مقالة منهجية

الإنسان المحيطية عزل العدلات الدم لاستجواب باركنسون المرتبطة LRRK2 مسار كيناز من خلال تقييم Rab10 الفوسفور

DOI:

10.3791/58956

⸱

مارس 21, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, 2The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, 3Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 4Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Centre and the Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease, Toronto Western Hospital, University of Toronto, 5Division of Cell Signalling and Immunology, School of Life Sciences, University of Dundee, 6Division of Molecular and Clinical Medicine, School of Medicine, Ninewells Hospital and Medical School, University of Dundee

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطفرات في الليوسيني الغنية تكرار جين كيناس 2 (LRRK2) تسبب مرض باركنسون الوراثية. لقد طورنا طريقة سهلة وقوية لتقييم الفوسفور الذي يسيطر عليه LRRK2 من Rab10 في العدلات الدم المحيطية البشرية. وهذا قد يساعد على تحديد الأفراد مع زيادة نشاط مسار كيناز LRRK2.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الليوسين الغنية تكرار كيناز 2 (LRRK2) هو الجين الأكثر تحور في كثير من الأحيان في مرض باركنسون الوراثية (PD) وجميع الطفرات LRRK2 المسببة للأمراض يؤدي إلى فرط تنشيط وظيفتها كيناز. هنا، ونحن نصف قياس سهلة وقوية لقياس نشاط مسار كيناز LRRK2 في العدلات الدم المحيطية البشرية من خلال قياس الفوسفور LRRK2 التي تسيطر عليها واحدة من ركائزها الفسيولوجية، Rab10 في threonine 73. يتطلب تحليل المناعي الموصوف جسمًا مضادًا انتقائيًا وفوسفومحددًا تمامًا يتعرف على فوسفور epitope Rab10 Thr73 الذي سجله LRRK2 ، مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة من نوع MJFF-pRab10. ويستخدم العدلات الدم المحيطية البشرية, لأن الدم المحيطي يمكن الوصول إليها بسهولة والعدلات هي مكون وفيرة ومتجانسة. الأهم من ذلك، العدلات التعبير عن مستويات عالية نسبيا من كل من LRRK2 وRab10. عيب محتمل من العدلات هو نشاطها البروتياز سيرين الجوهرية العالية، مما يتطلب استخدام مثبطات البروتياز قوية جدا مثل السم العصبي العضوية diisopropylfluorophosphate (DIFP) كجزء من المخزن المؤقت الزل. ومع ذلك، فإن العدلات هي مورد قيم للبحث في نشاط مسار LRRK2 كيناز في الجسم الحي وينبغي النظر في إدراجها في مجموعات مستودعات PD الحيوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فشلت محاولات إبطاء أو وقف مرض باركنسون (PD) حتى الآن. اكتشاف طفرات فرط التنشيط في الليوسين الغنية تكرار كيناز 2 (LRRK2) التي تسبب و / أو زيادة خطر PD أدى إلى تطوير مثبطات كيناز LRRK21،2،3. وقد دخلت هذه الآن التجارب السريرية4. وظيفة بالضبط من LRRK2 غير واضح، ولكن التقدم الرئيسي كان تحديد مجموعة فرعية من البروتينات راب GTPase، بما في ذلك Rab10، كأول ركائز الفسيولوجية حسن النية من كيناز LRRK25،6،7. التحديات الرئيسية في عصر العلاجات تعديل الأمراض هي العلامات الكيميائية الحيوية لحالة تنشيط الكيناز LRRK2 والمشاركة المستهدفة من مثبطات كيناز LRRK2.

حتى الآن، العلامة الدوائية الرئيسية لمثبطات LRRK2 في الجسم الحي كانت مجموعة من بقايا سيرين الفوسفورية التأسيسية من LRRK2، ولا سيما سيرين 935، التي تصبح dephosphorylated استجابة لمثبطات LRRK2 المتنوعة8،,9. ومع ذلك، سيرين 935 الفوسفور لا يرتبط مع نشاط الكيناز الخلوي الجوهري LRRK2 لأنه ليس الفوسفوري مباشرة من LRRK2 ولا يزال الفوسفورفي الكيناس غير نشط LRRK210. LRRK2 نشاط كيناز يرتبط بشكل جيد مع الفوسفور التلقائي من سيرين 1292، لكنه من الناحية العملية ليست قراءة مناسبة لنشاط LRRK2 كيناز الذاتية من خلال تحليل immunoblot من مقتطفات الخلية بأكملها بسبب عدم وجود الأجسام المضادة موثوق بها وفوسفومحددة لهذا الموقع10،11.

لقد قمنا بتطوير قياس قوي وسهل لقياس نشاط مسار الكيناز LRRK2 في خلايا الدم المحيطية البشرية التي تقيس الفوسفور الذي تسيطر عليه LRRK2 من البروتين المستهدف الفسيولوجي Rab10 في threonine 7311. يمكن الوصول إلى الدم المحيطي بسهولة عن طريق venesection ، وهو إجراء منخفض الخطورة وسريع يسبب الحد الأدنى من عدم الراحة. نحن نركز على العدلات الدم المحيطية البشرية لأنها تشكل وفرة (37-80٪ من جميع خلايا الدم البيضاء) وخلايا متجانسة السكان التي تعبر عن مستويات عالية نسبيا من كل من LRRK2 وRab1011. وعلاوة على ذلك، يمكن عزل العدلات الدم المحيطية بسرعة وكفاءة من خلال استخدام نهج سلبي مغناطيسي مناعية. لضمان أن يتم التوسط في الفوسفور Rab10 لوحظ اللاحقة من قبل LRRK2، يتم احتضان كل دفعة من العدلات مع أو بدون مثبط كيناس LRRK2 قوية وانتقائية (نستخدم ونوصي MLi-2)2،,12. ثم يتبع ذلك الانزلات الخلوي في عازل يحتوي على البروثيديفوسفوسفوسفلور ثنائي البروبروبروبيل (DIFP)، وهو أمر ضروري لقمع نشاط البروتياز الرِسيّ الجوهري المعروف أنّه مرتفع في العدلات13. للتحليل النهائي عن طريق المناعي الكمي، نوصي باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة MJFF-pRab10 الأرنب الذي يكشف على وجه التحديد Rab10 Thr73-phosphoepitope ولا عبر التفاعل مع البروتينات راب الفوسفورية الأخرى14. وقد تم التحقق من صحة الانتقائية وخصوصية هذا الأجسام المضادة في نماذج الإفراط في التعبير من البروتينات راب مختلفة وA549 Rab10 ضرب خارج خط الخلية14. وهكذا، فإننا قياس الفرق في الفوسفور Rab10 في العدلات التي تم التعامل معها مع وبدون مثبط كيناس LRRK2 قوية وانتقائية2. وبدلاً من ذلك، يمكن أيضاً تحليل العينات بأساليب أخرى، مثل قياس الطيف الكمي للكتلة.

في الختام، LRRK2 التي تسيطر عليها Rab10 الفوسفور هو علامة متفوقة من نشاط كيناز LRRK2 إلى الفوسفور LRRK2 في سيرين 935 والبشر العدلات الدم المحيطية هي مورد قيمة لبحوث PD في LRRK2. بروتوكوللدينا يوفر فحص قوي وسهل لاستجواب نشاط مسار LRRK2 في العدلات الدم المحيطية ويسمح الطبقية الكيميائية الحيوية للأفراد مع زيادة LRRK2 نشاط كيناز15. الأهم من ذلك، قد يستفيد هؤلاء الأفراد من العلاج مثبطات الكيناز LRRK2 في المستقبل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفقا للوائح المحلية في المملكة المتحدة يتم إجراء جميع التلاعب والأنابيب من الدم البشري في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الفئة 2. وقد نُفِّمت جميع الإجراءات وفقاً للمجلس المحلي لاستعراض الأخلاقيات، وقدم جميع المشاركين موافقة مستنيرة.

1- التحضير

  1. إعداد 0.1 مل من حل الأسهم EDTA 1 التي تحتوي على 100 mM EDTA في المالحة المخزنة مؤقتا الفوسفات (PBS).
  2. إعداد 60 مل من حل الأسهم EDTA 2 التي تحتوي على 1 mM EDTA في برنامج تلفزيوني.
  3. إعداد المخزن المؤقت lysis التي تحتوي على 50 mM Tris-HCl (درجة الحموضة = 7.5)، 1٪ (v/v) تريتون X-100، 1 mM EGTA، 1 mM Na3VO4,50 mM NaF, 10 mM α-glycerophosphate, 5 mm الصوديوم بيروفوسفات, 0.27 M السكروز, 0.1% (v/v) α-mercaptoethanol, 1x كوكتيل مثبطات البروتياز, 1 ميكروغرام/مل microcystin-LR, و 0.5 mm diisopropyl fluorophosphate (DIFP).
    ملاحظة: يستخدم المؤلفون بشكل روتيني منتجًا خاليًا من EDTA ، ولكن يجب أن يعمل أيضًا كوكتيل مثبط البروتياز المحتوي على EDTA. يمكن إجراء المخزن المؤقت الليسيس مقدما دون α-mercaptoethanol، مثبطات البروتياز، microcystin-LR، وDIFP، وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام. تأكد من أن يتم إضافة الـ α-mercaptoethanol ومثبطات البروتياز وmicrocystin-LR وDIFP مباشرة فقط قبل الاستخدام.
    تنبيه: DIFP سام ويجب التعامل معه بعناية في غطاء الدخان بعد تقييم مخاطر الصحة والسلامة المحلية. يمكن إضافة DIFP إلى المخزن المؤقت للإزالة واستخدمه على الفور. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يتم اقتباس المخزن المؤقت الكامل الذي يحتوي على كافة المكونات الأخرى، بما في ذلك DIFP، وتخزينه عند -80 درجة مئوية للاستخدام اللاحق لمدة 4 أسابيع على الأقل.

2. عزل نيوتروفيل عن الدم كله

  1. جمع 10 مل من الدم في أنبوب جمع الدم. اخلط بلطف بواسطة أنابيب مقلوبة 7-8x.
  2. نقل 10 مل من الدم إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من محلول المخزون EDTA 1 إلى الدم. مزيج بلطف.
  4. أضف 500 ميكرولتر من كوكتيل العزلة (50 ميكرولتر/مل) من طقم عزل العدلات(جدول المواد)إلى عينة الدم بأكملها.
  5. دوامة الخرز المغناطيسي من مجموعة عزل العدلات لمدة 30 ق قبل الاستخدام من أجل إعادة تعليق الخرز المغناطيسي غرامة جدا.
  6. أضف 500 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى عينة الدم واخلط بلطف عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات.
  7. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقيقة.
  8. ملء أنبوب إلى 50 مل مع حل الأسهم EDTA 2. مزيج من قبل الأنابيب بلطف جدا صعودا وهبوطا 2-3x.
  9. ضع الأنبوب في المغناطيس وإزالة الغطاء لتجنب الهياج اللاحق للأنبوب.
  10. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  11. بعناية pipette تعليق الخلية المخصب الذي يحتوي على العدلات في أنبوب مخروطي جديد 50 مل.
    ملاحظة: لا تلمس جانب الأنبوب الذي هو على اتصال مع المغناطيس وتجنب جمع واضطراب خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب. اترك حوالي 10 مل من تعليق خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب.
  12. دوامة الخرز المغناطيسي لمدة 30 ق قبل الاستخدام وإضافة 0.5 مل من الخرز المغناطيسي إلى أنبوب يحتوي على العدلات المخصب. مزيج بلطف عن طريق عكس الأنبوب.
  13. احتضان في RT لمدة 5 دقيقة.
  14. ضع الأنبوب في المغناطيس وإزالة الغطاء لتجنب الانفعالات اللاحقة.
  15. احتضان في RT لمدة 5 دقيقة.
  16. بعناية pipette تعليق الخلية المخصب الذي يحتوي على العدلات في أنبوب مخروطي جديد 50 مل.
    ملاحظة: لا تلمس جانب الأنبوب الذي هو على اتصال مع المغناطيس. اترك حوالي 5 مل من التعليق في الجزء السفلي من الأنبوب.
  17. لضمان الإزالة الكاملة للحبات المغناطيسية من خليط الخلية ، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المخصبة في المغناطيس.
  18. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  19. بعناية تعليق الخلية المخصب الذي يحتوي الآن على العدلات النقية في أنبوب مخروطي جديد 50 مل.
    ملاحظة: لا تلمس جانب الأنبوب الذي هو على اتصال مع المغناطيس. اترك حوالي 5 مل من التعليق في الجزء السفلي من الأنبوب.
  20. خلط الخلايا المعزولة مع 1 mM EDTA حل الأسهم 2 إلى حجم النهائي من حوالي 41 مل. ماصة صعودا وهبوطا لخلط.
  21. تقسيم الحل بالتساوي إلى أنبوبين مع ما يقرب من 20 مل في كل أنبوب.
  22. الطرد المركزي على حد سواء أنابيب في 335 × ز لمدة 5 دقيقة.
  23. خلال هذا الطرد المركزي تأخذ MLi-2 مانع المخزون (200 μM/1000x التركيز) من الفريزر -80 درجة مئوية وترك في RT للاستخدام اللاحق.
  24. مباشرة بعد خطوة الطرد المركزي ودون هياج من الأنابيب، صب قبالة supernatant دون إزعاج الكريات العدلات. إعادة تعليق كل بيليه الخلية في 10 مل من الوسائط ثقافة الخلية(جدول المواد)في RT بواسطة الخلايا pipetting بلطف صعودا وهبوطا 4x.

3. LRRK2 كيناز مثبطالعلاج من العدلات النقية

  1. تسمية أنبوب واحد "DMSO" وأنبوب آخر "MLi-2".
  2. إلى أنبوب "DMSO" المسمى، إضافة 10 ميكرولتر من DMSO وتخلط بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 2x مع ماصة 10 مل. إلى أنبوب "MLi-2" المسمى، إضافة 10 ميكرولتر من 200 ميكرومتر MLi-2 محلول الأسهم (التركيز النهائي 200 nM) وتخلط بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 2x مع ماصة 10 مل.
  3. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في RT. ميكس بلطف عن طريق عكس كل 10 دقيقة أثناء الحضانة.
  4. خلال فترة الحضانة، قم بإزالة مخزون 0.5 M DIFP من الفريزر -80 درجة مئوية ووضعه في غطاء الدخان على الجليد. إزالة 1 ملغ / مل microcystin-LR محلول الأسهم من الفريزر -80 درجة مئوية وترك في RT لذوبان. خذ العليوت (0.25 مل) من المخزن المؤقت للليسيس خارج الفريزر ، واسمح له بإذابة الجليد في RT ، ثم وضعه على الجليد للاستخدام اللاحق.
  5. إعداد 1 مل من وسط ثقافة الخلية التي تحتوي على 1 ميكرولتر من DMSO واستدعاء هذا المخزن المؤقت DMSO إعادة التعليق. قم بإعداد 1 مل من وسائط RPMI التي تحتوي على 1 ميكرولتر من 200 ميكرومتر MLi-2 واستدعاء هذا المخزن المؤقت MLi-2 إعادة التعليق.
  6. بعد فترة الحضانة 30 دقيقة، الطرد المركزي كلا الأنبوبين في 335 × ز لمدة 5 دقيقة.
  7. تجاهل بعناية supernatant في كل أنبوب دون إزعاج بيليه العدلات.
  8. للعينة المسماة DMSO بلطف إعادة تعليق بيليه في 1 مل من المخزن المؤقت DMSO إعادة التعليق وللأنبوب المسمى MLi-2، إعادة تعليق بيليه في 1 مل من المخزن المؤقت MLi-2 إعادة التعليق.
  9. نقل كريات الخلية التي أعيد تعليقها إلى أنابيب الطرد المركزي المقابلة المسماة "DMSO" و "MLi-2" والطرد المركزي على حد سواء في 335 × ز لمدة 3 دقيقة.
  10. أثناء خطوة الطرد المركزي، قم بإعداد المخزن المؤقت للتليس. في غطاء الدخان بعناية إضافة 0.25 ميكرولتر من محلول DIFP 0.5 M بالإضافة إلى 0.25 ميكرولتر من 1 ملغم /مل microcystin-LR إلى المخزن المؤقت اللي 0.25 مل. تخلط وتترك على الجليد حتى الاستخدام.
    ملاحظة: إضافة DIFP إلى المخزن المؤقت حل ضمن 15 دقيقة من حل الخلايا، لأن DIFP غير مستقر نسبياً في حل مائي.
  11. مباشرة بعد الطرد المركزي، بعناية وتماما إزالة جميع supernatant مع ماصة دون إزعاج بيليه العدلات ووضع الأنابيب على الجليد.
  12. إضافة على الفور 100 ميكرولتر من العازلة الليليس التي تحتوي على DIFP وmicrocystine-LR إلى كل أنبوب. باستخدام ماصة 100-200 ميكرولتر، قم بإعادة تعليق كريات الخلية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا حوالي 5-10x.
  13. ليس الخلايا على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  14. أنابيب الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة حطام الخلايا.
  15. نقل "DMSO" و "MLi-2" supernatants التي تحتوي على العدلات يلسات في أنابيب الطرد المركزي الجديدة. تخلص من بيليه الحطام.
    ملاحظة: الليسات العدلة جاهزة الآن للاستخدام أو يمكن أن تكون المفاجئة المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية للتحليل في المستقبل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح فحصنا باستجواب تفعيل الكيناس LRRK2 المرتبط بـ PD في العدلات الدموية الطرفية البشرية مع الفوسفور Rab10 المعتمد على LRRK2 كقراءة. العدلات هي متجانسة ووفيرة السكان خلايا الدم البيضاء الطرفية التي تعبر عن مستويات عالية من كل من البروتينات LRRK2 وRab10(الشكل 1). مجموعة الخلايا الأخرى الوحيدة بين الخلايا النووية الأحادية الدم المحيطية المتبقية (PBMCs) مع أعداد نسخ عالية من كلا البروتينات هي أحادية الخلايا ، ولكن هذه تشكل فقط 2-12 ٪ من خلايا الدم البيضاء. وهذا يشير إلى أن العدلات الدم المحيطية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير الأدلة السريرية والوراثية والبيوكيميائية المقنعة إلى دور مهم لـ LRRK2 وخاصة وظيفتها في kinase في مرض باركنسون7. وقد وضعت مثبطات كيناز LRRK2 وتدخل التجارب السريرية2,,4,,12. على هذا النحو هناك حاجة لاستغلال LRRK2 كعلامة بيولوجية للمشاركة المستهدفة وكذلك الطبقية المرضى. لدينا بروتوكول يصف فحص قوية وسهلة لتحليل LRRK2 كيناز مسار تفعيل كما ينعكس من الفوسفور من الركيزة الفسيولوجية Rab10 في تجمع متجانسة من ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر المتطوعين الأصحاء الذين تكرموا بالتبرع بالدم لهذه الدراسة. نشكر مؤسسة مايكل ج. فوكس لأبحاث باركنسون (MJFF) وقيادة دراسة فوكس بيوتنت (FBN) على دعمهما ومدخلاتهما نحو البروتوكول المكتوب والفيديو. ونشكر البروفيسور ألكسندر زيمبريتش من جامعة فيينا في النمسا على اختبار بروتوكولنا وتعاوننا. نحن نقدر مساهمات بول ديفيز في المشروع (المدير العام لـ MRC PPU). ونحن ندرك أيضا الدعم التقني الممتاز من MRC البروتين الفوسفور ووحدة ubiquitylation (PPU) وهي التركيب الكيميائي (ناتاليا Shpiro لتجميع MLi-2)، MRC PPU الكواشف والخدمات فرق تنقية الأجسام المضادة (منسقة من قبل هيلاري ماكلوشلان وجيمس هاستي). نشكر مهيري تاولر وفريزر مردوخ من Vivomotion لمساعدتهما في صناعة مقاطع الفيديو والرسوم المتحركة. نشكر ستيف سواف من 81 فيلما للمساعدة في التحرير النهائي. يتم دعم استير ساملر من قبل الزمالة الأكاديمية السريرية العليا الاسكتلندية وتلقت التمويل من باركنسون في المملكة المتحدة (K-1706).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل أطراف ماصةSarstedt70.762أو ما يعادلها
1.5 مل أنابيب صغيرةSarstedt72.690.001أو ما يعادلها
10 مل أطراف ماصة Sarstedt86.1254.025 أو ما يعادلها
10 و مو ؛ L أطراف الماصةSarstedt70.113أو ما يعادلها
15 مل أنبوب الصقر Cellstar188 271أو ما يعادلها
200 & mu ؛ L أطراف الماصةSarstedt70.760.002أو ما يعادلها
25 مل من أطراف الماصة Sarstedt86.1685.001أو ما يعادل
50 مل أنبوب الصقر   ؛Cellstar227 261أو ما يعادله
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA TubeBD & nbsp ؛BD 367525أو ما يعادلها
من جهاز الطرد المركزي Beckman Coulter Allegra X-15RBeckmanأو جهاز طرد مركزي مكافئ مع دوار دلو السباحة لأنابيب الصقر سعة 15 مل و 50 مل بسرعة 1000-1200 × جم
خزانة السلامة البيولوجية من الفئة 2.
كوكتيل مثبط البروتياز (خالي من EDTA)Roche11836170001
DIFP (ثنائي الأيزوبروبيل فلورو فوسفات)   ؛SigmaD0879تحضير محلول مخزون 0.5M في الأيزوبروبانول باستخدام احتياطات خاصة   ؛
ثنائي ميثيل سلفوكسيد   ؛سيجما6250
الثلج الجاف أو النيتروجين
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ThermoFisher14190094أو ما يعادله
Easy 50 EasySep Magnet  خلية جذعية18002لعقد أنبوب مخروطي 1 × 50 مل
EasySep طقم عزل العدلات البشرية المباشرة   ؛خلية جذعية19666يحتوي هذا على حلول تسمى " كوكتيل عزلة" و " الخرز المغناطيسي RapidSpheres
EGTASigmaE3889
جهاز الطرد المركزي Eppendorf 5417R جهاز الطرد المركزيEppendorf
Ethanol ، في زجاجة
حمض الإيثيلين ديامين tetraacetic   ؛سيجماE6758
آيس
إيزوبروبانول (درجة لامائية)  سيجما278475
عازلة التحلل (50 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 1٪ (حجم / حجم) Triton X-100 ، 1 ملي مولار EGTA ، 1 ملي Na3VO4 ، 50 ملي NaF ، 10 ملي بيتا ؛ جليسيروفوسفات ، 5 ملي مولار بيروفوسفات الصوديوم ، 0.27 م سكروز ، 0.1٪ (حجم / حجم) بيتا ميركابتو إيثانول ، 1x كوكتيل مثبط البروتياز (روش) (روش) ، 1 مو ؛ جم / مل ميكروسيستين-LR ، 0.5 ملي مولار ثنائي الأيزوبروبيل فلوروفوسفات (DIFP). بدلا من ذلك ، المخزن المؤقت للتحلل المجمد في الحصص التي لا تحتوي على Microcystin-LR ، يتوفر DIFP من كواشف MRC-PPU (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) مثبط
Merck LRRK2 II (MLi-2)Merck438194-10MGأو ما يعادله (inhinitor LRRK2 قوي وانتقائي)
Microcystin-LREnzo Life SciencesALX-350-012-M001مخزون 1 مجم / مل في DMSO وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
Na3VO4Aldrich450243
NaFSigmaS7920
Odyssey CLx مسح نظام التصوير Western BlotOdyssey
قلم
معدات
RPMI 1640 متوسط ThermoFisher21875034أو ما يعادله
بيروفوسفات الصوديومSigmaS22
السكروزSigmaS0389
& beta ; -glycerophosphateSigma50020
& beta ; -mercaptoethanolSigmaM3148
الأجسام المضادة المقترحة للنشاف الغربي < / قوي>
الأجسام المضادة المضادة ل RAB10 (phospho T73) [MJF-R21]abcamab230261
إشارات الخلاياالمضادة لألفا5174المستخدمة في 1: 2000 تخفيف
الماعز المضاد للفأر IRDye 680LTLI-COR926-68020يستخدم عند 1: 10،000 تخفيف
الماعز المضاد للفأر IRDye 800CWLI-COR926-32210يستخدم عند تخفيف 1: 10،000
الماعز المضاد للأرانب IRDye 800CWLI-COR926-32211المستخدم في 1: 10،000 تخفيف
MJFF-total Rab10 الجسم المضاد للفأرالذي تم إنشاؤه بواسطة nanoTools (nanotools.de)غير قابل للتطبيق *يستخدم في 2 & mu ؛ جم / مل التركيز النهائي ؛ * سيتم تسويق الجسم المضاد MJFF-total Rab10 الناتج عن nanoTools (www.nanotools.de) [11] من قبل مؤسسة مايكل جيه فوكس في عام 2018
الأجسامالمضادة للجسم المضادعام 2018 75-253تستخدم في 1 & mu ؛ جم / مل التركيز النهائي
pS935-LRRK2MRC PPU الكواشف والخدماتUDD2المستخدمة في 1 & mu ؛ جم / مل التركيز النهائي
السائلرذاذتحديد دائمالحماية الشخصيةتقنيات للجباب C المضادة للجوار LRRK2 في

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
  2. Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
  3. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
  4. Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
  5. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
  6. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
  7. Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
  8. Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
  9. Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
  10. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
  11. Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
  12. Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
  13. Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
  14. Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
  15. Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
  16. Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
  17. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  18. Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
  19. Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32(2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DIFP MLi 2 Rab10 Thr73

مقالات ذات صلة