مقالة منهجية

بروتوكول غير القابل للصدأ لعزل الحمض النووي الريبي عالية الجودة من الليزر التقاط خلايا ميكروديسيكتيد بوركنجي في المخيخ تشريح الإنسان

DOI:

10.3791/58953

⸱

يناير 17, 2019

 ,  , 
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 2Division of Movement Disorders, Department of Neurology, Yale University, 3Department of Chronic Disease Epidemiology, Yale School of Public Health, Yale University, 4Center for Neuroepidemiology and Clinical Neurological Research, Yale School of Medicine, Yale University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يستخدم نهج خالية من وصمة عار لتصور وعزل خلايا بوركنجي في الأنسجة المجمدة الطازجة من المخيخ البشري بعد الوفاة عن طريق التقاط الليزر ميكروديسيكشن. والغرض من هذا البروتوكول توليد كميات كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتسلسل الحمض النووي الريبي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) هو أداة مفيدة أن يسمح للمجموعة من الخلايا ذات الصلة سيتولوجيكالي و/أو فينوتيبيكالي أو مناطق من الأنسجة المتباينين. يمكن استخدام المنتج تم التقاطها في مجموعة متنوعة من الأساليب الجزيئية للبروتينات، عزل الحمض النووي الريبي أو. ومع ذلك، الحفاظ على الحمض النووي الريبي من أنسجة المخ البشري تشريح الجثة تنطوي على تحديات خاصة. تتطلب تقنيات التصور القياسية ل LCM نسيجية أو إجراءات المصبوغة المناعي أن يمكن أن تتحلل الجيش الملكي النيبالي. ولذلك، قمنا بتصميم بروتوكول غير القابل للصدأ للتصور في LCM مع الغرض المقصود من الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي في أنسجة المخ البشري بعد الوفاة. خلية بوركنجي في المخيخ مرشح جيد للتصور غير القابل للصدأ، ونظرا لحجم وموقع مميز. قشرة الدماغ لدى الطبقات المتميزة التي تختلف من حيث كثافة الخلايا، مما يجعلهم ركبة جيدة لتحديد تحت مجهر التكبير عالية. هي خلايا بركنج العصبية الكبيرة الواقعة بين طبقة الخلايا الحبيبية، الذي شبكة كثيفة خلوية للخلايا العصبية الصغيرة، وطبقة الجزيئية، ومتفرق في الهيئات الخلية. وبسبب هذا الهيكل، من الممكن استخدام التصور غير القابل للصدأ. أنظمة الجهاز أو الخلايا الأخرى التي تحاكي هذا النمط الظاهري ستكون مناسبة أيضا. تم تصميم البروتوكول غير القابل للصدأ لإصلاح الأنسجة المجمدة الطازجة مع الإيثانول وإزالة الدهون مع زيلين نفط للتصور المورفولوجية تحسين إطار التكبير عالية الخفيفة الميكروسكوب. هذا البروتوكول لا تراعي أساليب التثبيت الأخرى، وهو مصمم خصيصا لعينات الأنسجة المجمدة الطازجة التقاطها باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)-نظام LCM. وهنا، يقدم بروتوكول كامل لتقطيع وإصلاح أنسجة الدماغ البشري الجثة المجمدة الطازجة وتنقية من الجيش الملكي النيبالي من خلايا بوركنجي معزول بواسطة الأشعة فوق البنفسجية-LCM، مع الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي اللاحقة. في أيدينا، هذا البروتوكول وتنتج مستويات استثنائية من التصور الخلوية دون الحاجة لتلطيخ الكواشف وغلة الجيش الملكي النيبالي مع ارتفاع أرقام سلامة الحمض النووي الريبي (إيه إيت) كما أن هناك حاجة لتجارب التنميط النسخي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) هو أداة بحثية قيمة تسمح فصل خلايا مرضية ذات الصلة لتقييم جزيئيا مدفوعة اللاحقة. استخدام التحليلات الجزيئية في هذه عينات الأنسجة غير متجانسة والارتباط مع البيانات السريرية والمرضية خطوة ضرورية في تقييم أهمية البحوث البيولوجية1متعدية الجنسيات. عند تحليل البيانات التعبير الجيني من الجيش الملكي النيبالي، استخدام أقسام الأنسجة المجمدة ينصح بشدة كما أنها تسمح للنوعية الممتازة للجيش الملكي النيبالي، فضلا عن أقصى كمية2. ثبت أيضا أن ذات جودة عالية وكمية من الحمض النووي الريبي أساسية للبيانات ذات مغزى من تسلسل الحمض النووي الريبي3. عند استخدام الحمض النووي الريبي من أنسجة الجثة المجمدة الطازجة ل LCM، تدهور الحمض النووي الريبي غير تحديا كبيرا، كما أنه يحدث فورا عند الوفاة ومداه هو توسط مختلف العوامل المرتبطة بالانسجة جمع الأسلوب4،5 . وعلاوة على ذلك، يتفاقم تدهور الجيش الملكي النيبالي عندما المصبوغة التقنيات اللازمة للاعتراف بتفاصيل النسجية وتحديد الخلية. المتخصصة تلطيخ التقنيات، مثل الهيماتوكسيلين ويوزين ونيسل وصمة عار، الفلورة و immunohistochemistry قد تكون مفيدة في تمييز الخلايا من ستروما المحيطة بها لكن ثبت للحط من الجيش الملكي النيبالي، ويغير التعبير نسخة 6من التشكيلات الجانبية. ولذلك، أوجد مختبرنا بروتوكول غير القابل للصدأ مصممة خصيصا للحفاظ على الجيش الملكي النيبالي في المخيخ البشري الجثة لأغراض تسلسل الحمض النووي الريبي بعد عزلة LCM بوركنجي الخلايا العصبية.

في تجهيز الأنسجة المجمدة الطازجة ل LCM، يمكن أن تؤثر طريقة التثبيت مغايرة على سلامة كل من الجيش الملكي النيبالي والأنسجة. التثبيت الفورمالين المعيار للحفاظ على الخصائص المورفولوجية، ولكن الأسباب العابرة للربط التي ربما تفتيت الحمض النووي الريبي وتتداخل مع الحمض النووي الريبي التضخيم7. تثبيت الإيثانول أفضل بديل لعزل الحمض النووي الريبي، كما هو مثبت كواجولاتيفي التي لا تحفز العابرة للربط1. ولتعزيز تصور مورفولوجيا الأنسجة، زيلين نفط هو الخيار الأفضل، كما أنه يزيل الدهون من الأنسجة. ومع ذلك، هناك معروفة القيود عند استخدام زيلين نفط في LCM، الأنسجة يمكن أن تجف وتصبح هشة تفتت الأنسجة تسبب عند التقاط الليزر7. زيلين نفط هو أيضا مادة سامة متقلبة، ويجب أن تعالج بشكل صحيح في غطاء دخان. ومع ذلك، أظهرت زيلين نفط لتعزيز التصور الأنسجة مع أيضا الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي8. لذلك، لدينا بروتوكول تدور حول استخدام التثبيت الإيثانول 70% والجفاف الإيثانول، تليها الحضانة زيلين نفط للوضوح المورفولوجية.

من المهم ملاحظة أنواع مختلفة من نظم الليزر ميكروديسيكتيون، كما أنها أظهرت أن تختلف في السرعة والدقة والجودة الجيش الملكي النيبالي. ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR) التقاط ميكروديسيكتيون والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) نظم ميكروديسيكتيون ميكروبيام الليزر كانت كل المنابر LCM الرواية التي ظهرت في نفس الوقت تقريبا8. نظام الأشعة تحت الحمراء-LCM يستخدم "نظام اتصال" استخدام فيلم الحرارة شفافة توضع مباشرة على قسم الأنسجة، والخلايا التي تهم بشكل انتقائي الالتزام بالفيلم بنبضات مركزة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. بدلاً من ذلك، هو نظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM "نظام عدم الاتصال" حيث يقطع شعاع ليزر مركزة بعيداً الخلايا أو المناطق ذات الاهتمام في النسيج؛ اعتماداً على تكوين في اثنين من منصات التجارية المتاحة حاليا التي تستخدم أما على تصميم مجهر المقلوب أو تستقيم، تكتسب الأنسجة في جهاز جمع موجه ضغط المستحثة بالليزر التي المقاليع أنها ضد الجاذبية أو الأنسجة جمع بواسطة الجاذبية، على التوالي. وتشمل مزايا هامة لنظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM اقتناء خلية أسرع، جمع خالية من التلوث مع نهج عدم الاتصال وتشريح أكثر دقة بسبب كثير أصغر ليزر شعاع قطرها9. صمم خصيصا لنظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM هذا البروتوكول ولم يتم اختباره في نظام LCM الأشعة تحت الحمراء. أما تصميم نظام الأشعة فوق البنفسجية-LCM، عندما تتراكم الخلايا إلى الحد الأقصى جمع، واستخدام ساترة أن يعزز الوضوح الخلوية أثناء الفحص المجهري ليست مناسبة، كما سيكون غير قادر على الدخول في عملية النداءات الموحدة جمع الخلايا. ولذلك، تعزيز التصور الأنسجة، قمنا باختبار استخدام قبعات جمع معتمة، التي تم تصميمها لتعمل بمثابة ساترة للتصور المجهرية في أنظمة الأشعة فوق البنفسجية-LCM، ضد قبعات جمع مليئة السائل. يمكن أن يكون تحديا قبعات جمع مليئة السائل، كما يخضع لتبخر السائل ويجب أن يتم استبداله كثيرا أثناء العمل في المجهر. الوقت يصبح عاملاً مهما للاستقرار في الجيش الملكي النيبالي، كما يذوب الأنسجة تم التقاطها مباشرة7.

لدينا مختبر الدراسات التغييرات نيوروباثولوجيك تشريح الجثة في المخيخ للمرضى الذين يعانون من الهزة الأساسية (ET) واضطرابات الأعصاب المتصلة بها في المخيخ. لقد أظهرنا التغييرات مورفولوجك تتمحور حول خلايا بوركنجي التي تميز بين الحالات ET مقابل عناصر التحكم، بما في ذلك خفض عدد خلايا بوركنجي، ازداد الانحدار الجذعية ومجموعة متنوعة من التغييرات محواري، تؤدي بنا مسلمة أن بوركنجي ضمور الخلية ميزة بيولوجية أساسية في ET المرضية10،11،،من1213. التنميط النسخي قد استخدمت في العديد من أمراض الجهاز العصبي لاستكشاف الأساس الجزيئي الكامنة وراء التغيرات الخلوية التنكسية. بيد النسخي لمحات من عينات غير المتجانسة، مثل مناطق أنسجة المخ، يمكن انتقاص قناع التعبير عن النصوص وفرة منخفضة و/أو تقلل من الكشف عن التغيرات الجزيئية التي تحدث إلا في عدد صغير من سكان من المتضررين الخلايا، مثل خلايا بوركنجي في قشرة الدماغ. على سبيل المثال، خلايا بوركنجي هي فاقت إلى حد كبير من الخلايا الحبيبية وفرة في قشرة الدماغ قبل حوالي زائداً؛ وهكذا، لفعالية الهدف يتطلب بهم الترنسكربيتوم العزلة محددة من هذه الخلايا العصبية. قشرة الدماغ هي رسمتها الطبقات المتميزة التي تختلف من حيث كثافة الخلية وحجم الخلية. هذه البنية الخلوية يعتبر مثاليا لتصور في عينة أنسجة المجمدة الطازجة دون المحتوية على صبغ الكواشف المصبوغة. ومن الناحية النظرية، يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على أنواع الأنسجة الأخرى التي لديها أنسجة مميزة مماثلة المنظمة.

تم تصميم هذا البروتوكول للعمل على وجه التحديد للتصور خلايا بوركنجي في المخيخ البشري بعد الوفاة. وتوجد العديد من البروتوكولات للتثبيت، تلطيخ التصور والحفاظ على الحمض النووي الريبي لأنواع عديدة من الأنسجة للأغراض من كلا الأشعة تحت الحمراء--والأشعة فوق البنفسجية-LCM. عندما تفكر تصميم تجريبي للأشعة فوق البنفسجية-LCM، ينبغي تكييف الأفراد على بروتوكول تناسب احتياجات ومتطلبات من البداية والنهاية المواد. هنا، أن نجمع بين جوانب كثيرة من مختلف البروتوكولات LCM توفير طريقة محسنة لتصور خلايا بوركنجي في المخيخ الجثة البشرية دون الحاجة إلى صبغة تحتوي على كواشف المصبوغة لإعداد الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة الترنسكربيتوم التسلسل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع العينات البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول قد تم الحصول عليها بالموافقة المستنيرة، وتمت الموافقة على طريق الداخلية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) في جامعة كولومبيا وجامعة ييل.

ملاحظة: ينبغي أن تتبع بأكملها هذا البروتوكول الصارم الحمض النووي الريبي التعامل مع المبادئ التوجيهية، التي بموجبها يتم دائماً استخدام القفاز يد ويتم تنظيف جميع الأسطح مع ديكونتاميناتور رناسي وجميع مواد العمل هي الجيش الملكي النيبالي/الحمض النووي/نوكلاس مجاناً.

1-اختبار الحمض النووي الريبي سلامة الأنسجة قبل بدء LCM

ملاحظة: يمكن أن يتم اختبار جودة الجيش الملكي النيبالي بطرق عديدة. ضمان أن يتم اختبار الحمض النووي الريبي من المقطع بأكمله لتوفير عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) ممثل للعينة.

  1. حدد بعناية عينات الأنسجة لإدراج التي تتلاءم مع المعلمة للتصميم التجريبي. إذا قطع في كريوستات، الانتقال إلى الخطوة 1.2. إذا لم يكن كذلك، عملية الأنسجة تبعاً لذلك والانتقال إلى "الخطوة 1، 11".
  2. الحصول على حاويتين من الثلج الجاف. الحجم سيتوقف على عدد العينات.
    1. في الحاوية الأولى من الثلج الجاف، ضع أنبوب فارغ، المسمى 2 مل مع التعليمات البرمجية الأنسجة.
      ملاحظة: يستغرق 10 دقيقة للأنابيب تجميد. يجب تجميد أنابيب قبل وضع الأنسجة في لهم؛ وبخلاف ذلك، سوف تذوب الأنسجة على سطح الأنبوب.
    2. في حاوية ثانية من الثلج الجاف، ضع الأنسجة من ثلاجة-80 درجة مئوية تتطلب الاختيار الجيش الملكي النيبالي.
  3. تنظيف في كريوستات. راجع الخطوة 4.7 للتنظيف الداخلي بالتفصيل.
  4. إزالة الأنسجة من الثلج الجاف وقص جزء صغير من الأنسجة مع شفرة حلاقة رناسي تطهير. ينبغي أن تكون الأنسجة 1 سم × 1 سم تقريبا في الحجم.
  5. مكان التلة عالية مم تقريبا 3 قطع الأمثل الحرارة (OCT) مركب على كريوستات 'تشاك' وتسمح بتجميد جزئي. ثم، ضع الأنسجة على رأس OCT – لا تدفع إلى أكتوبر، ببساطة السماح لها بالراحة في الأعلى.
  6. متى يصلب OCT، مكان تشاك بالانسجة المركبة في كريوستات قطع الذراع وموقف أمام بليد كريوستات.
  7. تقليم في 30 ميكرو المقاطع حتى الأنسجة حتى.
  8. قطع 300 ميكرومتر الأنسجة ومكان في أنبوب مجمدة 2 مل. ضع الأنبوب مرة أخرى في الثلج الجاف.
  9. إزالة الأنسجة من 'تشاك' ووضع مرة أخرى في الثلج الجاف حتى على استعداد لوضع بعيداً.
  10. كرر الخطوات من 1.4-1.9 لكل الأنسجة.
  11. بمجرد اكتمال جميع العينات، استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة الحمض النووي الريبي استخراج المقدمة (الجدول للمواد #15). وتقدم بروتوكول مفصلة مع أدوات استخراج الحمض النووي الريبي. يجب اتباع جميع التعليمات بما في ذلك الخطوة اختيارية لتجفيف الغشاء أنبوب جمع وخطوة اختيارية الهضم الدناز (الجدول للمواد #16).
  12. اختبار سلامة الحمض النووي الريبي المستخرج عن طريق تقييم نوعية بيواناليزير14.

2-تعد قبل "بدء تمزيقها" ل LCM

  1. تنظيف أصحاب الشرائح قبل كل جولة من تقطيع الأنسجة ل LCM. تنفيذ إجراء التنظيف في اليوم قبل الاستخدام للسماح بإكمال التجفيف بين عشية وضحاها.
    ملاحظة:     أصحاب الشرائح المستخدمة لتثبيت قسم الأنسجة في الإيثانول، والمقاصة في زيلين نفط.
    1. الشريحة حامل التنظيف الداخلي: شطف مع ديكونتاميناتور رناسي تليها ثنائي إثيل بيروكاربوناتي معاملة (ديبك) المياه. واسمحوا أن بين عشية وضحاها الجافة رأسا على سطح الحمض النووي الريبي/الحمض النووي/نوكلاس مجاناً، وتجنب أي الغبار أو تلوث الهواء الأخرى.
      تنبيه: ديبك شديدة السمية وينبغي التعامل معها والتخلص منها باستخدام البروتوكول القياسي من المواد الكيميائية الخطرة EH & S.
  2. تنظيف الفرش لتقطيع مع رناسي ديكونتاميناتور، والسماح الجافة بين عشية وضحاها. تجنب أي الغبار والملوثات الأخرى.
  3. مكان الغشاء الشرائح تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عدم فضح الشرائح للأشعة فوق البنفسجية أكثر من 1-2 يوم قبل استخدامها. ويعزز هذا ربط الأنسجة إلى الشريحة الغشاء.
    ملاحظة: يمكن أن تكون خطوة 2.3 جنبا إلى جنب مع الخطوة 4، الذي يسمح لشريحة الأشعة فوق البنفسجية العلاج تحدث في اليوم نفسه كتقطيع الأنسجة (راجع الخطوة 4، 4).

3-إعداد الحلول التثبيت مع رناسي المياه مجاناً والايثانول عالي الجودة

ملاحظة: وتعد جميع الحلول الطازجة لكل تجربة. ضمان إنجاز صاحب الشريحة التنظيف الداخلي من "الخطوة 1، 1". وتعد جميع الحلول في أصحاب الشريحة.

  1. ضع 30 مل إيثانول 100% في شريحة واحدة حامل.
  2. تمييع الإيثانول مع رناسي/الدناز/نوكلاس المياه مجاناً. مكان 30 مل من الإيثانول 95% في إحدى الشرائح حامل ووضع على الجليد.
  3. تمييع الإيثانول مع رناسي/الدناز/نوكلاس المياه مجاناً. مكان 30 مل من الإيثانول 70% في إحدى الشرائح حامل ووضع على الجليد.
  4. فصل أصحاب الشريحة مكان 30 مل من زيلين نفط 100% في اثنين وتسميتها #1 و #2.

4-إعداد كريوستات لتقطيع الأنسجة

  1. الحصول على دلو من الجليد لحلول الإيثانول وحاوية مع الثلج الجاف للأنسجة.
    تنبيه: الثلج الجاف باردة للغاية، وذلك باستخدام قفازات واقية. لا تضع الثلج والجليد الجاف في نفس الحاوية. اختلاف درجات الحرارة في الجليد والثلج الجاف سيؤدي إلى النموذج معا في درجة حرارة غير محددة.
  2. إزالة الأنسجة من الثلاجة-80 درجة مئوية وعلى الثلج الجاف للنقل إلى كريوستات.
  3. كريوستات الإعدادات:
    1. تعيين سمك الباب 14 ميكرومتر.
    2. تعيين سمك القطع إلى 30 ميكرو للحفاظ على كمية الأنسجة.
    3. كريوستاتس مع غرفة مزدوجة والعينة يحملون درجات الحرارة، اضبط درجة حرارة الغرفة (CT) إلى-18 درجة مئوية. بالنسبة كريوستاتس مع إعداد واحد، تعيين درجة الحرارة إلى-17 درجة مئوية.
    4. بالنسبة كريوستاتس مع غرفة مزدوجة وعقد درجة حرارة العينة، تعيين درجة حرارة الكائن (OT) إلى-16 درجة مئوية.
      ملاحظة: التمديد يجب أن يكون أكثر دفئا من الأشعة المقطعية لضمان قطع حتى. إذا كان لا يزال هو تمزيق النسيج، يمكن زيادة العبارات إلى-15 درجة مئوية، ويمكن زيادة الأشعة المقطعية إلى-18 درجة مئوية.
  4. وضع الأنسجة في كريوستات لمدة 20 دقيقة على الأقل للسماح بالتوصل إلى درجة الحرارة المثلى.
    ملاحظة: إذا لم يكن الأنسجة في درجة الحرارة المثلى، فإنه سوف اجاد عند القطع. لا تضع الأنسجة في-20 درجة مئوية في الليلة السابقة للمحافظة على سلامة الحمض النووي الريبي ومنع تشكيل كريستال الجليد. تسمح الأنسجة كالكثير من الوقت حسب الضرورة لحجته إلى درجة الحرارة المثلى قص بسلاسة. التنفيذ الاختياري للحضانة الشريحة تحت الأشعة فوق البنفسجية قد يحدث هنا (انظر الخطوة 1-3).
  5. ضع 'تشاك' في كريوستات عن 20 دقيقة على الأقل للسماح لينزل إلى درجة حرارة كريوستات.
  6. وضع الفرش النظيفة في كريوستات عن 20 دقيقة على الأقل للسماح لينزل إلى درجة حرارة كريوستات.
  7. تنظيف في كريوستات
    1. تنظيف المسرح مع خليط رناسي ديكونتاميناتور و 70% الإيثانول المخفف بالحمض النووي الريبي/الحمض النووي/نوكلاس المياه مجاناً لمنع تجمده في المرحلة 1:1.
    2. تنظيف شفرة كريوستات المتاح جديدة مع ديكونتاميناتور رناسي ومكان في حامل بليد في المرحلة. السماح على الأقل 20 دقيقة بليد كريوستات التوصل إلى درجة حرارة كريوستات.
    3. تنظيف لوحة لفة المضادة مع ديكونتاميناتور رناسي ونعلق على المسرح. السماح على الأقل 20 دقيقة للوحة لفة المضادة التوصل إلى درجة حرارة كريوستات.
      ملاحظة: صفيحة لفة المضادة غير مطلوب لقطع ولكن ينصح بشدة. إذا لم يتوفر صفيحة لفة المضادة، فرشاة تنظيف يعمل كبديل لذلك. إذا لم تكن لوحة لفة المضادة في درجة الحرارة الصحيحة، سوف تذوب الأنسجة أو العصا عند القطع.

5-تقطيع الأنسجة

  1. قطع قطعة صغيرة من الأنسجة (~ 1 سم × 1 سم) لتمزيقها. عودة الأنسجة المتبقية للثلج الجاف-80 درجة مئوية المجمد.
    ملاحظة: تأكد من المقطع أنسجة قشرة الدماغ ~ 95%، حيث توجد خلايا بوركنجي.
  2. مكان التلة عالية حوالي 3 مم من أكتوبر لتغطية 'تشاك'. البدء ببناء الطبقات في الأعلى في حركة دائرية، بطيئة، حتى يكون هناك كومة صغيرة.
  3. بعد أكتوبر مجمد جزئيا، ولكن لا يزال هناك بعض السائل في الوسط، ضع الأنسجة على رأس OCT. عدم دفع الأنسجة عميقا في أكتوبر الماضي السماح الأنسجة للجلوس على رأس أكتوبر حتى تجمد تماما. وهذا سوف يستغرق 1-2 دقيقة.
  4. ضع 'تشاك' مع أكتوبر المجمدة والأنسجة في ذراع القطع كريوستات. ضبط الأنسجة حيث يكون تدفق مع شفرة قطع.
  5. تسمح الأنسجة للجلوس في قطع الذراع لمدة 15-20 دقيقة لضبط درجة الحرارة الجديدة.
    ملاحظة: اعتماداً على سمك الأنسجة، يلزم وقت للتأقلم درجة الحرارة. تسمح الأنسجة للجلوس ما دام المطلوب لقطع نظيفة. ضبط بعد التمديد والأشعة المقطعية للمساعدة على التأقلم درجة حرارة الأنسجة.
  6. تتحرك ببطء الأنسجة أقرب إلى الشفرة. متى وصلت الأنسجة بليد، بدء عملية القطع. يجب تعيين سمك القطع إلى 30 ميكرومتر.
  7. تقليم x 2 – 3 حتى طبقات قشرة مرئية.
  8. ومحاذاة لوحة لفة المضادة ألتو أعلاه بليد كريوستات.
    ملاحظة: سوف يظهر خط فضة من الضوء في كريوستات في الواجهة بليد ولفه المضادة لوحة. يشير هذا إلى لوحة لفة المضادة مباشرة على حافة النصل.
  9. -البدء في قطع المقاطع في 14 ميكرومتر. سوف تكون المقاطع بشكل صحيح قطع شقة تحت صفيحة لفة المضادة.
    ملاحظة: إذا تمسك الأنسجة، ضمان أن لوحة لفة لمكافحة البرد ما فيه الكفاية. إذا كان ضروريا، وضع قطعة من الجاف الجليد على الإرادة (الجانب عدم لمس المرحلة) خارج سرعة البرد لوحة لفة المضادة.
  10. قطع المقاطع 4 – 6 ومحاذاتها أفقياً عبر مرحلة كريوستات.
  11. الصيد الشريحة، تلتقط كل قطعة من النسيج في وقت واحد.
    ملاحظة: باستخدام الفرش، رفع حتى ينتهي الأنسجة لتكون متاحة بسهولة أكبر للشريحة عند التقاط. لا تلتقط مقطع واحد في وقت واحد. سوف تخفض التعرض إلى الهواء درجة حرارة الغرفة سلامة الحمض النووي الريبي.
    تنبيه: لا تدع الغشاء مرحلة كريوستات اللمس. إذا الغشاء الذي يمس المرحلة، أنها سوف تبدأ في فصل من الشريحة الزجاجية وسوف تتسبب في حدوث أخطاء عند محاولة LCM.
  12. الانتقال مباشرة إلى الخطوة 6. عدم تأخير التثبيت.

6-تحديد التصور الأنسجة/وصمة عار أقل

  1. الانتقال فورا إلى البروتوكول التثبيت الإيثانول
  2. ضع الشريحة في حامل الشريحة مع الإيثانول 70% لمدة 2 دقيقة – على الجليد.
  3. ضع الشريحة في حامل الشريحة مع الإيثانول 95% مقابل 45 s – على الجليد.
  4. ضع الشريحة في حامل الشريحة مع الإيثانول 100% لمدة 2 دقيقة – في الرايت
  5. تراجع الشريحة 3 مرات في حامل الشريحة مع زيلين نفط 1 – في الرايت
  6. ضع الشريحة في حامل الشريحة مع زيلين نفط 2 لمدة 5 دقائق – في الرايت
  7. السماح لتجف في منطقة نظيفة لمالا يقل عن 30 دقيقة أطول الأوقات الجافة الأمثل، يصل إلى 60 دقيقة.
    تنبيه: الوقوف في وجه الشرائح للتجفيف في غطاء دخان. زيلين نفط قابلة للاشتعال. يؤدي زرع شرائح مسطحة زيلين نفط إلى تجمع في قسم الأنسجة، التي سوف تتسبب في الأنسجة لتكون داكنة جداً.

7-اختياري – شريحة التخزين

  1. ضع الشرائح المجففة في أنابيب الفردية 50 مل (شريحة واحدة في الأنبوب) ومكان في الثلاجة-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.
    ملاحظة: يجب أن تكون الشرائح الجافة قبل وضع في الثلاجة-80 درجة مئوية. لا تستخدم ديسيككانت داخل الأنبوب كما سيتم تضمين الجسيمات في الأنسجة والأغشية. التأكد من أن غطاء أنبوب ضيق؛ إذا لم يكن الأمر كذلك، سوف يحدث التكثيف على الشريحة عند ذوبان الجليد للاستخدام.
    تنبيه: سلامة الحمض النووي الريبي النقصان بعد 7 أيام، كما يفعل نوعية التصور الأنسجة.

8-ذوبان الجليد تخزين الشرائح لاستخدامها

  1. إزالة الأنبوب مع شريحة واحدة من الثلاجة-80 درجة مئوية ح 1 قبل الاستخدام.
  2. لا تفتح فورا الأنبوب. يسمح الأنبوب إلى درجة حرارة الغرفة. سوف يحدث التكثيف على السطح الخارجي للأنبوب فقط.
  3. مرة واحدة قد حان الأنبوب إلى درجة حرارة الغرفة وجميع التكثيف ذهب (حوالي 30-40 دقيقة)، إزالة الغطاء وفضح الشريحة في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
  4. السماح بأن يتأقلم بدرجة حرارة الغرفة 15-20 دقيقة إجازة إزالة الشريحة داخل الأنبوب مع الحد الأقصى للشريحة.
    ملاحظة: الشريحة جاهز الآن ل LCM.

9-ليزر ميكروديسيكشن القبض على خلايا بوركنجي:

ملاحظة: وسيناقش هذا الجزء من البروتوكول فقط التفاصيل المتصلة بالتقاط خلايا بوركنجي لتسلسل الحمض النووي الريبي اللاحقة. هذا المقطع يفترض أن المستخدم مألوف مع المجهر التقاط الليزر الأشعة فوق البنفسجية والبرامج التابعة لها.

  1. تنظيف مرحلة مجهر وجمع الحد الأقصى الذراع مع ديكونتاميناتور رناسي.
  2. مع الأيدي القفاز، مكان الشريحة في المجهر و 500 ميكروليتر كاب مبهمة في الذراع جمع.
    ملاحظة: دائماً ضمان الأسلوب السليم في الجيش الملكي النيبالي بتنظيف منطقة العمل مع ديكونتاميناتور رناسي واستخدام الأيدي القفاز أثناء لمس الشريحة أو غطاء غير شفاف. يمكن إزالة القفازات بمجرد الشريحة وكاب المعمول بها وقد بدأ التقاط الليزر.
  3. تكبير منخفضة، محاذاة كاب مبهمة على أنسجة الدماغ، ضمان أن السقف يغطي المنطقة بأكملها تصور في قطعة العين.
    ملاحظة: سوف تظهر فقط قطعة العين المجهر إذا يتم توسيط الغطاء غير شفاف. لن يتم إظهار الكاميرا إذا كان الغطاء يتركز على الأنسجة. استناداً إلى تصميم نطاق التقاط الليزر، أما أن التصور من خلال الغطاء غير شفاف في قطعة العين فقط أو تصور في كل قطعة العين والكاميرا.
  4. تصور طبقات الدماغ مع 5 x-10 x الهدف العدسة، وقم بوضع المؤشر فوق المقطع حيث تتقاطع الخلايا الحبيبية والجزيئية طبقة (طبقة خلايا بوركنجي).
  5. الانتقال إلى 40 س ووضع تصور لخلايا بوركنجي.
    ملاحظة: انظر الشكل 1 و الشكل 2 لتصورات المثال.
  6. بدء التقاط خلايا بوركنجي.
    ملاحظة: لأداء الجيش الملكي النيبالي-التسلسل، على الأقل 5 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي المطلوب. حوالي 1600 – 2000 بوركنجي الخلايا ينتج ما يكفي من المواد الحمض النووي الريبي للتسلسل. الجيش الملكي النيبالي ستكون مستقرة لمدة تصل إلى 8 ساعات في المجهر. اختبار الطاقة الأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية التركيز قبل جمع ضمان مستويات صحيحة. مع مرور الوقت، سوف تستمر الأنسجة لتجف وطاقة الأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية التركيز قد تحتاج إلى تغيير.

10-الجيش الملكي النيبالي "جمع" وظيفة LCM

  1. إعداد المخزن المؤقت تحلل الخلية (إعداد جديدة كل مرة)
    1. تمييع 2-mercaptoethanol في المخزن المؤقت لتحلل في 1: 100 (10 مل μL:1، على التوالي). المخزن المؤقت لتحلل (RLT) يرد في الجدول للمواد (#14 و #15).
  2. إضافة 50 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية إلى كاب معتمة، مع سقف أعلى. بعناية قم بإغلاق الأنبوب عبر عملية النداءات الموحدة.
  3. اترك الأنبوب رأسا على عقب لمدة 1 دقيقة.
  4. دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية، وتدور بسرعة تحلل المخزن المؤقت إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. إعادة فتح الأنبوب، ثم كرر الخطوات من 10.2-10.4.
  6. ضع الأنبوب الذي يحتوي على 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل، والجيش الملكي النيبالي من الثلاجة-80 درجة مئوية إلى جميع العينات يتم الانتهاء وجاهزة لاستخراج الحمض النووي الريبي (الجدول للمواد #14).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول بالتفصيل الخطوات اللازمة لإعداد الجثة المجمدة الطازجة أنسجة المخ البشري للأشعة فوق البنفسجية-LCM. يتم إعطاء مواصفات دقيقة وشروح لقطع كريوستات، كما أنه يمكن أن يكون من الصعب على قطع أنسجة المخ المجمدة الطازجة بدرجة عالية من الدقة. أهم نقطة للنظر هو أن الأنسجة المجمدة الطازجة باردة للغاية ويتطلب قدرا كبيرا من الوقت ليتأقلم بدرجة حرارة أدفأ كريوستات. لا يمكن التسرع في هذه الخطوة، ولا يمكن أن يكون مبالغا فيه كيف وسط هذه الخطوة في نجاح أو فشل هذا البروتوكول. إذا لم تكن مستعدة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تعديل البروتوكول المعروضة هنا على وجه التحديد أن اتباع نهج غير القابل للصدأ في تصور الأنسجة شكلياً متميزة للأشعة فوق البنفسجية-LCM. يهدف هذا الأسلوب تحقيق أقصى قدر من سلامة الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة اللاحقة، مع الحفاظ على مستوى معزز من التصور الأنسجة. القدرة على التمييز بين أنواع الخلايا المختلفة لالتقاط الصور، لإنشاء السكان أنقى من الخلايا الممكنة، أمر ضروري لفهم مختلف التشكيلات الجانبية الجزيئية في الأنسجة البشرية15. في إطار هذا البروتوكول، اختيار الأنسجة أمر با...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تود أن تقر بنك "نيويورك الدماغ"، الدكتور جان بول فونساتيل والدكتور إيتي كورتيز، لمساعدتها في قطع والحفاظ على عينات الأنسجة المجمدة الدماغ البشري لهذه التجارب. يود المؤلفون الاعتراف بالأفراد الذين تبرعوا بسخاء على الدماغ للبحوث المستمرة في "الهزة الأساسية". الدكتور مارتوسسيلو والدكتور فاوست تود أن تقر إدارة جامعة كولومبيا لعلم الأمراض وعلم الأحياء الخلية لدعمهم المستمر والفضاء البحوث الأساسية. المؤلف يود أن يعترف المعاهد الوطنية للصحة R01 NS088257 لويس/فاوست) لتمويل البحوث لهذا المشروع. صور LCM أجريت في كونفوكال ومنح "المتخصصة مجهرية الموارد المشتركة" من مركز السرطان الشامل ايرفينغ هربرت في جامعة كولومبيا، تدعمها المعاهد الوطنية للصحة #P30 CA013696 (المعهد الوطني للسرطان). الكتاب تود أن تقر تيريزا سويني ولورا مونتيانو لمواصلة تقديم المساعدة مع الفحص المجهري المتخصصة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
MembraneSlide NF 1.0 PENZeiss415190-9081-000شرائح غشاء للأنسجة. لا نوصي باستخدام الشرائح الزجاجية.
AdhesiveCap 500 غير شفافZeiss415190-9201-000الأغطية غير الشفافة لتعزيز التصور على النطاقات المقلوبة فقط
RNase AwayMolecular BioProducts7005-11منتجات إزالة التلوث RNase الأخرى مناسبة أيضا. يستخدم لتنظيف جميع الأسطح قبل العمل.
200 مختبرات إثبات الإيثانول2701في حالة استخدام الإيثانول البديل ، تأكد من الجودة العالية. ضروري لتثبيت الأنسجة.
الزيلين (معتمد من ACS)فيشر ساينتفيكX5P-1GALفي حالة استخدام زيلين بديل ، تأكد من الجودة العالية. ضروري لتصور الأنسجة. 
ماء مقطر فائق النقاءInvitrogen10977-015مياه خالية من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي / نوكليز أخرى مناسبة أيضا. تستخدم في تخفيف الإيثانول فقط.
برطمانات الشريحة الجاهزةدائمة الخضرة240-5440-G8Kأي حامل / جرة منزلقة مناسب أيضا. يجب تنظيفه قبل الاستخدام. تستخدم للتثبيت بعد التقسيم. 
لوحة مضادة للدحرجة ، Assy. 70 مم 100 مو ؛ mLeica Biosystems14041933980يتم تحديد نوع اللوحة المضادة للدحرجة حسب نوع ناظم التبريد وموقع التثبيت على المسرح. جميع أجهزة التبريد لها متطلبات مختلفة.
ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC)Sigma AldrichD5758-50mLDEPC من أي بائع سيفعل. اتبع التعليمات الخاصة بمعالجة المياه. 
KimwipesFisher Scientific06-666AKimwipes من أي بائع واستخدامه بأي حجم. يجب استخدام Kimwipes لتنظيف المجهر والمبرد.
الأنسجة الزائدة O.C.T. مركبفيشر العلمي23-730-571أي نوع من OCT مقبول. لن يتم تضمين أي نسيج في OCT ، فمن الصعب إرفاق الأنسجة ب "تشاك".
شفرات Edge-Rite Low-ProfileThermo Scientific4280Lنوع الشفرة حسب نوع الناجمة عن البرد. جميع أجهزة التبريد لها متطلبات مختلفة.
لايكا مايكروسيستمز 3P  25 + 30 مم كرايستات تشوكفيشر NC0558768 العلميتحديد نوع تشاك حسب نوع ناظم البرد. جميع أجهزة التبريد لها متطلبات مختلفة. أي من الحجمين مناسب. 
RNeasy Micro Kit (50)Qiagen74004مطلوب لاستخراج الحمض النووي الريبي بعد المضاعف المستمر. مخزن تحلل RLT ضروري لجمع الخلايا الملتقطة من غطاء غير شفاف.
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104مطلوب لاستخراج الحمض النووي الريبي لإعدادات القسم ، والتي يتم إجراؤها قبل المضاعف المشترك الأصغر لاختبار سلامة الحمض النووي الريبي للأنسجة الناشئة.
ستقوم مجموعة DNase الخالية من RNaseQiagen79254Dnase بإزالة أي حمض نووي للسماح بمجموعة من الحمض النووي الريبي النقي. تأكد من أن Dnase طازج.
2-MercaptoethanolSigma AldrichM6250-100MLتم شراؤها حسب تقدير المستخدم. ضروري للإضافة إلى المخزن المؤقت RLT لتحلل الخلايا. يمنع نشاط RNase. 
جلوب ساينتفيك  أنبوب الطرد المركزي الدقيق المتدرج المعتمد (2 مل)فيشر ساينتفيك22-010-092أي أنبوب سعة 2 مل خال من RNase وخالي من DNase وخالي من الحمض النووي البشري وخالي من Pyrogen سيفي بالغرض.
تستخدم يمكن طلب يتم تحديد يتم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, H., et al. Laser capture microdissection for the investigative pathologist. Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).
  2. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  3. Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).
  4. Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).
  5. Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality. Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).
  6. Wang, H., et al. Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA. BMC Genomics. 7, 97(2006).
  7. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Springer. (2018).
  8. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  9. Graeme, M. I. Laser Capture Microdissection. Third edn. , Humana Press. (2018).
  10. Louis, E. D. Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology. Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).
  11. Choe, M., et al. Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis. Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).
  12. Louis, E. D., et al. Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls. Brain. , Pt 12 3297-3307 (2007).
  13. Louis, E. D., et al. Neuropathologic findings in essential tremor. Neurology. 13 (66), 1756-1759 (2006).
  14. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  15. Jensen, E. Laser Capture Microdissection. The Anatomical Record. (296), 1683-1687 (2013).
  16. Waller, R., et al. Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).
  17. Lee, S., et al. Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).
  18. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  19. Sonne, S. B., et al. Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ. PLoS One. 4 (5), 5536(2009).
  20. Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
  21. Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (1), 442(2017).
  22. Kumar, A., et al. Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).
  23. Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PLoS One. 8 (2), 56507(2013).
  24. Walker, D. G., et al. Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program. Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).
  25. Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).
  26. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  27. Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Scientific Reports. 6, 25533(2016).
  28. Carl Zeiss Microscopy. , Carl Zeiss. Germany. (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة