مقالة منهجية

تحليل معدل استهلاك الأكسجين في Cardiomyocytes الولدان الماوس مثقف الأساسي محلل تدفق خارج الخلية باستخدام

8.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59052

⸱

فبراير 13, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Pharmacology, University of California San Diego, 3Cardiology Section, Department of Medicine, Veterans Administration Healthcare, San Diego

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذا البروتوكول لتوضيح كيفية استخدام الماوس cardiomyocytes حديثي الولادة كنظام نموذجي لفحص عوامل مختلفة كيف يمكن أن يغير استهلاك الأكسجين في القلب.

الملخص

الميتوكوندريا والايض الأكسدة حاسمة للحفاظ على وظيفة عضلة القلب. وقد أظهرت الأبحاث أن خلل mitochondrial عاملاً هاما في مساهمة لضعف وظيفة القلب في القلب. على النقيض من ذلك، استعادة الوظيفة المتقدرية المعيبة قد آثار مفيدة لتحسين وظيفة القلب في قلب الفشل. ولذلك، يمكن أن توفر دراسة الآليات التنظيمية وتحديد المنظمين رواية للوظيفة المتقدرية البصيرة التي يمكن استخدامها لوضع أهداف علاجية جديدة لعلاج أمراض القلب. هنا، يتم تحليل التنفس المتقدرية ميوسيتي القلب باستخدام نظام ثقافة خلية فريدة من نوعها. أولاً، تم وضع بروتوكول الأمثل لسرعة عزل والثقافة العالية الجدوى الماوس الولدان كارديوميوسيتيس. ثم يتم استخدام محلل الجريان خارج الخلية تنسيق 96-جيدا لتقييم معدل استهلاك الأكسجين من هذه كارديوميوسيتيس. لهذا البروتوكول، نحن الأمثل البذر الظروف وأثبت يمكن تقييم أن معدل استهلاك الأكسجين cardiomyocytes الماوس الأطفال حديثي الولادة بسهولة في محلل الجريان خارج الخلية. وأخيراً، نلاحظ أن لدينا بروتوكول يمكن تطبيقها على حجم أكبر لثقافة والدراسات الأخرى، مثل الإشارات داخل الخلايا وتقلص وظيفة التحليل.

المقدمة

للحفاظ على وظيفة الهوس القلب مستمر، كارديوميوسيتيس يجب الحفاظ على إمدادات ثابتة من الطاقة الخلوية أساسا في شكل ATP1. في القلب، وتولد حوالي 95% ATP الميتوكوندريا، أساسا من خلال الفسفرة، تبين أن الميتوكوندريا دوراً حاسما الطاقة البيولوجية في وظيفة القلب2،3. دعم هذا المفهوم أن التقلبات وظيفة المتقدرية يمكن أن يؤدي إلى اعتلال عضلة القلب وفشل القلب4،5. على العكس من ذلك، ثبت استعادة الوظيفة المتقدرية لتحسين وظيفة القلب للفشل القلب6،7. ولذلك، دراسة إليه الاستقلاب mitochondrial وتحديد المنظمين رواية للوظيفة المتقدرية في cardiomyocytes لن تكشف فقط عن رؤى الميكانيكية لإنتاج الطاقة القلب ولكن يمكن أن توفر أيضا فكرة أن تؤدي لوضع أهداف علاجية جديدة لعلاج أمراض القلب6،8.

مقارنة بقلب كله، الذي يحتوي على خليط من ميوسيتيس وغير ميوسيتيس9، كارديوميوسيتي الثقافات الغاية الصرفة، مع الحد الأدنى من التلوث من غير ميوسيتيس من القلب، مثل الخلايا الليفية، وخلايا بطانية10. وباﻹضافة إلى ذلك، عزل كارديوميوسيتيس من المواليد الجراء يمكن استزراع عدد كبير من الخلايا في كمية صغيرة من الوقت، مقارنة بعزل الخلايا من قلوب الكبار10،11. الأهم من ذلك، cardiomyocytes الماوس الكبار مثقف الأساسي البقاء قصيرة الأوقات (مثلاً 24 ساعة) وفي وقت أطول النقاط دي تفرق. كارديوميوسيتيس الماوس حديثي الولادة يمكن البقاء على قيد الحياة والتلاعب بها لما يزيد عن 7 أيام في الثقافة، ويجعلها مثالية لاختبار آثار مركبات العقاقير والتلاعب بالجينات في الوظيفة الميتوكوندريا في cardiomyocytes10. وبطبيعة الحال، هناك اختلافات بيولوجية كبيرة بين خلايا البالغين والأطفال حديثي الولادة، ولكن مدة أطول متاح لثقافة خلايا الولدان يجعلها ملائمة لأنواع مختلفة من الدراسات، بما في ذلك وظيفة الميتوكوندريا.

وحتى الآن، استخدمت الأولية كارديوميوسيتيس الماوس وفار الولدان مثقف كنماذج لدراسة الاستقلاب القلب12،13. في السنوات الأخيرة، استخدمت الدراسات محلل تدفق خارج الخلية لقياس معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) وتقييم قدرة الأكسدة في الماوس وفار كارديوميوسيتيس حديثي الولادة14،15. بينما بالمقارنة مع الفئران، بقاء الخلية الماوس كارديوميوسيتيس حديثي الولادة أقل وزيادة تقلب16. القدرة على دراسة الخلايا من نماذج الماوس المهندسة وراثيا أيضا، يجعل نموذج الخلية الماوس هام جداً. نظراً لأن الدراسات التعرف الضوئي على الحروف حساسة جداً للخلية عدد وكثافة البذر، ثمة حاجة إلى تطوير بروتوكول استنساخه وموثوق بها، وبسيطة لتحقيق العائد خلية يتمشى وقدرتها على البقاء.

هنا، نحن تقرير بروتوكولا أمثل الذي تم تطويره الذي يستخدم الماوس مثقف cardiomyocytes الولدان جنبا إلى جنب مع محلل 96-جيدا-تنسيق الخلية التمويه تحليل التعرف الضوئي على الحروف. هذا البروتوكول يزيد كثيرا من إمكانية تكرار نتائج للمقايسة. وباﻹضافة إلى ذلك، البروتوكول يقدم الرواية والأسلوب استنساخه لتحليل التعرف الضوئي على الحروف، بل أيضا يمكن أن تتكيف مع ثقافة حجم أكبر لأغراض تجريبية أخرى، مثل تلك التي قد تكون بحاجة إلى دراسة وظائف ميوفيبريلار وداخل الخلايا مما يشير إلى الممرات.

على وجه الخصوص، وصف هذا البروتوكول إجراء يوم واحد للعزلة وثقافة cardiomyocytes الولدان الماوس في لوحة ثقافة خلية 96-جيدا. وباﻹضافة إلى ذلك، فهو يصف الإجراء لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام محلل الجريان خارج الخلية. جميع الحلول المستخدمة عقيمة أو تصفيتها العقيمة. يتم تعقيم جميع الأدوات من الإيثانول 75%. نحن نقدم الجدول للمواد لأجزاء مختلفة من الإجراءات. لاستزراع cardiomyocytes، يتم تنفيذ جميع الإجراءات والخطوات في غطاء ثقافة خلية قياسية. تم تطوير هذا البروتوكول لعزل قلوب الماوس الولدان من القمامة واحد (حوالي 8-10 الجراء). بيد البروتوكول يمكن تكييفها لعزل كارديوميوسيتيس من ليتر متعددة أيضا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

للعمل مع الفئران حديثي الولادة، يرجى يرجى الرجوع إلى المبادئ التوجيهية المحلية جامعة ومعهد الوارد ببرامج رعاية الحيوان والتمسك بأحد مؤسسية وأخرى الأنظمة المناسبة. وافق عليها "جامعة كاليفورنيا سان دييغو رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) جميع الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول والتقيد باللوائح الاتحادية والولائية.

1-إعداد الكواشف

  1. إعداد 25 مل من محلول قبل الهضم: حبس (دون Ca2 + و Mg2 +) تستكمل مع التربسين (0.5 ملغ/مل). تعقيم الحل باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام. جعل الحل الهضم قبل يوم من التجربة.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان استخدام حبس دون Ca2 + و Mg2 +, ك Ca2 + و Mg2 + سوف يسبب انكماش ميوسيتي وموت الخلايا اللاحقة أثناء العزلة.
  2. إعداد 30 مل كولاجيناز الهضمالمخزن المؤقت: كولاجيناز (0.8 mg/mL، حوالي 350 يو/مليلتر) حلت في المخزن المؤقت لحبس (دون Ca2 + و Mg2 +). تعقيم الحل باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام. جعل الحل الهضم كولاجيناز اليوم للتجربة.
  3. إعداد 500 مل كارديوميوسيتي ثقافةالوسائط (وسائط النمو): مزيج 375 مل دميم، 125 مل من M-199، 25 مل من مصل الحصان، و 12.5 مل من FBS. الملحق مع البنسلين 1% ومحلول ستربتوميسين 1%.
  4. إعداد اختبار الإجهاد المتقدرية المتوسطة: جعل 200 مل من دميم على أساس متوسط اختبار الإجهاد (دميم دون NaHCO3، انظر الجدول للمواد) تستكمل مع بيروفات صوديوم 1 مم، 2 ل الجلوتامين، والجلوكوز 10 ملم، و 2 ملم هيبيس.
    ملاحظة: قم 1 لتر متوسطة مع دميم دون بيروفات صوديوم ولام الجلوتامين والسكر وحبيس، المدون العقيمة، وتخزينها في 4 درجات مئوية. إعداد وسيلة اختبار الإجهاد في اليوم للفحص عن طريق إضافة الكواشف الأخرى. استخدام دميم المتوسطة دون ناكو3 أمر بالغ الأهمية.
  5. ضبط الأس الهيدروجيني لاختبار الإجهاد المتقدرية وسائل الإعلام إلى 7.4 في يوم الاستخدام. وسائط الحارة إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  6. إعداد أوليجوميسين: إعداد 5 مل حل الأسهم 5 ملم في [دمس] وجعل 250 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  7. إعداد فككب: إعداد 5 مل حل الأسهم 5 ملم في [دمس] وجعل 250 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  8. إعداد أنتيميسين A: إعداد 5 مل حل الأسهم 5 ملم في [دمس] وجعل 250 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  9. إعداد والروتينون: إعداد 5 مل حل الأسهم 5 ملم في [دمس] وجعل 250 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم سرد كافة الكواشف والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1.

2. الحصاد والهضم قبل القلوب من الفئران حديثي الولادة (اليوم الأول)

  1. اﻷوتوكﻻف المقص والملقط ملعقة موريا لتعقيم.
  2. تنفيذ كافة الخطوات في هود ثقافة الخلية للعقم.
  3. الكوة 5 مل من حبس (دون Ca2 +, Mg2 +) لكل بئر من صفيحة ثقافة الخلية 6-جيدا؛ ضع على الجليد. الكوة 10 مل من حبس في طبق ثقافة خلية 10 سم.
  4. إعداد 20 مل من التربسين هضم قبل الحل في أنبوب 50 مل مخروطية عقيمة. تبقى جميع الحلول على الجليد.
  5. وتراجع بسرعة الفئران حديثي الولادة (يوم 0) في الحل الإيثانول 70% للتعقيم.
  6. قطع رأس الجراء استخدام مقص معقم (مباشرة) دون تخدير، ثم قم بفتح الصدر على طول القص للسماح بالوصول إلى تجويف الصدر والقلب. (الشكل 1A)
    ملاحظة: 1) من الأهمية بمكان استخدام P0 الفئران حديثي الولادة لتحقيق استمرارية ارتفاع الخلية. 2) هذا أسلوب القتل الرحيم مسموح لحديثي الولادة وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة والجمعية الطبية البيطرية الأمريكية 17.
  7. استخراج قلوب من الجسم مع مقص غرامة ونقل فورا إلى الطبق الثقافة العقيمة خلية تحتوي على حبس (دون Ca2 +, Mg2 +) (الشكل 1B).
  8. إزالة أي أنسجة الرئة المتبقية، والسفن الأكبر حجماً، إلخ (والاذينين، إذا رغبت في ذلك). غسل القلوب في حبس الحل باستخدام التحريض لطيف.
  9. مقطعة 8 قطع كل قلب مع مقصات غرامة ونقل جميع أنسجة القلب بالملقط في بئر واحدة من صفيحة ثقافة الخلية 6-جيدا مع حبس (الشكل 1 و د 1).
  10. أغسل القلوب بنقل القلوب من بئر في لوحة 6-بئر مليئة بحبس، باستخدام ملعقة موريا (الشكل 1).
    ملاحظة: نقل القلوب من بئر بما فيه الكفاية لتغسل الدم. منذ الدم يتداخل مع الهضم الأنزيمي من المهم أن تغسل القلوب مع حبس وإزالة الدم.
  11. نقل القلوب مع ملعقة موريا في أنبوب مخروطي الشكل يحتوي على 20 مل التربسين (0.5 ملغ/مل) واحتضان مع الانفعالات لطيف في 4 درجات مئوية عن ح 4 (الشكل 1E).

3-إعداد لوحة ثقافة 96-جيدا (1 يوم)

  1. إعداد 5 مل من محلول طلاء: برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5% الجيلاتين (اﻷوتوكﻻف قبل الاستخدام) والحل فيبرونيكتين 1%. (مثل حل الجيلاتين مل 5 زائد 50 ميليلتر من حل فيبرونيكتين)
  2. الكوة ميليلتر 50 طلاء الحل إلى كل من لوحة الثقافة خلية 96-جيدا جيدا (انظر الجدول للمواد). في حالة وجود فقاعات إزالتها باستخدام ماصة 20 ميليلتر لامتصاص فقاعات بها.
    ملاحظة: من المهم أن تغطي كل المساحة السطحية لكل بئر بمحلول طلاء.
  3. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية خلية ثقافة حاضنة ح 1 أو أكثر للسماح لتجفيف طلاء المصفوفة.
  4. نضح أي حل الطلاء المتبقية قبل البذر كارديوميوسيتيس.

4-الانزيمية الهضم والطلاء من الخلايا (1 يوم)

  1. قبل الحارة كولاجيناز الهضم الحل في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: هذا هو خطوة هامة لتحقيق كفاءة الهضم الأنزيمي.
  2. تحريك الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على قلوب والحل قبل الهضم من 4 درجة مئوية إلى غطاء ثقافة خلية. (الشكل 1F)
  3. اسمحوا القلوب تنزل إلى أسفل الأنبوب وإزالة الحل قبل الهضم باستخدام ماصة مصلية 10 مل من (1 إلى 2 مل الوسط العزلة قد تبقى في الأنبوب).
  4. أضف 10 مل حبس في الأنبوب. إعادة تعليق القلوب مع حبس 2-3 مرات تغسل التربسين استخدام ماصة مصلية من 10 مل. نضح حبس (1 إلى 2 مل قد تبقى في الأنبوب).
  5. أضف 10 مل من محلول الهضم كولاجيناز المعالجون مسبقاً في الأنبوب مع القلوب. (الشكل 1)
  6. احتضان الأنبوب بقلوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق دون الانفعالات (1st الهضم).
  7. بعد الهضم الأولى، نقل الأنبوب إلى هود ثقافة الخلية. بلطف تريتوراتي القلوب بإعادة تعليق القلوب داخل الأنبوب بلطف 10 مرات باستخدام ماصة مصلية من 10 مل. سيسمح هذا خلايا أن يفرج عنها من أنسجة القلب والقلوب لتفريق. (الشكل 1 ح)
    ملاحظة: منذ cardiomyocytes هشة، المهم تريتوريشن لطيف لتحقيق جدوى عالية.
  8. واسمحوا الأنسجة عسر الهضم بالوعة ونقل الحل هضمها أثري في cardiomyocytes (حوالي 9-10 مل) إلى أنبوب مخروطي الشكل جديد وإضافة مبلغ مساو من خلية ثقافة وسائل الإعلام لوقف عملية الهضم كولاجيناز فورا.
  9. أضف 10 مل من محلول الهضم كولاجيناز في أنبوب يحتوي على أنسجة القلب عسر الهضم المتبقية.
  10. احتضان الأنبوب مع أنسجة القلب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (2nd الهضم).
  11. كرر الإجراء 4.7 و 4.8.
    ملاحظة: إذا كان هناك عسر الهضم لا يزال كثير من الأنسجة، كرر الهضم واحد مزيد من الوقت. ومع ذلك، في معظم الحالات، ديجيسشنز اثنين ما يكفي لتفريق معظم الخلايا من أنسجة القلب.
  12. ضع عقيمة خلية-مصفاة (100 ميكرومتر النايلون مش) في أنبوب مخروطي عقيمة 50 مل جديدة. قبل الرطب مصفاة الخلية مع 2-3 مل من خلية ثقافة الإعلام وتمرير الخلايا من خلال الخلية-المصفاة. شطف الخلية المصفاة مع 2-3 مل من خلية ثقافة وسائل الإعلام. (1I الشكل)
  13. الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على كارديوميوسيتيس لمدة 5 دقائق في 180 x ز (1J الشكل). نضح المادة طافية (الشكل 1 K)، التي سوف تحتوي على خلايا الأنسجة الحطام وإعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من خلية ثقافة وسائل الإعلام (الشكل 1 لتر).
  14. بلطف ريسوسبيند الخلايا والخلايا طبق على طبق ثقافة خلية 10 سم (البلاستيك دون أي نوع من الطلاء) واحتضانها ح 1 في حاضنة ثقافة خلية (الطلاء قبل الأولى) (الشكل 1 م). تسمح هذه الخطوة ما قبل الطلاء غير cardiomyocytes، مثل الخلايا الليفية، وخلايا بطانية، على التمسك بالطبق ثقافة الخلية غير المصقول.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، كارديوميوسيتيس عادة شكل دائري وتظهر لامعة تحت المجهر. (الرقم 1N).
  15. بعد الاحتضان ح 1، بلطف تحرض اللوحة وغسل الخلايا غير ملتصقة (التخصيب في cardiomyocytes) من طبق الثقافة 10 سم، وإعادة تعليق الخلايا بها مرارا وتكرارا بيبيتينج مستنبت الخلية على الطبق باستخدام ماصة مصلية من 10 مل. بعد ذلك، نقل الخلايا غير ملتصقة (التخصيب في cardiomyocytes) إلى 10 سم خلية ثقافة جديدة طبق (البلاستيك دون أي طلاء) واحتضانها ح 1 إضافية في حاضنة ثقافة خلية (الطلاء قبل الثانية).
    ملاحظة: الخلايا التي تعلقها على اللوحة غير المغلفة المهيمن غير كارديوميوسيتيس: الخلايا الليفية، وخلايا بطانية، التي يمكن تصور تحت مجهر (1O الشكل).
  16. بعد الطلاء قبل الثانية, بلطف تحرض اللوحة، تغسل الخلايا غير ملتصقة (كارديوميوسيتيس) من طبق الثقافة 10 سم، ثم نقل كارديوميوسيتيس في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد.

5-عد الخلايا والخلايا والطلاء في لوحة ثقافة خلية 96-جيدا (1 يوم)

  1. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
  2. لوحة الخلايا في صفيحة مصفوفة خارج الخلية مغلفة ثقافة خلية 96-جيدا في كثافة بين 10 – 30 x3 10 خلايا/البئر باستخدام ماصة متعدد القنوات بحجم نهائي في 200 ميليلتر (الشكل 1 ف). استخدام الآبار A1 A12، H1 و H12 للخلفية: إضافة 200 ميليلتر من مستنبت آبار أخرى في هذه الآبار (لا الخلايا). احتضان اللوحة في حاضنة ثقافة خلية 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم اختبار استهلاك الأوكسجين باستخدام كثافات مختلفة الخلية مثل310 × 10 أو 20 × 103أو 30 × 103 خلايا/جيدا. (الشكل 2A). أيضا، كما ذكر أعلاه، كارديوميوسيتيس فورا بعد عزلة عادة شكل دائري وتظهر لامعة تحت المجهر. خلايا قابلة للحياة سوف تتسطح بها ضمن ح 16-24 من الثقافة.

6-الأكسجين استهلاك الإنزيم استخدام "محلل الجريان خارج الخلية" 96-جيدا-تنسيق (2 يوم)

ملاحظة: تحليل استهلاك الأكسجين يمكن القيام بها يوم واحد بعد طلاء الخلايا أو في وقت لاحق. الوليد cardiomyocytes مثقف استخدام هذا البروتوكول يمكن البقاء على قيد الحياة مدة تصل إلى 7 أيام بعد عزلة.

  1. هيدرات خرطوشة استشعار محلل التمويه (انظر الجدول للمواد) لمدة 3 ساعات على الأقل، ولكن من الناحية المثالية لمدة يوم كامل، قبل المقايسة. إضافة 200 ميليلتر لحل كاليبرانت (انظر الجدول للمواد) في البئر كل من لوحة الأداة، وضع خرطوشة استشعار يعيدوه لوحة الأداة، واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية دون CO2 أو س2 مكملات.
  2. تغيير وسائط الثقافة الخلية إلى الميتوكوندريا اختبار الإجهاد متوسط ساعة واحدة قبل المقايسة. كارديوميوسيتيس هشة. ولذلك، بلطف قم بإزالة وسائط الثقافة الخلية باستخدام ماصة متعدد القنوات وغسل الخلايا مع 200 ميليلتر لوسائل الإعلام قبل حرارة اختبار الإجهاد المتقدرية مرتين. بعد غسل الثانية، إضافة 175 ميليلتر من الميتوكوندريا دافئة قبل اختبار الإجهاد وسائل الإعلام والثقافة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية دون CO2 أو س2 مكملات.
  3. إعداد اختبار تتركز المركبات. لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا، وإعداد مل 3.0 كل 16 ميكرون أوليجوميسين، 9 ميكرون فككب وخليط من 20 ميكرومتر والروتينون و 20 ميكرومتر أنتيميسين A، الجميع في اختبار الإجهاد المتقدرية المتوسطة.
    ملاحظة: تم اختبار كل مجمع في التركيز وصف. مع ذلك، من الضروري تركيز كل مجمع في مختبر واحد للمعايرة.
  4. تحميل 25 ميليلتر لكل مجمع في موانئ حاقن خرطوشة استشعار استخدام ماصة من الأقنية (1Q الشكل). ويرد في الجدول 2حجم وتركيز النهائي.
  5. قم بإعداد بروتوكول تحليل الجريان خارج الخلية. ويرد وصف البرنامج في الجدول 3-
  6. بدء تشغيل البرنامج. أولاً، وضع خرطوشة استشعار إلى الجهاز للمعايرة (1R الشكل). استبدال كاليبرانت للوحة المقايسة حالما يتم الخطوة المعايرة.
    ملاحظة: باستخدام البرمجيات التي توفرها الشركة المصنعة، تشير إلى مجموعات من الآبار وكل مجمع وميناء.
  7. إذا رغبت في ذلك، بعد الفحص، بعناية تجاهل جميع المقايسة المتوسطة باستخدام ماصة متعدد القنوات وتخزين الميكروسكوبية ثقافة الخلية في-20 درجة مئوية لتطبيع الخليوي مستقبلا باستخدام مقايسة البروتين.
  8. قياس محتوى البروتين. إضافة 50 ميليلتر من حل تحلل الخلية ريبا القياسية (انظر الجدول للمواد). احتضان لوحة على الجليد لمدة 30 دقيقة الكامل الخلايا. نقل جميع المواد إلى لوحة فحص جيدا واضحة مسطحة قاع 96 جديدة.
  9. قياس تركيز البروتين بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    ملاحظة: طلاء جيدا مع المصفوفة خارج الخلية يؤدي تركيز عالية من بروتين في كل بئر. ولذلك، طرح مقدار well(s) الخلفية (لا الخلايا) للحصول على تركيز البروتين الخلايا الفعلية. تركيز البروتينات المشتقة من الخلايا منخفض في لوحة ثقافة 96-جيدا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تختلف تركيز البروتين من بئر بسبب طلاء المصفوفة خارج الخلية. ولذلك، يقترح استخدام رقم الخلية لتطبيع OCR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام بروتوكول وصف، قلوب كانت معزولة من الجراء الولدان اليوم 0. وتم الحصول على 5 × 105 خلايا/ألجرو، وكانت تبذر cardiomyocytes كثافات من 10 × 103، 20 × 103أو 30 × 103 خلايا/حسنا، في لوحات جيدا 96 (الشكل 2A). بعد الثقافة بين عشية وضحاها، وعثر على كارديوميوسيتيس المرفقة جيدا على سطح البلاستيك المغلفة، وهناك عدد قليل جداً من الخلايا فاتحة (الخلايا فاتحة ستظهر لا يزال جولة ولامعة، مقارنة بخلايا صحية، المرفقة وسبريدوت)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة، وقد أنشأنا بروتوكول بسيط لعزل واستزراع الماوس cardiomyocytes حديثي الولادة. باستخدام هذه كارديوميوسيتيس، نحن أيضا الأمثل الظروف لقياس معدل استهلاك الأكسجين باستخدام نظام محلل الجريان خارج الخلية. البروتوكول يسمح لأحد استخدام الماوس كارديوميوسيتيس حديثي الولادة كنظام نموذجي لفحص عوامل مختلفة كيف يمكن أن يغير استهلاك الأوكسجين في الخلايا العامل الرئيسي للقلب، وأقرب إلى ما سوف يمكن قياسه في الجهاز سليمة. يختلف لدينا بروتوكول من البروتوكولات نشرت سابقا16،18...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

نود أن نشكر كل مختبر روس وأعضاء مختبر مورفي. هذا العمل معتمد من قبل "جمعية القلب الأمريكية" (14SDG17790005) للمعاهد الوطنية للصحة أ (HL115933، HL127806) وخامساً الجدارة (BX003260) إلى R.S.R.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Antimycin ASIGMAA8674يثبط المركب الثالث لمصفاة خلايا الميتوكوندريا
100 & mu ؛ م المسامFALCON352360لالتقاط الأنسجة غير المهضومة
الكولاجيناز النوع الثانيورثينجتونLS004176لصنع محلول هضم الكولاجيناز
D-GlucoseSIGMA75351لجعل اختبار الإجهاد الانقسامي متوسط
DMEM تقنيات حياة عالية الجلوكوزDMEM 11965-092لجعل وسط
زراعة الخلاياDMEM بدون NaHCO3< / sub> ، الجلوكوز ، البيروفات ، الجلومانين ، و HepesSIGMAD5030-10X1Lلصنع وسيط اختبار الإجهاد الانقسامي
FCCP (كاربونيل سيانيد 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون )SIGMAC2920يفكك تنفس الميتوكوندريا
مصل الأبقار الجنيني (FBS) تقنياتالحياة26140-079لجعل وسط زراعة الخلايا
فيبرونيكتين من بلازما البقرSIGMAF1141-5MGلصنع محلول طلاء لألواح زراعة الأنسجة
مقص ناعمأدوات العلوم الدقيقة14060-10لتشريح القلوب
الجيلاتين من جلد الخنازيرSIGMAG-1890لصنع محلول طلاء لألواح زراعة الأنسجة
HBSS (محلول الملح المتوازن من هانك ، بدون Ca2 + < / sup> ، Mg2 + < / sup>)Cellgro21-022-CVلغسل القلوب وعمل محلول هضم ما قبل الهضم والكولاجيناز
HEPES (1 م)15630080فيشر العلميلعمل متوسط اختبار الإجهاد الانقسامي
تقنيات حياة مصل الحصان26050-088لعمل وسط زراعة الخلايا
L-GlutamineSIGMAG-3126لعمل وسط اختبار الإجهاد الانقسامي
M-199Cellgro10-060-CVلجعل زراعة الخلايا المتوسطة
موريا ملعقةفيشر NC9190356 علميةلغسل القلوب  
OligomycinSIGMA75351-5MGيثبط الميتوكوندريا ATP synthase
RIPA bufferFisher Scientific89900لتحلل الخلايا لمقايسة البروتين
RotenoneSIGMAR8875يثبط المركب الأول للميتوكوندريا
Seahorse XFe96 Extracellular Flux
Analyzer		AgilentDevice المستخدم لتحليل معدل
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102601-100حزمة من لوحات ثقافة محلل التدفق وخراطيش المستشعر والعيار
بيروفات الصوديومSIGMAP2256لعمل اختبار الإجهاد الانقسامي متوسط
مقص مستقيمأدوات العلوم الدقيقة91401-12لتشريح القلوب
مرشح حقنة 0.2 & mu ؛ حجمللترشيح المعقم لوسط الهضم
TrypsinUSB Corporation22715 25GMلعمل محلول ما قبل الهضم
استهلاك الأكسجين م

المراجع

  1. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
  2. Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
  3. Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
  4. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
  5. Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116(2015).
  6. Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
  7. Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).
  8. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
  9. Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
  10. Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
  11. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
  12. Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
  13. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).
  14. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
  15. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
  16. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
  17. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  18. Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
  19. Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
  20. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  21. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  22. Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
  23. Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
  24. Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
  25. Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
  26. Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
  27. Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
  28. Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
  29. Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
  30. Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
  31. Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
  32. Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

96 FCCP

مقالات ذات صلة