التصور الفلورسنت من الحمض النووي الريبي المانجو الموسومة في المواد الهلامية البولي أكريلاميد عن طريق طريقة بوستينينغ

ملخص

هنا نقدم طريقة حساسة وسريعة، والتمييز بعد جل تلطيخ لصورة RNAs الموسومة مع الجيش الملكي النيبالي المانجو aptamers الأول، الثاني، الثالث، أو الرابع، وذلك باستخدام إما الأصلي أو التشويه البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (صفحة) المواد الهلامية. بعد تشغيل المواد الهلامية القياسية الصفحة، يمكن أن تكون ملطخة بسهولة RNA المانجو مع TO1-البيوتين ومن ثم تحليلها باستخدام القراء الفلورسنت المتاحة عادة.

الملخص

وتستخدم المواد الهلامية البولي أكريلاميد الأصلية والتشويهية بشكل روتيني لوصف حركية الريبونوكليوبروتين (RNP) المعقدة وقياس حجم الحمض النووي الريبي، على التوالي. كما العديد من تقنيات التصوير هلام استخدام البقع غير محددة أو تحقيقات الفلوروفور مكلفة، حساسة، والتمييز، ومنهجيات التصوير الهلام يُستحسن للغاية. إن تسلسلات الرنا مانجو الأساسية هي زخارف تسلسلية صغيرة (19-22 ن) يمكن أن تكون ببساطة وبتكلفة زهيدة ملحقة بالحمض النووي الريبي ذي الأهمية، عندما تكون مغلقة بواسطة جذع RNA تعسفي. هذه العلامات المانجو ربط مع تقارب عالية وخصوصية لالثيازول البرتقالي الفلورية صلة تسمى TO1-البيوتين، الذي يصبح آلاف المرات أكثر الفلورسنت على الربط. هنا نظهر أن المانجو الأول، الثاني والثالث، والرابع يمكن استخدامها لتصوير الحمض النووي الريبي على وجه التحديد في المواد الهلامية مع حساسية عالية. يمكن الكشف عن أقل من 62.5 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية الأصلية و 125 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية المزيلة عن طريق نقع المواد الهلامية في مخزن التصوير الذي يحتوي على البوتاسيوم و 20 نانوم TO1-البيوتين لمدة 30 دقيقة. نحن نبرهن على خصوصية نظام المانجو الموسومة من خلال تصوير RNA البكتيرية 6S المانجو الموسومة في سياق خليط معقد من مجموع الحمض النووي الريبي البكتيرية.

المقدمة

المانجو هو نظام وسم الجيش الملكي النيبالي يتكون من مجموعة من أربعة aptamers RNA الفلورسنت الصغيرة التي تربط بإحكام (nanomolar ملزمة) إلى مشتقات بسيطة من الثيازول البرتقالي (TO1-البيوتين، الشكل 1A)^1،2،3 . عند الربط، يتم زيادة الفلورسنت من هذا ليجاند 1000- إلى 4،000 أضعاف اعتمادا على aptamer محددة. السطوع عال من المانجو نظامة, أيّ ل مانجو [إييي] يتجاوز أنّ من يعزّز بروتين خضراء [فلورسنت] ([إجفب]), يضمّ مع ال [ننوملور] التصاق تقارب من ال [رنا] مانجو [أبتمرس], يسمح هو أن يكون استعملت على حدّ سواء في التصوير والتطهير من [رنا] مجمعات^2,4.

وقد تم تحديد هياكلالأشعة السينية من المانجو الأول 5، II^6،وIII⁷ إلى دقة عالية، وجميع aptamers الثلاثة تستخدم رباعية RNA لربط TO1-البيوتين (الشكل1B-D). يتم عزل النوى المدمجة من جميع aptamers الثلاثة من تسلسل الجيش الملكي النيبالي الخارجي عن طريق زخارف محول المدمجة. المانجو الأول والثاني على حد سواء الاستفادة من مرنة GNRA مثل حلقة محول لربط النوى المانجو إلى ثنائي الحمض النووي الريبي التعسفي (الشكل1B،C). وعلى النقيض من ذلك، يستخدم مانجو الثالث عزر ثلاثي جامد لربط جوهره بحلزونية RNA اعتباطية (الشكل1D، بقايا الأرجواني)، في حين أن بنية مانجو الرابع غير معروف حاليا. بما أنّ ال [ليغّد-لّس] لب من كلّ من هذا [أبتمرس] يكون فصلت من ال [رنا] خارجيّة تسلسل ب هذا محولات حلزونيّة, يبدو هو على الأرجح أنّ هم يستطيع كلّ كنت ببساطة أدمجت داخل تشكيل ال [رنا]. وقد تم وضع علامة على 6S البكتيرية التنظيمية RNA (مانجو الأول)، مكونات من spliceosome الخميرة (مانجو الأول)، و5S الإنسان الجيش الملكي النيبالي، U6 الجيش الملكي النيبالي، وscaRNA C / D (مانجو الثاني والرابع) كل بنجاح الموسومة في هذا الأزياء^2،8، مما يشير إلى أن العديد من يمكن وضع علامات RNAs البيولوجية باستخدام نظام APTAMER المانجو RNA.

تستخدم عادة ً المواد الهلامية والطبيعية لدراسة RNAs. وغالبا ما تستخدم المواد الهلامية التحلل للحكم على حجم RNA أو معالجة الحمض النووي الريبي، ولكن عادة، في حالة وصمة عار الشمالية، على سبيل المثال، تتطلب عدة خطوات بطيئة ومتتابعة من أجل توليد صورة. في حين تم استخدام APTAMERs النابية الفلورية الأخرى، مثل السبانخ والقرنبيط RNA، بنجاح للهلام التصوير⁹، لا يوجد نظام aptamer الفلورية حتى الآن تمتلك سطوع عالية والتقارب من نظام المانجو، مما يجعلها ذات أهمية كبيرة للتحقيق في قدرات مانجو في التصوير بهلام. في هذه الدراسة، تساءلنا عما إذا كان نظام المانجو RNA يمكن أن تمتد ببساطة إلى التصوير هلام، كما الإثارة والأطوال الموجية الانبعاثات من TO1-البيوتين (510 نانومتر و 535 نانومتر، على التوالي) هي مناسبة للتصوير في قناة eGFP المشتركة لمعظم الفلورسنت هلام المسح الآلات.

يوفر بروتوكول تلطيخ ما بعد الجل المعروض هنا طريقة سريعة للكشف على وجه التحديد عن جزيئات الحمض النووي الريبي التي تحمل علامات المانجو في المواد الهلامية البولي أكريلاميد هلام البولي أكريلاميد الأصلي والتشويه (PAGE). هذه الطريقة تلطيخ ينطوي على نقع المواد الهلامية في العازلة التي تحتوي على البوتاسيوم وTO1-البيوتين. الحمض النووي الريبي المانجو aptamers هي G-رباعية أساس والبوتاسيوم مطلوب لتحقيق الاستقرار في هذه الهياكل. باستخدام RNA نسخت من الحد الأدنى من قوالب الحمض النووي ترميز المانجو (انظر قسم البروتوكول)، يمكننا ببساطة الكشف عن أقل من 62.5 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية الأصلية و 125 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية المزيلة، وذلك باستخدام بروتوكول تلطيخ مباشرة. على النقيض من البقع الحمضية النووية غير محددة المشتركة (انظر جدول المواد، المشار إليها SG من هنا)، يمكننا تحديد بوضوح MANGO-الموسومة الجيش الملكي النيبالي حتى عندما تركيزات عالية من مجموع RNA غير الموسومة موجودة في العينة.

البروتوكول

1. إعداد الكواشف

1. TO1-البيوتين بعد البقع الحل (هلام تلطيخ الحل)
   1. جعل 1 L من 1 M الفوسفات العازلة في درجة الحموضة 7.2 عند 25 درجة مئوية عن طريق إضافة 342 مل من 1 M من Na₂HPO₄ و 158 مل من 1 م NaH₂PO₄. ضبط رقم الألف إلى 7.2 في 50 mM عن طريق إضافة حل الفوسفات المناسب. معقمة تصفية باستخدام مرشح 0.2 ميكروم وتخزين الحل في البلاستيك في درجة حرارة الغرفة.
   2. إعداد 5X هلام تلطيخ الحل (دون TO1-البيوتين) على النحو التالي. تشكل 1 L الحل عن طريق خلط 247.5 مل من ddH₂O، 700 مل من 1 KCl م، 50 مل من 1 M الفوسفات العازلة (حس 7.2)، و 2.5 مل من توين 20. معقمة تصفية باستخدام مرشح 0.2 ميكروم وتخزين الحل في البلاستيك. ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن إضافة MgCl₂ إلى هذا الحل إذا لزم الأمر لأنه يمكن أن تستقر مجمعات RNA. وهذا سيكون له تأثير متواضع على إشارة الفلورسنت².
   3. قم بإزالة محلول جل 1x باستخدام محلول جل 5x لتلوين هُنا من الخطوة 1.1.2، ومباشرة قبل الاستخدام، قم باستكماله بـ TO1-Biotin fluorophore (انظر جدولالمواد) إلى تركيز نهائي قدره 20 طن متري. على سبيل المثال، إضافة 20 مل من 5X هلام تلطيخ الحل إلى 80 مل من الماء منزوع الديون لجعل 100 مل من 1X هلام تلطيخ الحل، وإضافة 2 ميكرولتر من 1 mM TO1-البيوتين الأسهم (أعدت في dimethylformamide).
      ملاحظة: معامل الانقراض لصبغ TO1-البيوتين في 500 نانومتر هو 63000 م^-1سم^-1،يقاس في تلطيخ الحل 1.
2. إزالة الكتثر PAGE (2x حل تحميل جل المزيل والحلول A، B، C، بيركبريتات الأمونيوم، ورباعي ميثيل الإيثيلين ديامين)
   1. إعداد 50 مل من 2X حل تحميل هلام التحلل عن طريق خلط 40 مل من الفورماميد، 0.5 مل من 0.5 M حمض الإيثيلين ثنائي اتكالتيستيك (EDTA، ورقم الحموضة 8.0)، و 9.5 مل ddH₂O. يمكن تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة. لا يتم إضافة الأصباغ التحميل إلى هذا الحل كما أنه قد يحجب التصوير الفلورسنت.
   2. إعداد 2X هلام التحلل صبغ التحميل على النحو التالي. عند تنقية الحمض النووي الريبي والحمض النووي oligonucleotides، إضافة 0.5 مل من 2.5٪ (ث / الخامس) بروموفينول الأزرق (BB) و 0.5 مل من 2.5٪ (ث / الخامس) السيلانال الزلين (XC) إلى الحل المبين في الخطوة 1.2.1، وإضافة 8.5 مل من ddH₂O بدلا من 9.5 مل. يمكن تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة.
   3. إعداد 100 مل من الحل A عن طريق وزنها من 200.2 غرام من اليوريا (وزن الصيغة: 60.06 غرام / مول) وإضافته إلى 312.5 مل من 40٪ 19:1 الأكريلاميد: N،N'-ميثيلين بيسيكريلاميد. حرك مع شريط التحريك المغناطيسي في أقصى سرعة حتى يذوب (حوالي 3 ح) ويشكلون الحل إلى 500 مل باستخدام ddH₂O. لاحظ أن التركيزات النهائية هي 6.667 M اليوريا و 25٪ 19:1 الأكريلاميد: ن، N'-ميثيلين بيسيكريل. يخزن في 4 درجة مئوية في البلاستيك نظيفة.
   4. إعداد 1 لتر من الحل B عن طريق وزنها من 400.4 غرام من اليوريا ويشكلون الحل إلى 1 لتر مع ddH₂O؛ يُحرّك المزيج حتى يذوب اليوريا. يمكن الاحتفاظ الحل B في درجة حرارة الغرفة.
   5. إعداد الحل C (10x تريس-بورات-EDTA [TBE]) على النحو التالي. إعداد 4 L من 10X TBE عن طريق وزنها من 432 غرام من قاعدة تريس و 220 غرام من حمض البوريك، مضيفا 160 مل من 0.5 M EDTA مع حموضة من 8 (تصفيتها)، ويشكلون الحل إلى 4 L مع ddH₂O. يتم إجراء مخزون كبير من هذا المخزن المؤقت كما يتم استخدامه أيضا كمخزن تشغيل هلام.
   6. إعداد 10٪ من الكبريتات الأمونيوم (APS) عن طريق حل 1 غرام من APS في حجم إجمالي 10 مل من ddH₂O. مخزن في 4 درجة مئوية.
   7. حافظ على رباعي ميثيل الإيثيلين (TEMED) في متناول اليدين. تخزينه في 4 درجة مئوية جنبا إلى جنب مع الحل APS.
3. الصفحة الأصلية (2x هلام الأصلي حل التحميل)
   1. إعداد 50 مل من 2X هلام الأصلي تحميل الحل عن طريق خلط 25 مل من 100٪ الجلسرين، 10 مل من 5X هلام تلطيخ الحل، و 15 مل من ddH₂O لتعويض الحل إلى 50 مل.
      ملاحظة: كما هو الحال في قسم جل التشويه، يمكن إضافة الأصباغ التحميل إلى هذا المخزون، ولكن إضافتها يمكن أن تحجب إشارة الفلورسنت في الجل، وبالتالي، ينبغي تجنبها.

2. إعداد وتحميل المواد الهلامية التشويه

1. إعداد هلام التشويه مع نسبة مئوية مناسبة من قبل الجدول 1. النظر في نظام الصب هلام محددة. تستخدم المواد الهلامية 30 مل عادة. يمكن تقدير نسبة الجل المناسبة باستخدام الجدول2: اختر نسبة البولي أكريلاميد حيث يكون لأصباغ BB وXC motilities أسرع وأبطأ، على التوالي، من الحمض النووي الريبي من الفائدة، لضمان فصل عالية النطاق في الحجم ذات الصلة مجموعه.
2. خلط الحلول A، B، C وفقا للجدول 1 وإضافة APS وTEMED مباشرة قبل صب هلام. خلط الحلول بشكل جيد في البلاستيك نظيفة.
3. صب الحل هلام في جهاز الصب هلام المناسب، بعد التأكد من أن جميع المكونات نظيفة بدقة. رفع جانب واحد من الجهاز بحيث يتم إمالة الجل قليلا عند صب، لتجنب أي فقاعات الهواء تصبح محاصرة داخل هلام نفسها.
4. أدخل المشط المطلوب واتركه لبوليمريز (حوالي 30 دقيقة). مراقبة البلمرة من خلال البحث عن كثب عن تغيير في مؤشر الانكسار حول الآبار هلام. قم بمكياج خزان الجل باستخدام محلول C 1x (1x TBE) وقم بإزالة المشط بعناية. باستخدام حقنة، استنشق الآبار مباشرة قبل تحميل العينة.
5. إعداد عينات التشويه على النحو التالي. إضافة 2X هلام إزالة العينات تحميل العينات من الفائدة لجعل حل تحميل هلام denaturing 1X والحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق باستخدام thermocycler أو حمام مائي.
6. قبل تحميل العينات، تبريد الهواء لهم عدة دقائق حتى تبرد لمسة. تحميل العينات عن طريق طبقات لهم في الجزء السفلي من كل بئر، وذلك باستخدام نصائح هلام التحميل.
   ملاحظة: يمكن استخدام نصائح مستديرة للهلام من 1 مم سمك أو أكثر؛ استخدام نصائح مسطحة للهلام أرق.
7. تشغيل المواد الهلامية المزيلة للتشويه في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن القوة الكهربائية منخفضة بما فيه الكفاية بحيث لوحات الزجاج من نظام هلام لا تصدع.
   ملاحظة: في مختبرنا، كان 28 واط ل20 سم × 16 سم لوحات كافية لهذا الغرض.

3. إعداد وتحميل المواد الهلامية الأصلية

1. إعداد هلام أصلي مع نسبة مئوية مناسبة عن طريق الإشارة إلى الجدول 3. النظر في نظام الصب هلام محددة، ولكن نضع في اعتبارنا أن 30 هلام مل تستخدم عادة. مزيج من حلول 1X TBE، 40٪ 29: 1 أكريلاميد: N، N'-ميثيلين بيسيكريلاميد، والجلسرين وفقا للجدول 3،وإضافة APS وTEMED مباشرة قبل صب الجل. المتابعة كما هو موضح في الخطوتين 2.3 و 2.4.
2. إعداد عينات أصلية عن طريق إضافة 2X هلام الأصلي تحميل الحل إلى عينات RNA من الفائدة لجعل الحل 1X والسماح لها باحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 100 دقيقة قبل تشغيل هلام لضمان كامل RNA للطي.
3. تشغيل هلام الأصلي في غرفة باردة 4 درجة مئوية، وضمان أن القوة الكهربائية منخفضة بما فيه الكفاية لعدم تسخين الجل.
   ملاحظة: في مختبرنا، كان 14 واط ل20 سم × 16 سم لوحات كافية لهذا الغرض.

4. الجيش الملكي النيبالي إعداد بواسطة النسخ T7 جولة من الإعادة

ملاحظة: تم طلب تسلسل الحمض النووي المستخدم ة في نسخ الإعادة 10 من بنيات المانجو RNA تجاريا. في هذه الطريقة، يتم تهجين oligonucleotides الحمض النووي الذي يحتوي على تكملة عكسية (RC) من كل من تسلسل ليتم نسخها والمروج T7 إلى سلسلة حبلا أعلى المروج T7 ومن ثم نسخها في المختبر. أدناه، لكل oligonucleotide، يتم عرض RC من تسلسل جوهر المانجو بالخط العريض ويظهر RC من منطقة المروج T7 في مائلة. وتتوافق المخلفات في الخطوط العادية مع المناطق الحلزونية التكميلية التعسفية المطلوبة للسماح لنواة المانجو بطيها بشكل صحيح.

مانجو الأول: GCA CGT شركة الاتصالات الدولية مركز مكافحة الإرهاب CTC TCC CCCCtt CGT ACG TCG C TA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
المانجو الثاني: GCA CGT لجنة مكافحة الإرهاب CTC Ctc TCC TCT CGTACG TCG TCG CTGA GTC GTA TTA AAG
المانجو الثالث: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
المانجو الرابع: GCA CGT ACT CGC CTC لجنة مكافحة الإرهاب لجنة التنسيق الإدارية لجنة التنسيق الإدارية لجنة التنسيق التعاونية تكت غ غ غ ج غ مجلس التعاون الخليجي تات أغت تغ غ ت ات تا AG
T7 أعلى ستراند: CTT تا تاك GAC TCA CTA TAG G

1. تنقية جل إعدادي من الحمض النووي oligonucleotides
   1. لتخليق الحمض النووي على نطاق 0.2 ميكرومول، قم بتعليق الأوليغونوكليوتيد الحمض النووي غير المحمي في 100 ميكرولتر من ddH₂O و 100 ميكرولتر من صبغ التحميل المزيل للتشوه 2x (من الخطوة 1.2.2). في هذه الحالة، بما في ذلك الأصباغ تحميل هلام في محلول التحميل في نفس التركيز كما في الخطوة 1.2.2 يفضل.
   2. تنقية الأوليغونوكليوتيد الحمض النووي باستخدام 50 مل هلام مقياس إعدادي من نسبة البولي أكريلاميد المناسبة; استخدام الجدول 2 لاختيار نسبة هلام. على سبيل المثال، استخدم جل 8% لتسلسل 50 nt. من الناحية المثالية، يجب تشغيل الأزرق بروموفينول أسرع من oligonucleotide، وينبغي تشغيل السيلانول الزيلين أبطأ.
      ملاحظة: في مختبرنا، تم صب هذه المواد الهلامية باستخدام الفواصل الصب التي كانت 1.5 مم سميكة وهلام تحميل مشط مع الآبار التي كانت 2-2.5 سم واسعة.
   3. قم بتحميل 100 ميكرولتر من حلول الحمض النووي الأوليغونوكليوتيد التي تم إعدادها في الخطوة 4.1.2 لكل جل إعدادي كما هو موضح في الخطوات 2.4-2.7.
   4. جفف بعناية خارج الجل، وإزالة لوحات الزجاج، وتغطية كلا الجانبين من هلام في التفاف البلاستيك. وضعه على شاشة التصوير الفلورسنت (الألومنيوم المدعومة رقيقة طبقة لوحات الكروماتوغرافيا مشربة مع فلوروفور هي حل اقتصادي) واستخدام مصباح قصير الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية المحمولة باليد لتصور نطاقات الحمض النووي من قبل التظليل الأشعة فوق البنفسجية.
   5. وينبغي ملاحظة ظل هش ومحدد جيدا إذا كان تركيب الحمض النووي من نوعية عالية. وضع علامة على العصابات على التفاف البلاستيك، وذلك باستخدام علامة دائمة.
      ملاحظة: حماية الجلد والعينين من الأشعة فوق البنفسجية وإبقاء التعرض قصيرة لتجنب إتلاف عينة حمض النووية.
   6. وضع الجل على لوحة زجاجية نظيفة، وقطع بعناية من العصابات ملحوظ ووضع كل جزء جل في 400 ميكرولتر من 300 m M كلوريد الصوديوم. إهتم بالحمض النووي بين عشية وضحاها، باستخدام دوار في درجة حرارة الغرفة.
   7. استعادة eluent في أنبوب الطرد المركزي نظيفة وإضافة 2.5 مكافئات من الإيثانول لترسب الحمض النووي. دوامة جيدا ووضع الأنبوب في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   8. بيليه العينة في جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء في 156،000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. إزالة بعناية supernatant وإعادة تعليق بيليه في DDH₂O. استخدام مطياف لتحديد بدقة تركيز الحمض النووي القلة. تخزين العينة كمخزون 10 μM للراحة في -20 درجة مئوية.
2. نسخ الإعادة وتنقية هلام عينات الجيش الملكي النيبالي
   1. إعداد 5x النوكليوسيد ثلاثي الفوسفات (NTP) الأسهم عن طريق خلط المخزونات NTP السائلة تتكون من تركيز نهائي من 40m غوانوسين ثلاثي الفوسفات (GTP, 11,400 M^-1*1 سم -1), 25 m cytidine triphosphate (CTP, 7,600 M^-1+cm^-1),25 mM أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP, 5,000 M^-1*cm^-1),و 10 m اليوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP, 10,000 M^-1·cm-1); جميع معاملات الانقراض في 260 نانومتر.
      ملاحظة: يمكن الحصول على مخزونات سائلة أو مسحوق تجاريا. إذا كان إعداد المخزونات الأولية من مسحوق، وضبط بعناية ورقم الألف إلى رقم الألف النهائي من 7.9، وذلك باستخدام 1 M الناهو. Aliquot المخزون في أنابيب microcentrifuge 1.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
   2. إعداد 100 مل من 10x T7 النسخ المخزن المؤقت عن طريق خلط 25.6 مل من 1 م تريس-HCl، 14.4 مل من1 M تريس قاعدة، 26 مل من 1 M MgCl 2، 10 مل من 10٪ تريتون X-100، و 0.637 غرام من الحيوانات المنوية. تشكل الأسهم إلى حجم نهائي من 100 مل عن طريق إضافة ddH₂O.
      ملاحظة: يجب تأكيد رقم الألف النهائى من 7.9 من محلول 1x باستخدام مقياس حُمَّل حُمَد. يجب أن تكون 10x معقمة تصفيتها وتخزينها في -20 درجة مئوية في aliquots الحجم المناسب.
   3. إجراء النسخ على النحو التالي.
      1. إضافة الكواشف التالية لتشكل تركيز نهائي من 1X T7 النسخ العازلة باستخدام 10x T7 النسخ المخزن المؤقت وddH₂O (من الخطوة 4.2.2)، 1x NTPs، 10 m من dithiothreitol (DTT)، 1 μM T7 تسلسل حبلا أعلى (انظر القسم 4 ملاحظة ل تسلسل)، 1 ميكروم هلام تنقية تسلسل الحمض النووي المانجو (الخطوة 2.1)، وT7 RNA البلمرة الإنزيم (1 U / ميكرولتر).
      2. دوامة، تدور إلى أسفل، واحتضان الحل في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أو حتى يصبح غائما وأشكال عجل أبيض في الجزء السفلي من الأنبوب. وينبغي أن يؤدي النسخ 50 ميكرولتر في 50 ميكرولتر من ~ 50 ميكرومتر الحمض النووي الريبي بعد تنقية هلام. إضافة حجم متساو من 2X صبغ التشويه وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى جاهزة لتنقية هلام.
   4. جل-تنقية الحمض النووي الريبي الناتجة كما هو موضح في قسم تنقية هلام القلة النوى DNA باتباع الخطوات 4.1.2\u20124.1.8، استبدال عينة RNA للحمض النووي.
      ملاحظة: الحمض النووي الريبي حساس للغاية لتدهور RNase، لذلك تأكد من أن في جميع الخطوات، يتم ارتداء القفازات ومعطف مختبر نظيف في جميع الأوقات. ضمان إعداد وتخزين جميع العينات في الأواني البلاستيكية ذات الاستخدام الواحد للحماية من التلوث RNase، وغسل لوحات الزجاج بعناية مع الصابون الساخن والماء قبل الاستخدام، وشطفها جيدا مع ddH₂O، وتجفيف الأواني الزجاجية مع مساعدة من الإيثانول تطبيقها من زجاجة الضغط.
   5. استخدم 1 μL من عينة RNA النهائية، وباستخدام مطياف يستند إلى قطرة، تحديد الامتصاص في 260 نانومتر. باستخدام معامل الانقراض الذي يحدده أقرب طريقة مجاورة، حساب تركيز الحمض النووي الريبي وضبط تركيز العينة إلى 10 ميكرومتر مع ddH₂O للراحة. تخزين عينات الجيش الملكي النيبالي في -20 درجة مئوية.
3. الإشريكية القولونية مجموع استخراج حمض النووية الخام
   ملاحظة: البروتوكول التالي مثال. يستخدم هذا البروتوكول الذاتي أعرب المانجو I-معلم 6S RNA من بلازميد في E. القولونية, ويوصف الحث من هذا البلازميد في مكان آخر بالتفصيل⁴.
   1. لأغراض هذه الدراسة، إعداد 500 مل من الخلايا المستحثة لكل من PECOLI-RNA مانجو وpecoli-T1 البلازميدات (الخلايا هي الناجمة في OD_600nm من 1). قم بعملية الكري الخلايا وتخزينها عند -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
   2. إجراء استخراج الجيش الملكي النيبالي على النحو التالي.
      1. خذ 0.5 مل من بيليه الخلية pecoli المستحثة وإضافة 500 ميكرولتر من الفينول الملتبس. ثم، دوامة العينة؛ الحل سيصبح أبيض حليبي. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة لفصل الطبقات.
      2. استخراج الطبقة العليا، والتي سوف تكون صفراء قليلا، وتكرار الخطوة 4.3.2.1 عن طريق إضافة حجم متساو من الفينول، سنتريفيجينغ، واستخراج ما مجموعه 5X (أو حتى الطبقة الوسطى، وهو أبيض مبهمة، يذهب بعيدا وتترك طبقتين فقط واضحة).
      3. أضف كمية الماء المستخرجة من الفينول إلى حجم متساو ٍ من الكلوروفورم، الدوامة، ثم أجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقتين.
      4. استخراج الطبقة المائي وإضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 300 mM. يُعجّل بالحمض النووي الناتج عن إضافة 2.5 مكافئات من الإيثانول، الدوامة، الدوران، والتعجيل عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
      5. بيليه في جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء في 15.6 X 1000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      6. إضافة خطوة DNase I الهضم إلى هذا الإجراء، باتباع البروتوكول المشار إليه¹¹، للحصول على مجموع الجيش الملكي النيبالي.
         ملاحظة: دوامة بقوة حتى يتم حل تماما بيليه في ddH₂O.

5. بعد جل تلطيخ

1. أعد محلول جل 1x لتلوين هذي اللطخة حسب الوصفة في الخطوة 1.1.3 وأضفها إلى وعاء زجاجي نظيف واسع بما يكفي ليناسب الجل بشكل مريح.
   ملاحظة: حاويات زجاجية البورسليكات مع أغطية تناسب المفاجئة تخدم هذا الغرض بشكل جيد.
2. إضافة ما يكفي من 1X هلام تلطيخ الحل إلى الحاوية بحيث يتم تغطية هلام تماما مع الحل وsloshes السائل على الجزء العلوي من هلام عندما يتم وضعها على الدوار المداري.
   ملاحظة: يجب أن تكون الحاوية كبيرة بما يكفي لتناسب الجل بحيث يمكن أن تتحرك حولها ويكون ما يكفي من العازلة في الحاوية لتغطية الجل بالكامل.
3. بمجرد الانتهاء من هلام الأصلي أو التشويه تشغيل (القسم 2 أو 3، على التوالي)، وإزالة هلام من الجهاز وقطع آباره. يمكن أن يكون من المفيد لإزالة زاوية من هلام للتوجيه في وقت لاحق في التحليل.
4. نقل بعناية هلام إلى 1X هلام تلطيخ الحل أعدت في الخطوة 5.2.
   ملاحظة: المواد الهلامية هشة وعرضة للكسر حتى تكون حذرا عند نقل هلام. الحفاظ على غطاء على حاوية تلطيخ في جميع الأوقات حتى لا تلوث الجل.
5. ضع الجل على المدورة المدارية بسرعة 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: تأكد من أن الجل لا أضعاف مرة أخرى على نفسه; خلاف ذلك، قد تنتشر الجيش الملكي النيبالي من هلام وتسمية ذلك جزء مختلف من هلام.

6. تصوير المانجا الموسومة RNAs في هلام

1. بعناية decant المخزن المؤقت التصوير. شطف الجل بسرعة بالماء، وضمان ما يكفي من بقايا السائل للحفاظ على هلام المحمول قليلا في الحاوية.
2. نقل بعناية هلام على الصور. نقل بعناية عن طريق التقاط الجانبين من هلام ووضعه على علبة الصور. بدلا من ذلك، يمكن سكب هلام ببطء على صينية. تأكد من عدم وجود فقاعات تحت الجل وأنه لا يوجد سائل زائد تحت الجل. يمكن أن تكون الماصة المنفّلة على الجل مفيدة لإزالة أي سائل زائد.
   ملاحظة: استخدم منشفة ورقية لامتصاص السوائل الزائدة.
3. تأخذ صورة هلام، ومراقبة الفلورسنت بين الإثارة الطول الموجي 510 نانومتر وانبعاث الطول الموجي 535 نانومتر (على سبيل المثال، الضوء الأخضر في 520 نانومتر الطول الموجي إعدادات الفلورسنت على جهاز التصوير). تأكد من أن الإعدادات هي الأمثل تماما على الصك واتبع بعناية التعليمات للأداة المستخدمة.

النتائج

وأعدت الرناقصيرة التي تحمل علامات المانجو على النحو المبين في قسم البروتوكول. على افتراض أن الفلورسنت في ظروف التشويه سيكون من الصعب مراقبة بسبب وجود اليوريا في المواد الهلامية، درسنا لأول مرة مقاومة aptamers المانجو إلى اليوريا، والتي تعمل كمطهر حمض نووي. وجدنا أن aptamers المانجو هي مقاومة كبيرة لdenaturation تصل إلى تركيز اليوريا من حوالي 1 م (الشكل2A). قبل إضافة محلول جل تلطيخ إلى هلام التشويه، والتركيز النهائي من اليوريا في هلام هو 6 M. إضافة ما يكفي من محلول تلطيخ ل...

المناقشة

ميزة كبيرة من علامة المانجو الفلورسنت هو أنه يمكن استخدام علامة واحدة بطرق متعددة. سطوع عالية والتقارب من هذه aptamers جعلها مفيدة ليس فقط لفي تصور الخلية² ولكن أيضا لRNA في المختبر أو تنقية RNP⁴. ولذلك، هلام التصوير يمتد براعة العلامة المانجو بطريقة مباشرة. حساسية التصوير هلام المانجو أقل قليلا من أن من وصمة عار الشمالية¹⁴ ولكن يمكن بسهولة الكشف عن 60-120 fmol عينة من الحمض النووي الريبي، دون الحاجة إلى نقل غشاء طويلة ومملة وخطوات التحقيق. وهذا مشاب...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.8 مم مشط سميك 14 بئرا ل 30 مل PAGE المواد الهلامية	LabRepCo	11956042
101-1000 & micro ؛ L  نصائح	فيشر	02-707-511
20-200 & L الاحتفاظ المنخفض  نصائح	فيشر Scientific	02-717-143
أكريلاميد: N ، N'-methylenebisacrylamide (40٪ 19: 1)	الكواشف الحيوية	BP1406-1	السمية الحادة
أكريلاميد: N ، N '-methylenebisacrylamide (40٪ 29: 1)	Fisher	BP1408-1	السمية الحادة
Agar	Anachemia	02116-380
لوحة TLC المدعومة من الألومنيوم	Sigma-Aldrich	1164840001
Amersham Imager 600	GE Healthcare Lifesciences	29083461
الأمونيوم بيرسولفات	Biorad	161-0700
خلايا BL21	NEB	C2527H
حمض البوريك	ACP	B-2940
بروموفينول ملح الصوديوم الأزرق	Sigma	B8026-25G
Chloloform	ACP	C3300
Dithiothreitol	Sigma Aldrich Alcohols	D0632-5G
DNase I	ThermoFisher	EN0525
EDTA ملح ثنائي الصوديوم	ACP	E-4320
الإيثانول	التجاري   ؛	P016EAAN
نصائح تحميل جل	مسطح كوستار	CS004854 فورماميد
99٪	ألفا إيسار	A11076
مجموعة أجهزة جل مع فواصل وأمشاط طبق	زجاجي 41077017		LabRepCo
مع غطاء بلاستيكي	Pyrex	1122963	يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لتناسب قطعة الجل
الخاصة بك Glycerol	Anachemia	43567-540
حمض الهيدروكلوريك	464140468
ImageQuanTL	GE Healthcare Lifesciences	29000605
IPTG	Invitrogen	15529-019
KCl	ACP	P-2940
MgCl2	Caledron	4903-01
MgSO4	Sigma-Aldrich	M3409
NaCl	ACP	S-2830
NaOH	BDH	BDH9292
مختبر			دوار مداري
فينول	إنفيتروجين	15513-039
نصائح تحميل هلام مستديرة	كوستار	CS004853
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة	كاليدرون	8120-1
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة	كاليدرون	8180-01
SYBRGold	ThermoFisher	S11494
T7 RNA Polymerase	ABM	E041
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024-50 مل
TO1-3PEG-Biotin Fluorophore	ABM	G955
Tris Base	Fisher	BP152-500
Tryptone	Fisher	BP1421-500
توين -20	سيجما	P9496-100
اليوريا	فيشر	U15-3
زيلين سيانول	سيجما	X4126-10G
مستخلص الخميرة	Bioshop	YEX401.500