مقالة منهجية

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

DOI:

10.3791/59021

⸱

يناير 30, 2019

 ,  , 
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكولات مفصلة لكلا أسيليشن في المختبر وفي خلايا انتقائية 2-هيدروكسيل تحليلها بواسطة التمهيدي ملحق (الشكل) تجارب لتحديد هيكل تسلسل قبل مرناً لمصلحة حضور جزيء صغير استهداف الجيش الملكي النيبالي الثانوية المعروضة في هذه المقالة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عملية تطوير العقاقير للجزيئات الصغيرة التي تستهدف الجيش الملكي النيبالي، توضيح التغييرات الهيكلية على تفاعلها مع تسلسل الحمض النووي الريبي الهدف هو المطلوب. نحن نقدم هذه الوثيقة التفصيل في المختبر وانتقائية في الخلية 2-هيدروكسيل أسيلاتيون تحليلها من قبل تمديد التمهيدي البروتوكول (الشكل) لدراسة التغير الهيكلي حضور دواء تجريبي لضمور العضلات الشوكي (SMA)، البقاء على قيد الحياة من الجيش الملكي النيبالي الخلايا العصبية الحركية (العليا)-C2, وفي إكسون 7 من قبل-مرناً الجينات SMN2. في الشكل في المختبر، وهو تسلسل الحمض النووي الريبي من 140 النيوكليوتيدات التي تحتوي على SMN2 إكسون 7 نسخها من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 ومطوية بحضور الجالي-C2 وتعديله فيما بعد بكاشف أسيليشن خفيف 2 '--أوه، إيميدازوليدي حمض 2-ميثيلنيكوتينيك (ناي). هذا adduct 2 '--يا ناي هو كذلك سبر طريق 32تمديد التمهيدي المسمى ف وحلها بالتفريد جل polyacrylamide (صفحة). على العكس من ذلك، أسيليشن 2 '-OH في الشكل في الخلية يأخذ مكان في الموقع مع الجالي-C2 ملزمة الخلوية الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية. ثم اتسع نطاق تسلسل مرناً قبل إكسون 7 في الجينات SMN2، جنبا إلى جنب مع الطفرات المستحثة بالشكل في تمديد التمهيدي، بكر ويخضع لتسلسل الجيل القادم. المقارنة بين المنهجيتين، الشكل في المختبر هو وسيلة أكثر فعالية من حيث تكلفة ولا تتطلب الطاقة الحسابية لتصور النتائج. ومع ذلك، الطراز المستمدة من شكل الجيش الملكي النيبالي في المختبر أحياناً ينحرف عن هيكل الثانوي في سياق خلوية، يرجح أن سبب فقدان جميع التفاعلات مع الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات. الشكل في الخلية لا تحتاج إلى مكان مواد مشعة وغلة بنية الحمض النووي الريبي ثانوي أكثر دقة في سياق الخلوية. وعلاوة على ذلك، الشكل في الخلية المطبقة عادة لتسلسل مجموعة من الجيش الملكي النيبالي أكبر (~ 1,000 النيوكليوتيدات) باستخدام تسلسل الجيل القادم، مقارنة في المختبر الشكل (~ 200 النيوكليوتيدات) التي عادة ما تعتمد على تحليل صفحة. في حالة المستمدة من إكسون 7 في SMN2 قبل-مرناً، الشكل في المختبر وفي خلايا الحمض النووي الريبي النماذج مشابهة لبعضها البعض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أسيليشن انتقائية 2-هيدروكسيل تحليلها بواسطة الملحق التمهيدي (الشكل) أسلوب لقياس الحركية من كل النوكليوتيدات في تسلسل الحمض النووي الريبي للفائدة وتوضيح هيكل الثانوية في قرار واحد-النوكليوتيدات1. المنهجيات الشكل، سواء في الظروف المختبرية2،3،4 (تنقية الحمض النووي الريبي في نظام المخزن مؤقت معرفة) وفي خلايا الثدييات الحية5،6، وقد وضعت للتحقيق الثانوي هيكل تسلسل متوسط طول الحمض النووي الريبي (عادة < النيوكليوتيدات 1,000 للشكل في الخلية و < النيوكليوتيدات 200 للشكل الأنبوبي). أنها مفيدة بشكل خاص لتق....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-في المختبر الشكل

ملاحظة: يتم تعديل البروتوكول من البروتوكول المنشورة1.

  1. إعداد قالب الحمض النووي الريبي
    ملاحظة: وأمرت القالب للنسخ T7 اصطناعية مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA) وتضخيمه بالإدراج أما إلى متجه كولاي التي يحمل زوج فريدة من مواقع endonuclease تقييد اكوري/بامهي، مثل pET28a، أو بواسطة PCR. ويتضح في البروتوكول للتضخيم PCR أدناه.
    1. خلط المواد التالية: 50 ميكروليتر من سيد بكر مزيج (انظر الجدول للمواد)، 2 ميكروليتر لكل التمهيدي في 10 ميكرومترات (انظر الجدول 1 لتسلسل)، 200 نانوغرام قالب....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرنا سابقا أن الجيش الملكي النيبالي الربط المغير، الجالي-C2، يتفاعل مع فكرة أجاج على إكسون 7 من قبل-مرناً مورث SMN2، ويستخدم الشكل لتقييم التغيرات الهيكلية الحمض النووي الريبي حضور C2 الجالي6. موقع الربط الجالي-C2 يختلف عن وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير العقاقير اليغنوكليوتيد (ASO) للإدارة البحرية السويدية، نوسينيرسين، الذي يربط وكتل كاتم الصوت الربط إينترونيك (ISS) إنترون 727،28 (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الشكل في المختبر، من الضروري استخدام قالب الحمض النووي الريبي متجانسة ذات جودة عالية. ومع ذلك، غلة T7 النسخ، غالباً ما تسلسل غير متجانسة36. وبخاصة، تسلسل مع النوكليوتيدات ± 1 في 3 '-المحطة مع عائدات لا يستهان بها36 عادة من الصعب إزالتها بتنقية جل polyacrylamide. قالب الحمض النووي الريبي غير المتجانسة يمكن أن ينتج أكثر من مجموعة واحدة من الإشارات في جل تسلسل تحديد سمات المنتج تمديد التمهيدي، مما يجعل من الصعب تفسير النتيجة في بعض الأحيان. رايبوزيم في كلا 5 '--وسوف تجعل 3'.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسنى هذا العمل بالمنحة R01 المعاهد الوطنية للصحة (NS094721، K.A.J.).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الحمض النووي قليل النوكليوتيدIDTgBlock لتخليق الحمض النووي >200 نقطة أساس
Phusion Green Hot Start II عالي الدقة PCR Master MixThermo FisherF566S
NucleoSpin gel ومجموعة تنظيف PCRTakara740609.50
MegaScript T7طقم نسخ Thermo FisherAM1333يحتوي على عازلة تفاعل 10x ، إنزيم T7 ، NTP و Turbo DNase
المياه المعالجة DEPCThermo Fisher750023
2x TBE-Urea عينة عازلةThermo FisherLC6876
محلول أكريلاميد / ثنائي الساكريلاميد 40٪ (29: 1)Bio-Rad1610146
10x TBE عازلةThermo Fisher15581044
Nalgene Rapid-Flow & Trade ؛ وحدة الفلترThermo Fisher166-0045
KimwipeKimberly-Clark34133
TEMEDThermo Fisher17919
صبغة SYBR-SafeThermo FisherS33102
6٪ TBE-urea ميني هلامثيرمو فيشرEC6865BOX
ChemiDocBio-Rad
T4 PNKNEBM0201S
γ-32P-ATPPerkin ElmerNEG035C005MC
Hyperscreen™ تكثيف الشاشةGE HealthcareRPN1669الكالسيوم التنجستات شاشة الفوسفور
تخزين الفوسفورالديناميكا الجزيئيةBAS-IP MS 3543 E
Amersham TyphoonGE Healthcare
NAI (2M)EMD Millipore03-310
GlycoBlueThermo FisherAM9515
SuperScript IV Reverse يحتوي 18090010 TranscriptaseThermo Fisherعلى 5x RT buffer ، مزيج SuperScript IV
dNTP (10 ملم) مجموعةThermo FisherR0192
ddNTP (5 ملم)SigmaGE27-2045-01
ورق ترشيح كبيرWhatman1001-917
مجففHoeferGD 2000
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104يحتوي أيضا على RNase A والبروتياز K
SMN2 minigene34< / sup>Addgene72287
معطل الحرارةFBS ThermoFisher 10438026
Pen-StrepThermo Fisher15140122
Opti-MEM IThermo Fisher31985062
FuGene HDPromegaE2311
TrpLEThermo Fisher12605010
DPBS بدون Ca / MgThermo Fisher14190250
TRIzolThermo Fisher15596018
RNeasy العمود الصغيرQiagen74104يحتوي أيضا على RW1 ، مخزن RPE
الخالي من RNase مجموعة DNaseQiagen79254يحتوي على DNase I و RDD العازلة
فورماميدمنزوع الأيوناتثيرمو فيشرAM9342
MnCl 2 < / sub > & bull ؛ 4H2< / sub>OSigma-AldrichM3634
nonamer العشوائيSigma-AldrichR7647
SuperScript نظام توليف الخيط الأولThermo Fisher11904-018يحتوي على 10x RT buffer ، SuperScript II النسخ العكسي
AccuPrime pfx DNA polymerseThermo Fisher12344024
NextSeq500Illumina
NucAway العمودThermo FisherAM10070لغرض تحلية
شاشة جل المياه

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SHAPE 7 SMN2 NAI

مقالات ذات صلة