقبة داخل الخلايا من خلايا الحرس متفاوت المسافات. يتم الاحتفاظ باتجاه شعاعي microtubules القشرية في مجمع الحرس الخلايا كما هو الحال في خلايا الحرس متباعدة في ظروف السيطرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ستوما النباتات جهازا أساسيا لتبادل الغازات لعملية التمثيل الضوئي والرشح، وهو إنجاز حركة ستوماتال بتغييرات كبيرة في خلايا الحرس عن طريق امتصاص أيون يحركها والإفراج عن المياه. تحت مجهر، يمكننا أن نلاحظ نمط توزيع متباعدة من الثغور على أسطح الأوراق والسيقان. ويعتبر هذا التوزيع متباعدة من الثغور للمساعدة في حركة ستوماتال، والتي يتم تنظيمها بواسطة تبادل الأيونات والماء بين خلايا الحرس والمجاورة لخلايا البشرة1،2. نظم تعريفية تجريبية الثغور متفاوت المسافات مفيدة للتحقيق أهمية توزيع الثغور متباعدة.

وأفيد أن التكتل المكاني من الثغور يمكن أن يتسبب بالتعديل الوراثي للجينات الرئيسية لحراسة الخلية التمايز3،4 أو العلاج مركب الكيميائي5. كذلك أبلغنا أن تستكمل العلاج الغمر بمحلول متوسطة مع السكريات بما في ذلك السكروز، الجلوكوز، وتسبب سكر تجميع ستوماتال في كوتيليدونس من شتلات نبات التمويل 6. ولوحظ كالوسي انخفاض في جدران الخلايا الجديدة فصل ميريستيمويدس وخلايا البشرة في البشرة المعالجة السكروز كوتيليدون، مما يوحي بأن السكروز الحل الغمر العلاج يؤثر سلبا على جدار الخلية، مما يمنع التسرب و العمل خارج الرحم من منتجات الجينات الرئيسية لتمايز خلية الحرس (مثل عوامل النسخ) نحو المتاخمة البشرة الخلايا6. واقترح إليه مماثلة من الدراسات على gsl8/تشور طفرات7،8. لدينا نظام تجريبي لاستنساخه بتحريض من الثغور متفاوت المسافات باستخدام الحلول المتوسطة التي تحتوي على السكروز سهلة ورخيصة جداً. يمكن استخدامه أيضا التحقيق فيها الهياكل داخل الخلايا مثل العضيات وسيتوسكيليتون في خلايا الحرس متفاوت المسافات عند تطبيقه على خطوط المعدلة وراثيا معربا عن علامات نيون أن تسمية هياكل داخل الخلايا9، 10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد موراشيجي 1/2-سكوغ متوسطة 3% الحل التي تحتوي على السكروز

  1. إضافة 1.1 غ أملاح Murashige سكوغ المتوسطة و 15 ز السكروز إلى كوب.
  2. إضافة 490 مل ماء المقطر ويخلط جيدا باستخدام شريط إثارة.
  3. قم بضبط درجة الحموضة إلى 5.8 استخدام كوه.
  4. نقل الحل في زجاجة متوسطة وتمييع إلى 500 مل بالماء المقطر.
  5. تعقيم الحل بالتعقيم (121 درجة مئوية، 20 دقيقة). إذا لم تستخدم مباشرة، قد أبقى هذا الحل في 4 درجات مئوية بعد التعقيم.

2-تنظيم دورات تعريفية الثغور متفاوت المسافات التي تحتوي على السكروز الحل المتوسط الغمر العلاج

  1. تعقيم البذور.
    1. إعداد الحل التعقيم بإضافة 500 ميليلتر من 5% كلور نشط الحل ناكلو و 1 ميليلتر من 10% X-100 تريتون إلى 500 ميليلتر الماء المعقم.
    2. ضع ca. 50 المعدلة وراثيا بذور التمويل (أ) تحمل علامة نيون مثل CT-التجارة والنقل11 أو12 من TUB6 التجارة والنقل في أنبوب 1.5 مل.
    3. أضف 1 مل من محلول الإيثانول 70% ومزيج جيد بعكس خمس مرات. إجازة لمدة 1 دقيقة.
    4. سوف تنزل البذور إلى الجزء السفلي من الأنبوب. على مقاعد البدلاء نظيفة، بلطف إزالة الإيثانول 70% استخدام ميكروبيبيتي، وإضافة 1 مل من محلول التعقيم. مزيج جيد من قبل عكس خمس مرات، وتترك لمدة 5 دقائق.
    5. تغسل البذور. لا تزال تعمل تحت ظروف معقمة على مقاعد البدلاء نظيفة، بلطف إزالة الحل باستخدام ميكروبيبيتي، وإضافة 1 مل الماء المعقم. كرر هذه الخطوة من خمس مرات.
  2. إضافة 1.5 مل من تعقيم 3% يحتوي على السكروز 1/2 Murashige سكوغ المتوسط محلول لكل بئر من صفيحة 24-جيدا على مقاعد البدلاء نظيفة.
  3. إضافة اثنين من بذور معقمة في كل بئر. الشريط غطاء على لوح 24-جيدا باستخدام طبقتين من بارافيلم.
  4. نقل لوحة 24-جيدا لمجموعة دائرة نمو عند 23.5 درجة مئوية مع دورة الضوء الظلام 12-ح/12-ح استخدام µmol 100 م2 ق1 بيضاء خفيفة واحتضان لمدة 14 يوما.

3-الملاحظة مجهرية من الثغور متفاوت المسافات

  1. ميليلتر مكان 30 3% التي تحتوي على السكروز 1/2 Murashige سكوغ المتوسطة الحل من بئر لصفيحة 24-جيدا في وسط شريحة زجاجية (الحجم: 76 × 26 مم، سمك: 1.0-1.2 مم).
  2. إزالة كوتيليدون من شتلات عمره 14 يوما استخدام مقص تشريح. تطفو في كوتيليدون مع الجانب المراقبة مواجهة على إسقاط الحل.
  3. تحضير العينة كوتيليدون وفقا لأن الأسلوب السابق13. أساسا، بوضع 30 ميليلتر من الحل في وسط الزجاج غطاء (حجم: 18 × 18 مم، سمك: 0.12-0.17 ملم). اقلب الزجاج غطاء ووضعه على كوتيليدون برفق. تمحو الزائد المخزن المؤقت باستخدام أنسجة خالية من الوبر.
  4. تعيين عينة على مرحلة مجهر الليزر [كنفوكل] وحدد خلايا الحرس متفاوت المسافات للمراقبة باستخدام الإضاءة الحقل مشرق.
  5. الحصول على الصور [كنفوكل] هياكل داخل الخلايا فلوريسسينتلي توسم وفقا لإرشادات الشركة المصنعة المجهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، تم عرض البروتوكول المتعلق بأسلوب بسيط لحمل المجموعات ستوماتال مع الحل المتوسطة التي تحتوي على السكروز في التمويل ألف شتلة. خلايا الحرس متفاوت المسافات نمت في الحل المتوسط الذي يحتوي على السكروز (الشكل 1ب) لها المعايشة أكبر من خلايا الحرس نمت في ظروف خالية من السكروز التحكم (الشكل 1أ). وأكد توسيع المعايشة مع الأشعة المقطعية-التجارة والنقل11، وعلامة ستروما بلاس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد قدمنا البروتوكولات لتحريض الثغور متفاوت المسافات في التمويل ألف شتلة بمعاملة الغمر مع حل متوسطة التي تحتوي على السكروز. كما هو موضح هنا، هذا الأسلوب بسيط جداً ويتطلب أي مهارة متخصصة لكن يمكن حمل كفاءة الثغور متفاوت المسافات. تتجمع أكثر من 45 في المائة خلايا الحرس مع 3% السكروز المحتوية على الحل المتوسط (قيم المتوسط الحسابي للملاحظات مستقلة أكثر من 20)6. وعلاوة على ذلك، هذا النظام التجريبي يمكن تطبيقها مباشرة على خطوط المحورة وراثيا أو متحولة كما هو موضح لخطوط المعدلة وراثيا معربا عن ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون للبروفيسور سيشيرو هاسيزاوا على دعمه الكريم لعملنا. أيد هذا العمل المنح المقدمة من "الجمعية اليابانية" لأرقام كاكينهجرانت النهوض بالعلوم (JSPS) 17 ك 19380 ومنح 18 ح 05492، من مؤسسة سوميتومو للحصول على منح "مشاريع بحوث العلوم الأساسية" رقم 160146، و "مؤسسة كانون" T.H. ووضعت هذا النظام التجريبي تحت دعم المالي من عدد كاكينهجرانت JSPS 26891006 إلى أ. ك. ونحن نشكر روبي لويس، ماجستير، من مجموعة ادانز (www.edanzediting.com/ac) لتحرير مسودة للمخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
24 بئر لوحةسوميتومو الباكليتMS-0824R
488 نانومتر ليزرفوروكاوا دينكوHPU-50101-PFS2
488 نانومتر ليزرأوليمبوسالياقوت 488-20 / O
510 نانومتر مرشح التمرير الطويلأوليمبوسBA510IF
524 - 546 نانومتر مرشح تمريرالنطاق SemrockFF01-535 / 22-25
530 نانومتر تمريرة قصيرة مرشحأوليمبوسBA530RIF
561 نانومتر ليزرCVI Melles Griot85-YCA-025-040
604 - 644 نانومتر مرشح تمرير النطاقSemrockFF01-624 / 40-25
رأس المسح بالليزر متحد البؤريوكوجاواCSU10
رأس المسح بالليزر متحد البؤرأوليمبوسFV300
كاميرا CCD المبردةالقياساتالضوئيةبرنامج الحصول على الصور CoolSNAP HQ2
الأجهزة الجزيئيةMetaMorph الإصدار 7.8.2.0
برنامج الحصول على الصورOlympusFLUOVIEW v5.0
زيت الغمرزيت الغمر أوليمبوسمن النوع Fne = 1.518 (23 درجة)
المجهر المقلوبأوليمبوسIX-70
المجهر المقلوبأوليمبوسIX-71
Murashige و Skoog خليط الملح النباتيFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation392-00591Murashige T and Skoog F (1962) وسيط منقح للنمو السريع والمقايسات الحيوية مع مزارع أنسجة التبغ. علم وظائف الأعضاء Plantarum 15 (3) ، 473-497.
عدسة موضوعية أوليمبوسUPlanApo 100x / 1.35 NA زيت القزحية 1.35NA = 1.35
عدسة موضوعية أوليمبوسأبلانAPO 40x / 0.85 NANA = 0.85
سكروزفوجي فيلم واكو شركة بيور كيماويكالكوربوريشن 196-00015

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
  2. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
  3. Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
  4. Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
  5. Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
  6. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456(2013).
  7. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
  8. Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
  9. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815(2018).
  10. Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
  11. Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
  12. Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
  13. Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة