مقالة منهجية

إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة من أنسجة الفئران القحفية والعظام غير الصائق

DOI:

10.3791/59113

⸱

مايو 10, 2019

 ,  , 
1The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory for Oral Biomedicine of Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, University of Michigan

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول مفصل للكشف عن وقياس مستويات البروتين أثناء تكوين الجمجمة والوجه / مسببات الأمراض عن طريق التلطيخ المناعي باستخدام أنسجة الجمجمة والوجه الماوس كأمثلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نصف طريقة لإعداد واستئصال التبريد من الأنسجة الصلبة undecalcified من الفئران الشباب لتلطيخ المناعة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر تلطيخ مناعة الأنسجة اكتشافًا محددًا للغاية وموثوقًا به للبروتينات ذات الأهمية داخل نسيج معين. هنا نقوم بوصف بروتوكول كامل وبسيط للكشف عن التعبير عن البروتين أثناء تكوين الجمجمة والوجه / مسببات الأمراض باستخدام أنسجة الجمجمة والوجه الماوس كأمثلة. ويتألف البروتوكول من إعداد الأنسجة وتشريحها بالتبريد بالتبريد، والفلورة المناعية غير المباشرة، والحصول على الصور، والقياس الكمي. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف طريقة لإعداد واستئصال الأنسجة الصلبة غير الصائرة للبقع المناعي، وذلك باستخدام أنسجة الوجه القحفي والعظام الطويلة كأمثلة. هذه الأساليب هي المفتاح لتحديد التعبير البروتين والتغيرات المورفولوجية / التشريحية في الأنسجة المختلفة أثناء تكوين الجمجمة والوجه / مسببات الأمراض. كما أنها تنطبق على الأنسجة الأخرى مع التعديلات المناسبة. المعرفة بالأنسجة وجودة عالية من الأقسام أمر بالغ الأهمية لاستخلاص النتائج العلمية من النتائج التجريبية. وتشمل القيود المحتملة لهذه المنهجية، على سبيل المثال لا الحصر، خصوصية الأجسام المضادة وصعوبات التحديد الكمي، التي تناقش هنا أيضاً.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الوجه هو جزء رئيسي من الهوية البشرية، ويتكون من عدة أنواع مختلفة من الأنسجة، مثل ظهارة، العضلات، العظام، الغضروف، الأسنان. هذه الأنسجة مشتقة من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث: ectoderm، endoderm، وmesoderm1،2. لنمط وتطوير الأنسجة القحفية الوجهية بشكل صحيح، يجب أن يكون انتشار الخلايا والوفاة والتمايز منسقاً ومنظماً بشكل كبير من خلال مسارات إشارة محددة، مثل مسارات Wnt وFgf وHh وBMP3و4 ،5. العيوب في انتشار أو البقاء على قيد الحياة أو تمايز الخلايا سوف تؤدي إلى تشوهات في الوجه القحفي، والتي هي من بين العيوب الخلقية الخلقية الأكثر شيوعا. الفئران المعدلة وراثيا هي أدوات مفيدة لدراسة آليات تكوين الجمجمة والوجه ومسببات الأمراض1،2،3،4،5. فهم التغيرات في هياكل الجمجمة والوجه أثناء التنمية ومسببات الأمراض سيساعد على توضيح المبادئالتنموية الرئيسية وكذلك آليات تشوهات الوجه القحفي 1،2،3 ،4،5.

تلطيخ جبل كامل أو الأنسجة المقطعة مع الأجسام المضادة محددة هو تقنية لا تقدر بثمن لتحديد التوزيع المكاني للبروتينات ذات الأهمية 6. رسميا، يمكن أن تعتمد تلطيخ مناعة الأنسجة إما على الكيمياء المناعية (IHC) أو الفلورة المناعية (IF). بالمقارنة مع المنتج رد فعل مبهمة ولدت مع الركيزة كروموجينيك مثل 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) من قبل IHC, IF ينطوي على استخدام البوابات الفلورية مرئية من قبل المجهر الفلوري. لذلك، إذا IF قد تميز بوضوح الخلايا الإيجابية من الضوضاء الخلفية، ويسمح الصور لتحليلها كميا وتعزيزها بطريقة مباشرة من قبل برامج مثل ImageJ وأدوبي فوتوشوب7،8. يعمل نهج تلطيخ الجبل بأكمله على كتل صغيرة من الأنسجة (أقل من 5 مم سميكة)، والتي يمكن أن توفر معلومات ثلاثية الأبعاد حول موقع البروتينات / المستضدات دون الحاجة إلى إعادة الإعمار من الأقسام9و10 . ومع ذلك، بالمقارنة مع أقسام الأنسجة، جبل كامل تلطيخ المناعة يستغرق وقتا طويلا ويتطلب كميات كبيرة من حلول الأجسام المضادة. ليست جميع الأجسام المضادة متوافقة مع نهج جبل كامل الأساسية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاختراق غير الكامل للأجسام المضادة يؤدي إلى تلطيخ متفاوتة أو تلطيخ سلبي زائف. هنا سوف نركز على الكشف عن الفلورة المناعية من البروتينات / المستضدات على الأنسجة المقطعة. للأنسجة الصلبة (على سبيل المثال، الرأس، الأسنان، العظام الطويلة)، ترسب الكالسيوم أثناء التنمية / مسببات الأمراض يجعل العينة من الصعب قسم وشطف بسهولة قبالة خلال العلاج مناعة11،12. معظم البروتوكولات المتاحة حاليا الشارات الأنسجة الصلبة قبل التضمين لجعل القسم أسهل، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تدمر مورفولوجيا ومستضدات العينات إذا تم التعامل معها بشكل غير صحيح11،12. للتغلب على هذه القضايا، قمنا بتحسين نهج للتشريح بالتبريد للأنسجة الصلبة دون الشارات، مما أدى إلى تحسين التصور من مورفولوجيا وتوزيع البروتينات إشارة.

البروتوكول الموصوف هنا يستخدم لتحديد التغيرات المورفولومترية والأنسجة في أنسجة الوجه القحفي للفئران المعدلة وراثيا ً BMP. وعلى وجه التحديد، يتضمن البروتوكول (1) حصاد وتشريح أنسجة الرأس، (2) قسم وتلطيخ المناعة للعلامات التجريبية (Ki67، pSmad1/5/9) جنبا إلى جنب مع تلطيخ TUNEL، (3) تصوير الأقسام باستخدام المجهر الفلوري، وأخيرا (4) تحليل النتائج وقياسها كمياً. كما يرد وصف بروتوكول إعداد واستئصال الأنسجة الصلبة دون الشارات13. هذه الطرق هي الأمثل للأنسجة القحفية الوجه. كما أنها تنطبق على الأنسجة الأخرى من مختلف الأعمار من العينات مع التعديلات المناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أجريت جميع تجارب الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية لجامعة ميشيغان التي تغطي الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات في البحوث. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في جامعة ميشيغان (البروتوكول #PRO00007715).

1. إعداد الأنسجة

  1. إعداد الأنسجة الجنينية
    1. إعداد طبق واحد 10 سم والعديد من الأطباق 3.5 سم التي تحتوي على الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)، ولوحة ثقافة 12 جيدا تحتوي على 2 مل 4٪ بارافورماليد (PFA) في PBS في كل بئر لكل فأر حامل. ضع جميع أطباق بيتري وطبق على الجليد.
      ملاحظة: التعامل مع 4٪ PFA في غطاء محرك السيارة الدخان.
    2. تشريح الأجنة من الفئران الحامل في الجليد الباردPBS مع ملقط ومقص كما سبق وصفه14.
      1. باختصار، قتل فأر حامل معCO 2، والاستيلاء على الجلد تحت وسط البطن مع ملقط وقطع من خلال الجلد فقط، ثم سحب بلطف على الجلد لفصلها عن جدار العضلات البطن الكامنة.
      2. بعد ذلك، قطع إلى تجويف البطن بعد نفس الخط من شق الجلد. إزالة الرحم الذي يحتوي على سلسلة من الأجنة وإزالة الأجنة عن طريق قطع بلطف بعيدا جدار الرحم. سيتم إزالة الأنسجة خارج الجنين مثل كيس صفار البيض وamnion.
      3. قطع وعزل الرأس عن كل جنين.
    3. نقل كل رأس إلى كل بئر من لوحة 12 جيدا تحتوي على 4٪ PFA مع ماصة نقل البلاستيك أو ملقط. إصلاح العينات في 4٪ PFA في 4 درجة مئوية لمدة 4 ح. شطف العينات في PBS في 4 درجة مئوية مع هز لطيف لمدة 12 ساعة.
      ملاحظة: بالنسبة للأجنة التي تقل عن اليوم الجنيني 16.5 (E16.5)، قم بإصلاح رؤوس الأجنة مع 4% من PFA مباشرة بعد العزلة. بالنسبة للأجنة عند E16.5 أو في وقت لاحق، قم بإزالة التخلص من الجلد والأنسجة الدهنية من الرؤوس واشطفها عدة مرات في PBS الباردة الجليدية قبل التثبيت.
    4. رؤساء الحماية بالتبريد.
      1. نقل كل رأس إلى لوحة جديدة 12 جيدا تحتوي على 2 مل من السكروز 30٪ في PBS باستخدام ماصة نقل البلاستيك أو ملقط. يُحرّك بلطف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يغرق الرأس في الجزء السفلي من الطبق.
    5. تضمين الرؤوس.
      1. نقل الرأس المحمي بالتبريد إلى قالب يحتوي على درجة حرارة القطع المثلى (OCT) مركب. عينات متساوية في OCT لعدة دقائق. ضبط موقع واتجاه العينات مع ملقط.
      2. وضع القالب على الجليد الجاف لتجميد. تخزين القوالب المبردة الناتجة في كيس من البلاستيك عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستئصال بالتبريد.
        ملاحظة: الجانب قلص من العينات يجب أن تواجه الجزء السفلي من العفن تضمين.
  2. إعداد الأنسجة الصلبة غير الصائرة بعد الولادة
    1. القتل الرحيم في 3 أسابيع أو 3 أشهر الماوس القديم مع CO2. إزالة الجلد والأنسجة الدهنية. قطع وعزل الرأس أو العظام الطويلة من الماوس.
    2. إصلاح وحماية الرأس أو العظام الطويلة للفئران كما هو موضح في الخطوات 1.1.3-1.1.4.
    3. تضمين في الجيلاتين 8٪ بطريقة مماثلة للخطوة 1.1.5. الحفاظ على القوالب المبردة في كيس من البلاستيك في -80 درجة مئوية حتى الاستئصال بالتبريد.
      ملاحظة: الشارات ليست ضرورية هنا. لإعداد الجيلاتين 8٪ ، مزيج 8 غرام من الجيلاتين مع 100 مل من PBS ويغلي باستخدام الميكروويف. يجب أن تدرك أن الخليط يغلي بسهولة.

2- الاستئصال بالتبريد

  1. تعيين درجة حرارة cryostat إلى -18 درجة مئوية للأنسجة الرخوة جزءا لا يتجزأ من OCT أو -25 درجة مئوية وأقل للأنسجة الصلبة undecalcified جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين. الاحتفاظ عينات في غرفة cryostat لحوالي 30 دقيقة لequilibrate إلى درجة حرارة cryostat.
  2. طرد كتلة من cryomold. تجميد كتلة على تشاك عينة (حامل الأنسجة) عن طريق تصاعد مع انخفاض OCT. الحفاظ على الجانب قلص من العينة أبعد من تشاك (التي تواجه المشغل).
  3. قم بتحميل الظرف المثبت على الكتلة على حامل كائن cryostat. اضبط حامل الشفرة لجعل زاوية النصل 3°-5 درجة نسبة إلى العينة.
  4. جمع 10 أقسام ميكرومتر على الشرائح المجهر المغلفة. مقاطع جافة تماما في RT، ثم تخزينها في -80 درجة مئوية.

3. تلطيخ النسيج والتصوير المجهري

  1. تلطيخ الفلورة المناعية
    1. إخراج الشرائح من -80 درجة مئوية. احتفظ بالشرائح في RT لمدة ساعة واحدة إلى مقاطع airdry. شطف الشرائح في 0.1٪ PBST (0.1٪ البولي ايثيلين غليكول الإيثر الثنائي الفينيل ثلاثي ثماني الفينيل في PBS؛ انظر جدولالمواد) ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما لغسل OCT وأقسام نفاذية.
    2. بشكل اختياري، تنفيذ استرداد مستضد (اختياري).
      1. قم بتسخين حاجز سيترات (10 مليون متر من سيترات الصوديوم 6) في طبق تلطيخ مع باخرة أو حمام مائي إلى 95-100 درجة مئوية. تزج الشرائح في المخزن المؤقت سيترات، حضانة لمدة 10 دقيقة.
      2. خذ طبق تلطيخ من باخرة أو حمام مائي إلى RT. تبريد الشرائح في RT لمدة 20 دقيقة أو أكثر15.
        ملاحظة: كبدائل، استخدم العازلة Tris-EDTA (قاعدة Tris 10 mM، 1mM EDTA، 0.05٪ توين 20، درجة الحموضة 9.0) أو EDTA العازلة (1 MEDTA، 0.05٪ توين 20، pH 8.0) لاسترداد مستضد الناجم عن الحرارة. استخدم طنجرة الضغط أو الميكروويف أو حمام الماء لاسترجاع المستضد الناجم عن الحرارة، بالإضافة إلى الباخرة الساخنة. استرداد مستضد الناجم عن الإنزيم باستخدام التربسين أو البيبسين هو بديل آخر. تحسين تركيز ووقت العلاج من الاسترجاع الأنزيمي لتجنب المقاطع الضارة. تحسين طريقة استرداد مستضد لكل تركيبة الأجسام المضادة/المستضد.
    3. احتضان كل شريحة مع 200 درجة مئوية من محلول حظر (5٪ مصل الحمار المخفف في 0.1٪ PBST) في RT لمدة 30 دقيقة، ثم إزالة محلول حظر دون شطف.
    4. احتضان كل شريحة مع 100 درجة مئوية من الأجسام المضادة الأولية أو الأجسام المضادة المخففة في حل حظر لمدة 1 ساعة في RT أو O / N في 4 درجة مئوية. شطف الشرائح مع PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما في RT.
    5. احتضان كل شريحة مع 100 درجة مئوية من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في حل حظر لمدة 1 ساعة في RT. شطف الشرائح في PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT. حماية الشرائح من الضوء.
    6. تحميل الشرائح.
      1. إضافة قطرتين من وسائل مكافحة تتلاشى مع DAPI (4'، 6-دياميدينو-2-فينيليندول) على الشريحة. ثم تغطية مع غطاء.
      2. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام حتى يصبح جاهزًا للصورة.
        ملاحظة: كبديل، تسمية النوى مع DAPI أو Hoechst 33324 صبغ المخفف 1:2000 في PBS في RT أولا، ثم جبل مع الجلسرين.
  2. محطة ديوكسينوكليوتيديديل ترانسفيراز dUTP نهاية وضع العلامات (TUNEL) تلطيخ.
    ملاحظة: الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل مع 3'-هيدروكسيل تيرميني (3'OH الحمض النووي تيرميني) سوف تشكل خلال المبرمج في الخلية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول أن تسمية مجانا 3'OH الحمض النووي تيرميني في الموقع عن طريق وضع العلامات على شظايا الحمض النووي مع ديجوكجينين-نوكليوتيد باستخدام محطة ديوكسينوكليوديديل ترانسفيراز (TdT) عن طريق تلطيخ محددة باستخدام مجموعة تجارية (انظر جدول المواد ).
    1. اختياريا، أقسام وصمة عار مع الأولية واليكسا فلور-488 وصفت الأجسام المضادة الثانوية قبل تلطيخ TUNEL. شطف الشرائح في PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية لتلطيخ مزدوج من البروتين وTUNEL في نفس الشريحة.
    2. احتضان كل شريحة مع 100 ميكرولتر بروتيناز K (10 ميكروغرام / مل في 10 mM تريس درجة الحموضة 7.5 و 5 MM EDTA) لمدة 5 دقائق في RT. شطف الشرائح مع PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما في RT.
      ملاحظة: ضبط وقت الحضانة ودرجة الحرارة من Proteinase K لكل نوع الأنسجة. ل10 أقسام ميكرومتر من رؤوس الأجنة ثابتة في 4٪ PFA، حضانة لمدة 5 دقائق في RT. بالإضافة إلى الطريقة التي تستخدم Proteinase K، استخدم العلاجات البديلة حسب الحاجة، بما في ذلك (1) الإيثيلين غليكول الإيثر الثنائي الفينيل البولي ايثيلين الإيثيلي الأوكتنيل، 0.1٪ سيترات الصوديوم، 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية؛ (2) 0.25٪-0.5٪ بيبسين في حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 2) أو 0.25٪ التربسين، 10 دقيقة في 37 درجة مئوية؛ و (3) التشعيع الميكروويف مع 0.1 M حاجز سيترات (درجة الحموضة 6).
    3. تطبيق 200 € L من حل حظر (5٪ مصل الحمار المخفف في 0.1٪ PBST) على كل شريحة، حضانة في RT لمدة 30 دقيقة، والاستفادة من حل حظر دون شطف.
    4. تطبيق 50 μL من المخزن المؤقت التعادل التي توفرها المجموعة على كل شريحة في RT لمدة 10 ثانية على الأقل.
    5. إعداد خليط التفاعل (قوة العمل TdT إنزيم) عن طريق خلط إنزيم TdT مع العازلة رد الفعل المقدمة من قبل مجموعة بنسبة 3:7. تطبيق 50 درجة مئوية من خليط التفاعل على كل شريحة، وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. تطبيق 200 € L من العازلة وقف (1:30 المخفف في ddH2O) التي قدمتها مجموعة لكل شريحة، ثم احتضان في RT لمدة 10 دقيقة. شطف الشرائح مع PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    7. تسمية مع الجسم المضاد رودامين.
      1. تطبيق 50 درجة مئوية من قبل الاحماء (RT) المضادة للdigoxigenin conjugate (rhodamine) (1:1 المخففة في حل حظر) على كل شريحة. حضانة في RT لمدة 30 دقيقة في الظلام.
      2. شطف الشرائح مع PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما. تحميل الشرائح كخطوة 3.1.6.

4. اقتناء الصور

  1. استخدام عناصر التحكم الإيجابية (الأنسجة الإيجابية للمستضد الهدف) للتحقق من وضع العلامات على الإشارة والضوابط السلبية (حذف الأجسام المضادة الأساسية أو التحكم في نوع isotype أو الأنسجة سلبية للمستضد الهدف) لتقييم خلفية الصور تحت الفلورسنت المجهر.
  2. تعيين المعدات وظروف الكاميرا (التعرض والإعدادات العامة الأخرى) للتصوير استناداً إلى شدة إشارة الضوابط السلبية والإيجابية.
    ملاحظة: تختلف هذه الحالات حسب (1) الكاميرات والمجاهر المستخدمة في التصوير، (2) الأجسام المضادة، و (3) الأنسجة لكل تجربة. الظروف الشائعة المستخدمة في أنسجة الوجه القحفي هي ISO 200 مع وقت التعرض تتراوح بين 1/100 ق إلى 1 ق تعتمد على نوعية وخصوصية الأجسام المضادة. وتختلف التكبيرات المناسبة تبعاً لحجم العينات والغرض من التجارب.
  3. الحصول على الصور مع المجهر اللاإثراء التقليدية أو المجهر البؤري. الحصول على الصور (بما في ذلك تلك الضوابط المقابلة) في نفس الشروط لكل قناة ملونة. حفظ الصور بنفس التنسيق (tiff هو الأفضل للحفاظ على المعلومات).

5- القياس الكمي للفلورة

ملاحظة: ومن الناحية الإحصائية، فإن المقارنة الإحصائية بين التلطيخ بين المجموعات المختلفة ستكون أكثر إفادة في كثير من الحالات. مع الصور المناعية، قم بقياس المستوى النسبي للبروتين عن طريق قياس كثافة الإشارة، أو عد الخلايا الإيجابية، أو حساب المناطق الإيجابية. وبالنسبة للتحليل الإحصائي، فإن الحد الأدنى لعدد العينات المستقلة بيولوجيا هو 3. طريقة نموذجية هي إنشاء ثلاثة مقاطع على الأقل من كل عينة وأخذ الصور لثلاثة مناطق تمثيلية على الأقل في كل مقطع.

  1. التحديد الكمي لشدة الفلورة باستخدام ImageJ
    1. افتح البرنامج، واستخدم تحليل > تعيين القياسات للتحقق من تحديد المنطقة والكثافة المتكاملة فقط. استخدم ملف > فتح لفتح الصور لتحليلها.
    2. استخدم شريط الأدوات لتحديد رمز المربع أو الدائرة في أقصى اليسار. حدد المنطقة المراد تحليلها على الصورة باستخدام أداة التحديد. استخدم تحليل > قياس للحصول على قراءة المنطقة المحددة والكثافة المتكاملة في نافذة النتائج. حدد منطقة بجوار خلية موجبة ليس لديها الفلورة لقراءة الخلفية.
    3. كرر الخطوة 5.1.2 لتحليل الصور الأخرى. ضبط المنطقة ليتم تحليلها لتتناسب مع تلك الصورة الأولى.
    4. نسخ كافة البيانات في إطار النتائج ولصقفي جدول بيانات عند الانتهاء من تحليل.
    5. حساب كثافة الفلورة المصوبة (CTCF) ككثافة متكاملة — (مساحة الخلية المحددة x متوسط الفلورة من قراءات الخلفية). قارن الفرق بين الفلورة الخلية الإجمالية المصححة بين العينات وجعل الرسم البياني.
  2. تحديد كمية عدد الخلايا الموجبة من الصور الفلورية باستخدام ImageJ
    1. عد الخلايا اليدوي.
      1. استخدام ImageJ > الإضافات > تحليل لتثبيت البرنامج المساعد عداد الخلية.
      2. استخدم ملف > فتح لفتح الصور لتحليلها. استخدم الإضافات > التحليل > عداد الخلية لفتح نافذة العداد ونافذة النتائج.
        ملاحظة: لا يعمل عداد الخلية على مكدسات. لحساب الأكوام، البرنامج المساعد مؤامرة Z محورالشخصي، ثم استخدام صورة > مكدسات > مؤامرة Z محور الشخصي لمراقبة كثافة عائد الاستثمار تتحرك باستخدام أداة تتبع الجسيمات. يمكن أن تكون هذه الأداة إما يدوية أو تلقائية.
      3. النقر فوق أحد الأزرار في أسفل إطار العداد لبدء العد. انقر مباشرة على خلية / كائن ليتم العد حتى الانتهاء.
      4. انقر فوق الزر نتائج في الإطار "عدد". سيتم عرض العدد الإجمالي للخلايا التي تم حسابها في إطار النتائج. حفظ سجل النتائج كجدول بيانات وتحليل.
    2. عد الخلايا الآلي.
      1. استخدم ملف > فتح لفتح الصور لتحليلها. حوّل صورة RGB إلى صورة ذات مقياس رمادي قبل المتابعة.
      2. استخدم الصورة > ضبط > عتبة لتحديد كافة المناطق التي تحتاج إلى حساب.
      3. استخدام تحليل > تحليل الجسيمات للحصول على عدد من الخلايا / الجسيمات. تعيين نطاق من حجم الجسيمات صالحة (على سبيل المثال، 100-إنفينيتي) بدلاً من الافتراضي 0-إنفينيتي لحساب الخلايا / الجسيمات ضمن نطاق معين. حفظ سجل النتائج كجدول بيانات وتحليل.
        ملاحظة:         للحصول على معلومات أخرى من الصورة، إلى جانب المنطقة، انتقل إلى تحليل > تعيين القياسات وحدد المربع بجوار المعلومات المطلوبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أقسام الأنسجة القحفية الجنينية
بعد الخطوات المذكورة أعلاه، تم تشريح الرؤوس من السيطرة(P0-Cre)أو متحولة (تنشيط بشكل تأسيسي Bmpr1a في خلايا القمم العصبية، P0-Cre؛ caBmpr1a)الأجنة في اليوم الجنيني (E) 16.5 أو 18.5. بعد تحديد في 4٪ PFA لمدة 4 ساعة، تم تضمين العينات في OCT وcryosectioned coronally. وكانت المقاطع الناتجة ملطخة بالأجسام المضادة ضد pSmad1/5/9 (عوامل الإشارة إلى المصب BMP) أو Ki67 (علامة انتشار الخلايا) دون استرجاع مستضد وفقا للبروتوكول. كما ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكول مفصل لإعداد رأس الماوس وأنسجة العظام غير الصائق، واستئصال التبريد لتلطيخ المناعة من انتشار الخلايا، وموت الخلايا، وعلامات إشارات BMP. كما نقوم بتفصيل استراتيجية الحصول على البيانات الكمية من الصور المناعية الفلورية. ويمكن أيضا أن تنطبق هذه الأساليب على الأنسجة الأخرى مع التعديلات المناسبة.

تختلف ظروف إعداد الأنسجة حسب حجم ونوع الأنسجة. عادة ما يحتاج وقت التثبيت والحماية بالتبريد إلى عدة ساعات إلى ليلة وضحاها. بعد التثبيت، يمكن أيضا أن تكون جزءا لا يتجزأ من الأنسجة في البارافي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (R01DE020843 إلى Y.M.)، والرابطة الدولية للموارد المالية، ومنحة في المعونة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31500788 إلى J.Y.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شريط لاصقLeica# 39475214
Alexa fluor 488-Goa المضاد للأرانب الجسم المضاد الثانويInvitrogenA-11034
Antifade Mountant مع DAPIInvitrogenP36931
ألبومين مصل الأبقارSigmaA2153
CoverslipsFisher Brand12-545-E
CryostatLeicaCM1850
EDTASigmaE6758
مجهر مضانأوليمبوسBX51
الجيلاتينسيجماG1890
في الموقع   ؛ طقم الكشف عن موت الخلاياMilliporeS7165
شرائح المجهرفيشر براند12-550-15
OCT مركبفيشر للرعاية الصحية23-730-571
بارافورمالدهيد (PFA)SigmaP6148   ؛
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)SigmaP4417
بولي إيثيلين جلايكول   ؛ ثلاثي أوكتيل فينيل الأثيرسيجماT9284تريتون X-100
بروتيناز KInvitrogenAM2542
أرنب مضاد للأجسام المضادة Ki67تقنية إشارات الخلية9129الكثير #:3 ؛ RRID: AB_2687446
أرنب المضادة للجسم المضادلتقنية إشارات الخلية13820Lot #:3 ؛ RRID: AB_2493181
سترات الصوديومسيجما1613859
السكروزسيجماS9378
تريسسيجما10708976001

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
  2. Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
  3. Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
  4. Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
  5. Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
  6. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
  7. Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
  8. Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
  9. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561(2016).
  10. Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
  11. Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
  12. González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
  13. Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
  14. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803(2014).
  15. Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
  16. Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
  17. Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
  18. Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
  19. Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Tissue PreparationImmunostainingMouse CraniofacialUndecalcified BoneCryosectioningImmunofluorescenceProtein DetectionGelatin EmbeddingAntibody StainingFluorescence Quantification

مقالات ذات صلة