وهنا، نقدم البروتوكولين الملحقين بتحويل نباتات البطاطا. تحويل tumefaciens المتبعة يؤدي إلى مصنع وراثيا كاملة في حين rhizogenes المتبعة تنتج جذور شعر المعدلة وراثيا في تبادل لإطلاق النار نوع البرية يمكن أن منشور ذاتيا. ثم يمكننا الكشف عن نشاط المروج غوس تلطيخ في جذور محولة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
توميفاسينس المتبعة و rhizogenes المتبعة-بوساطة التحول من البطاطا ونشاط المروج الجين صابرين ب Staining غوس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Sp. المتبعة إحدى الطرق الأكثر استخداماً للحصول على النباتات المعدلة وراثيا، كما أن لديها القدرة على نقل وإدماج الخاصة تي-الدنا في الجينوم المصنع. هنا، نحن نقدم اثنين من أنظمة التحويل تعديلها وراثيا نباتات البطاطس (البطاطا). في تحول A. tumefaciens ، مصابون بأوراق ويتم تحديد الخلايا المحولة ويتم إعادة إنشاء محطة جديدة لتحول كاملة باستخدام فيتوهورمونيس في 18 أسبوعا. في رهيزوجينيس (أ) التحول، مصابون ينبع عن طريق حقن البكتيريا بإبرة وجذور شعر تحول ظهرت جديدة يتم الكشف عنها باستخدام علامة نيون أحمر وتتم إزالة جذور عدم تحويلها. في 5-6 أسابيع، المصنع الناتجة مركب من نوع البرية تبادل لإطلاق النار مع جذور شعر تحول نمواً كاملا. يمكن لزيادة الكتلة الأحيائية، اقتطعت جذور شعر محولة والذاتي نشر. ونحن تطبيق كلا التحول الأساليب المتبعة-بوساطة للحصول على جذور التعبير عن الجينات مراسل غوس يقودها أحد المروجين جينات السكروز صابرين. يرد الإجراء المصبوغة غوس ويسمح التعريب خلية التعريفي المروج. في كلتا الطريقتين، أظهرت أن جذور البطاطا تحول غوس تلطيخ في endodermis سوبيريزيد واكسوديرميس، بالإضافة إلى ذلك، في جذور رهيزوجينيس (أ) تحول النشاط غوس اكتشفت أيضا في ظهور الجذور الجانبية. وتوحي هذه النتائج أن رهيزوجينيس أ- يمكن أن تكون أداة سريعة بديلة لدراسة الجينات التي يتم التعبير عنها في جذور.
المقدمة
وبصرف النظر عن الفائدة الاقتصادية، جيل النباتات المعدلة وراثيا وقد أهميته الخاصة في البحث لإظهار وظيفة الجينات في نهاية المطاف، وفهم أفضل لفسيولوجيا النبات والتنمية. الأكثر استخداماً الأسلوب لمصنع الإدراج الحمض النووي هو المتبعة-بوساطة التحويل. Tumefaciens المتبعة قادرة على توليد الصفراوات التاج في الأنسجة المصابة من العديد من الأنواع النباتية بفعل بلازميد (Ti) الأورام المسببة لها. بلازميد يحتوي على منطقة تي-الحمض النووي مع مجموعة من الجينات التي ستدمج في جينوم النبات والحث على الأنسجة ديديفيرينتييشن1،2. أتاح تبادل هذه الجينات داخل تي-الحمض النووي بالتحوير توليد تعديلات محددة مصنع تجنب التأثيرات المظهرية3. تيسيرا للتحوير الاستنساخ في تي-الحمض النووي، وقد تم اقتطعت منطقة تي-دنا في بلازميد مستقل يسمى بلازميد ثنائي، بينما الباقون جينات تي بلازميد (الجينات الفوعة التي تسمح لآليات نقل والإدراج تي-دنا) كانت وضع في بلازميد مساعد. لبحوث التكنولوجيا الحيوية النباتية، التحول من A. tumefaciens مزايا عديدة: لا تحتاج إلى أجهزة مكلفة، وقادرة على توليد تحول المصنع مستقرة وعابرة، وانخفاض عدد الجينات التي يتم دمج النسخ كروموسوم4. ومع ذلك، يتطلب توليد ترانسفورمانتس مستقرة لمعظم النباتات، ولكن لا نبات، تجديد المصنع من واحد أو بعض الخلايا باستخدام فيتوهورمونيس الخارجية، مما يجعل هذه العملية شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. ألف-رهيزوجينيس أيضا قادرة على تعديل جينوم النبات، إنتاج جذور شعر أو جذور العارض في مواقع الإصابة بسبب التعبير عن الجينات رول (الجذر المكاني) المشفرة في بلازميد (Ri) الذي يحفز الجذر5. على الرغم من الدراسة أقل من توميفاسينس أ، رهيزوجينيس أ- يستخدم أيضا للحصول على جذور المحورة وراثيا. في هذه الحالة، يتضمن rhizogenes أ الأصلي تي-الحمض النووي بلازميد Ri وبلازميد ثنائي مع ثانية تي-دنا تحمل التحوير. عندما يكون موقع الإصابة في ينبع أو هيبوكوتيلس، يمكن الحصول مصنع مركبة، مع جذور المعدلة وراثيا شعر الجديدة الناشئة من النوع المتوحش يطلق النار. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تنمو جذور تحول شعر مستقلة في المختبر في وسائل الإعلام مع الكربون مصدر المدخلات. استخدام رهيزوجينيس (أ) بدلاً من توميفاسينس (أ) لإنتاج الأنسجة المعدلة وراثيا يكتسب أهمية عند الجذر هو الجهاز المستهدف، لأن تجديد مصنع غير مطلوب ومن ثم أنها أسرع وأقل تكلفة. وقد أثبتت الدراسات السابقة هذه المنهجية المعتمدة لتوصيف المظهرية الجذر جينات محددة6،7،،من89.
البطاطس (البطاطا) هو رابع أهم محصول في العالم وفقا منظمة الأغذية والزراعة "الأمم المتحدة" (الفاو) منذ الدرنة أهميتها الغذائية للاستهلاك البشري لكونها مصدر جيد للفيتامينات والمعادن. ولهذا السبب، تم وضع في دائرة الضوء للتكنولوجيا الحيوية الزراعية البطاطا ويعتبر أيضا كنموذج جيد بيولوجية الجينية والتنموية الدراسات10،11. تحويل البطاطا ساهم مساهمة كبيرة في فهم الآليات الجزيئية الأنسجة سوبيريزيد الكامنة من خلال وصف الجينات المعنية صابرين والشمع الحيوي12،13،14 15، ،،من1617، النقل مونومر صابرين18 والنسخ البند19. صابرين فيرولويل ترانسفيراز الجينات، فهت، واحد من هذه الجينات السكروز تتسم؛ أن downregulation تثير ضعف قوية للحماية من بيريديرم، الذي يرتبط مع انخفاض قوي في اﻻسترات فيرولاتي من صابرين والشموع في البطاطا الدرنات14. في الوقت ذاته، أن الضربة القاضية لما أورثولوجوي المفترضة (أسفت/RWP1) في جذور وبذور نبات، أظهرت أيضا دورها في إنتاج الألكيل فيرولاتيس في سوبيرين،من2021. في البطاطا، الخط النسخي مراسل فهت وجسم فهت أظهرت على التوالي أن نشاط المروج والبروتين تقع في اكسوديرميس، endodermis، فيلوجين-المشتقات والأنسجة جرح15.
في هذا العمل، نحن التفصيل بروتوكول باستخدام رهيزوجينيس (أ) لإنتاج جذور شعر المعدلة وراثيا التي يتم الاحتفاظ بها في تبادل لإطلاق النار نوع البرية أو توليد نباتات البطاطا المركب اقتطعت لتنمو بصورة مستقلة في المختبر. كما أننا نقدم البروتوكول استخدام A. tumefaciens للحصول على نباتات كاملة من البطاطا المعدلة وراثيا. كدراسة حالة، تستخدم rhizogenes ألف و A. tumefaciens تحول مع ناقل ثنائي نفس الحصول على الجذور مع المروج فهت قيادة غوس مراسل الجينات. وأفادت النتائج ومقارنة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بروتوكول التحويل رهيزوجينيس (أ) تم تكييفها وتعديلها من القرن et al.7 وكان النمط الوراثي اختبار ssp البطاطا س. . البطاطا (عام ديزيريه). بروتوكول التحويل A. tumefaciens تم تكييفها وتعديلها من بانيرجي et al.22 والأنماط الجينية اختبار ssp البطاطا س. . البطاطا (عام ديزيريه) والبطاطا S. ssp. أنديجينا. الخطوات الرئيسية لكلا الإجراءين يرد في الشكل 1 والشكل 2، على التوالي.
ملاحظة: في جميع خطوات الإجراء إجراء التحويلات في المختبر ، القيام بذلك سريعاً، وعندما يكون ذلك ممكناً، الاحتفاظ بلوحات أو الأواني مغلقة، وبالتالي التقليل من تعرض النبات إلى الهواء لتجنب التلوث وذبول. خلاف ذلك، جميع إينكوبيشنز النبات تم القيام به في خزانات تحت ظروف ح 12 من ح الضوء/12 24 درجة مئوية 20 درجة مئوية الظلام و 67 µmol م-1 ق-1. خلاف ذلك، أداء جميع البكتيريا في المختبر والتلاعب مصنع التحويلات في ظروف معقمة في غطاء الاندفاق الصفحي. وترد جميع وصفات وسائل الإعلام للثقافات النباتية المتبعة و في المختبر في الجدول S1.
تنبيه: إيداع جميع البكتيريا المعدلة وراثيا والنباتات إلى حاوية النفايات المعتمدة.
1-الثقافات المتبعة المستخدمة لتحويل
ملاحظة: الضغط المستخدمة للتحول (أ) رهيزوجينيس C58C1:Pri15837 (يرجى قدمتها الدكتورة إنجي شقيق) وكانت توميفاسينس أ- GV2260 (يرجى قدمها الدكتور سالومي برات). وتحولت رهيزوجينيس أ مع ناقل ثنائي PK7GWIWG2_II-ريدروت (VIB وإدارة مصنع بيولوجيا الأنظمة في جنت ريي؛ http://gateway.psb.ugent.be) الذي يحتوي على تي-الحمض النووي تحمل علامة تحول رصد جذور شعر تشكيل. مقارنة جذور تحول المتولدة عن رهيزوجينيس أ و توميفاسينس أ، سواء تم تحويل مع pKGWFS7 المتجهات الثنائية التي تتضمن تي-دنا تحمل المروج فهت القيادة الجينات مراسل β-جلوكورونيداسي (غوس) والجينات المقاومة كاناميسين ك علامة اختيار15.
- اختيار مستعمرة المتبعة وتنمو بين عشية وضحاها (O/N) في 5 مل من يب المتوسطة وتستكمل مع المضادات الحيوية (S1 الجدول) في أنبوب 50 مل الطرد مركزي في 28 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
- لتحويل A. tumefaciens ، قياس الكثافة البصرية، الذي يجب أن يكون التطوير التنظيمي600 = 0.6-1.0.
- إذا كانت كثافة بصرية أعلى، جعل ثقافة فرعية خفضه إلى OD600 = 0.3 مع وسائط الإعلام الجديدة، والانتظار حتى يصل إلى الثقافة OD600 = 0.6-1.
- الطرد المركزي 1 مل ثقافة المتبعة في 3,000 س ز في مقاعد البدلاء-أعلى جهاز الطرد مركزي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المادة طافية بيبيتينج وريسوسبيند الخلايا في 1 مل من الطازجة المتوسطة يب دون المضادات الحيوية. كرر هذه الخطوة لضمان الإزالة الكاملة للمضادات الحيوية.
- A. tumefaciens التحول، في استثارة الماضي إضافة حجم يب المناسبة للحصول على كثافة بصرية نهائي OD600 = 0.8.
- تبقى الخلايا على الجليد أثناء إعداد النباتات للإصابة.
2-مصنع مواد للتحول
- إجراء واحد أو اثنين قصاصات الجذعية العقدة أما تتضمن قمي أو براعم مساعدة من العقيمة في المختبر نباتات البطاطا (المانحة النباتات)؛ تنمو لهم في المتوسطة الصلبة 2 مللي ثانية في الأواني لمدة 3 إلى 4 أسابيع (الشكل 1A و 2A الشكل).
3-مصنع التحويل باستخدام رهيزوجينيس (أ) (الشكل 1)
ملاحظة: يسمح هذا الإجراء الحصول على جذور شعر محولة. ويلزم لتقييم التعبير التحوير، عنصر تحكم سلبية. إعداد المراقبة السلبية، اتبع الإجراء استخدام عبئا rhizogenes) أ ( تناظري أو تحويلها مع ناقل فارغ يحتوي على الجينات علامة التحول.
- استخدام لوحات إعلامية جديدة؛ وبدلاً من ذلك، اللوحات يمكن الاحتفاظ في 4 درجات مئوية مع الجانب غطاء، مختومة محكم مع فيلم شفافة لتجنب الجفاف وسائل الإعلام. إعداد لوحات مربعة من وسائط الإعلام، انحدر منهم ~ 15°، التعبئة مع 40 مل من مرض التصلب العصبي المتعدد، والسماح لهم بترسيخ. وهذا سيقلل من جهة الاتصال الجوي جزء من المصنع مع المتوسط.
- نقل بعناية فائقة مصنع للجهات مانحة من متوسطة 2 مللي ثانية إلى لوحة مربعة 120 ملم × 120 ملم.
- حقن إلى ميكروليتر internode 3 الجذعية واحد لثقافة رهيزوجينيس (أ) باستخدام إبرة جراحية وكرر ذلك مرتين لكل مصنع في إينتيرنوديس مختلفة عندما يكون ذلك ممكناً.
ملاحظة: ينظر كل الحقن كحدث تحول مستقلة (الشكل 1B). - نقل فورا مصنع كامل لصفيحة مربعة مع الصلبة المتوسطة مرض التصلب العصبي المتعدد وتستكمل مع أسيتوسيرينجوني 0.1 ملم. استيعاب محطتين لكل لوح.
ملاحظة: حل الأسهم أسيتوسيرينجوني م 1 أعد [دمس]، ويمكن تخزينها في-20 درجة مئوية. - ختم اللوحة باستخدام الشريط الجراحي وترتيب عمودياً داخل مجلس الوزراء بنسبة لمدة 4 أيام.
- نقل المصنع إلى صفيحة مربعة جديدة مع MS المتوسطة تستكمل مع الصوديوم cefotaxime [500 ميكروغرام/مل] لقتل رهيزوجينيس أ.
- بعد 10-12 يوما، سوف تبدأ جذور شعر أن يظهر (الشكل 1،1 د). الرسوم الأصلية جذور النبات، ثم نقل المصنع إلى صفيحة مربعة جديدة مع مرض التصلب العصبي المتعدد المتوسطة وتستكمل مع cefotaxime الصوديوم [500 ميكروغرام/مل].
ملاحظة: يمكن التحقق جذور شعر محولة بالأسفار حمراء عند استخدام علامة تحول دسريد (3D الشكل). - للحصول على نبات مركب (الشكل 1E)، ترك جذور شعر المعدلة وراثيا تنمو لمدة 3-4 أسابيع في MS المتوسطة وتستكمل مع cefotaxime الصوديوم [500 ميكروغرام/مل] (التغير في المتوسط كل أسبوع).
- تبعاً للغرض، تنتشر جذور شعر المعدلة وراثيا وعناصر سلبية كما يلي.
- نقل المصنع كله مركب على تربة (S2 الجدول) أو التربة المتوسطة للسماح للتنمية الواسعة النطاق.
- فردي نشر جذور شعر تحولت، باستخدام مشرط قطع جذور معربا عن علامة التحول الأحمر نيون (بروتين دسريد) عندما يتم 4-8 سم (الشكل 1E) وتحويلها إلى طبق بتري مع B5 جامبورج الصلبة المتوسطة وتستكمل مع الصوديوم السكروز و cefotaxime 2% [500 ميكروغرام/مل]. ختم اللوحات مع الفيلم مختبر البلاستيك وتنمو لهم في الظلام في 20 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن التلاعب الجذور تحت ستيريوميكروسكوبي مجهزة للكشف عن الأسفار تحت ظروف معقمة (انظر الجدول للمواد). - لإنتاج الكتلة الحيوية (أي تحليل التعبير الجيني)، قطع جذر شعر طويل 5 سم ونشر ذلك في قارورة Erlenmeyer 150 مل مع 20 مل من B5 جامبورج متوسطة السائل وتستكمل مع الصوديوم السكروز و cefotaxime 2% [500 ميكروغرام/مل]. أنها تنمو لمدة 6 أسابيع في الظلام في 20 درجة مئوية و 60 لفة في الدقيقة.
الشكل 1: الجدول الزمني للحصول على البطاطس المعدلة وراثيا جذور شعر باستخدام رهيزوجينيس (أ)- وترد في الأسابيع التراكمي للوصول إلى كل مرحلة من مراحل عملية التحول والخطوات اللاحقة لتنمو جذور شعر. يصور صور الممثلة لمختلف مراحل: الشروع في هذه العملية منذ 3 أسابيع في المختبر باستخدام معامل العدوى (A)، ثم من النباتات عن طريق حقن رهيزوجينيس (أ) (ب)، تشكيل التكاثري الأنسجة (ج، الأسهم) مع جذور شعر الناشئة (د)، وجذور شعر المتقدمة معربا عن علامة التحول الأحمر نيون دسريد (E). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4-مصنع التحويل باستخدام توميفاسينس (أ) (الشكل 2)
ملاحظة: يسمح هذا الإجراء الحصول على نباتات محولة. لتقييم تأثير التحوير، هناك حاجة إلى عنصر تحكم سلبية. خيار واحد اتباع الإجراء باستخدام A. tumefaciens تحول مع متجه فارغة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام النباتات البرية نوع.
- قطع ونبات من النباتات 3-4 أسبوع من العمر (الشكل 2A) في طبق بتري. استخدام مشرط استبعاد سويقات وإجراء تخفيضات عرضية (1-3 اعتماداً على حجم ورقة) من مركز أوراق على حواف تجنب قطع لهم (الشكل 2).
- ضع ورقة تطفو على 10 مل من 2 مللي ثانية جديدة وسائل الإعلام السائلة في صحن بتري مع الجانب أباكسيال تصل على الفور وإغلاق اللوحة. كرر الخطوة استيعاب تصل إلى 15 يترك لعام ديزيريه ويترك 25 لموفرنديجينا (اعتماداً على حجم ورقة).
- فور إضافة 80 ميليلتر للثقافة A. tumefaciens OD600 = 0.8 في وسائل الإعلام السائلة وتجانسه لوحة يدوياً لمدة 1 دقيقة توزيع الحل البكتيرية.
- عناية ختم بختم الفيلم، وتغطي برقائق الألومنيوم واحتضانها لمدة يومين في غرفة عند 24 درجة مئوية للسماح للتحول الذي يحدث.
- نقل أوراق الحفاظ على الجانب أباكسيال تصل إلى CIM المتوسطة (الشكل 2B) واحتضانها لهم لمدة أسبوع واحد في نمو مجلس الوزراء.
- كشط المتوسطة CIM مع ملاقط حيث أنه يمكن استيعاب يترك أفضل في وسائل الإعلام.
- نقل أوراق الحفاظ على الجانب أباكسيال حتى سيم المتوسطة (الشكل 2) واحتضانها لهم في نمو مجلس الوزراء، منعش في المتوسط كل 7-10 أيام، حتى يطلق النار على حوالي 2 سم.
- كشط المتوسطة سيم مع ملاقط حيث أن يترك يمكن تكون محاطة تماما بوسائل الإعلام. عندما يطلق النار على ظهر تصل إلى الغطاء، العمل مع أطباق بيتري طويل القامة (100 × 20 مم، والارتفاع × قطر).
ملاحظة: سوف تشكل دشبذ بعد 2-3 أسابيع في المتوسط سيم (الشكل 2D) ويطلق النار على بعد 6-7 أسابيع (الشكل 2E). سوف تعتبر يطلق النار على أحداث التحول مستقلة عند ظهورها من دشبذ التي تكونت من الجروح مستقلة.
- كشط المتوسطة سيم مع ملاقط حيث أن يترك يمكن تكون محاطة تماما بوسائل الإعلام. عندما يطلق النار على ظهر تصل إلى الغطاء، العمل مع أطباق بيتري طويل القامة (100 × 20 مم، والارتفاع × قطر).
- قطع ثلاثة يطلق النار ظهر من كل دشبذ (يعتبر نفس الحدث التحول) (الشكل 2E)، نقل إليها قوارير الثقافة مع المتوسطة مغ تستكمل مع cefotaxime الصوديوم [250 مغ/لتر] للسماح لتأصيل، تسمية مجموعة فرعية مع عدد و احتضان في نمو مجلس الوزراء لمدة 3-4 أسابيع أو حتى يطلق النار على قوي (الشكل 2 واو).
ملاحظة: عند قطع يطلق النار، إزالة جيدا دشبذ خلاف ذلك لن يشكل الجذر.- كرر هذه الخطوة عدة مرات كما يلزم خطوط مستقلة. ما يصل إلى 5 التحول مختلفة يمكن وضع الأحداث في قارورة ثقافة التي يبلغ قطرها 8 سم العمل بثقة كاملة أن النباتات من أحداث مختلفة غير مختلطة.
- حدد المصنع أقوى من كل حدث، وقص الجزء قمي من تبادل لإطلاق النار مع إينتيرنوديس 3-4 ووضعه في قارورة ثقافة جديدة مع متوسطة 2 مللي ثانية تستكمل مع cefotaxime الصوديوم [250 مغ/لتر].
ملاحظة: في 3-6 أسابيع سوف ينمو النبات كفاءة، تطوير تبادل لإطلاق النار قوي والجذور.- أن يعود إلى الدائرة يطلق النار غير المحددة حتى وضعت المصنع المحدد تماما.
- قطع شرائح الجذعية من نبات internode واحد على الأقل أو مع براعم قمي ونقلها إلى متوسطة 2 مللي ثانية جديدة تستكمل مع cefotaxime [250 مغ/لتر]. احتضان لهم في نمو مجلس الوزراء.
- إجراء نسخ متماثل كل 3-4 أسابيع إنشاء خطوط في المختبر تحول.
ملاحظة: الصوديوم cefotaxime المسبق في التحويلات اللاحقة على الأقل ثلاثة إلى متوسط 2 مللي ثانية للتأكد بقتل توميفاسينس (أ)؛ وبعد ذلك، إذا لوحظ فرط A. tumefaciens ، نقل النباتات مرة أخرى إلى 2 مللي ثانية وسائل تستكمل مع الصوديوم cefotaxime.
- إجراء نسخ متماثل كل 3-4 أسابيع إنشاء خطوط في المختبر تحول.
- لتحديد خصائص النمط الظاهري النبات، نقل النباتات للتربة لما وصف كامل أو لثقافة الزراعة المائية لفحص الجذر.
- إبقاء الدرنات المنتجة في التربة بنشر والحفاظ على الخطوط الثابتة.
الشكل 2: الجدول الزمني للحصول على البطاطس تحول النباتات باستخدام توميفاسينس أ. تظهر في الأسابيع التراكمي للوصول إلى كل مرحلة من مراحل عملية التحول والخطوات اللاحقة لزراعة النباتات. يصور صور الممثلة لمختلف مراحل: الشروع في العملية باستخدام أوراق من النباتات في المختبر القديم الأسبوع-3 ()، ويترك نقل الجرحى والمصابين إلى وسائل الإعلام CIM (ب)، يترك عند نقلها إلى سيم وسائط الإعلام (ج)، والتصور من دشبذ حول المناطق الجرحى بعد 2-3 أسابيع في وسائل الإعلام (د) سيم، وتشكيل تبادل لإطلاق النار بعد 9-11 أسبوعا في سيم الوسائط (ه) ويطلق النار بعد نقله إلى مغ وسائط الإعلام (F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5-تربة الثقافة
- إعداد حل تعرضنا لقوام نصف (0.5 x) (الجدول S2) في دلو 10 لتر.
- تزج مضخة ماء للحفاظ على التجانس والظروف المناسبة الأكسجين.
- وتغطي جدران الدلو مع رقائق الألومنيوم تنمو الجذور في الظروف المظلمة.
- تجنب الأضرار الجذرية، نقل النباتات في المختبر للثقافة المائية.
ملاحظة: إزالة أي المتبقية في المختبر المتوسطة من الجذور لتجنب انتشار الكائنات الدقيقة خلال الحضانة التي تهز بعناية الجذور مغمورة بالمياه. - وتغطي النباتات مع فيلم شفاف مثل glasshouse للسماح للتأقلم الكافي واحتضان في قاعة المتنامية.
- جعل ثقوب في الفيلم بعد 3 أيام وإزالته تماما بعد أسبوع واحد.
- استبدال وسائط جديدة كل 10 أيام.
6-فحص الجينات مراسل histochemical غوس
ملاحظة: أجرى التحليل في حالتنا جوس مع جذور من 2-3 أسابيع نمت في الزراعة المائية أو في المختبر.
- إصلاح الجذور مع 90% مبردة الأسيتون (v/v)، وتبني عليه لمدة 20 دقيقة على الجليد.
- أداء الغسالات اثنين مع الماء المقطر.
- إضافة جوس الطازجة تلطيخ الحل (الجدول 1) وتطبيق فراغ (-70 السلطة الفلسطينية) لمدة 20 دقيقة.
- احتضان عند 37 درجة مئوية في الظلام لحماية غوس حساس ح 4 أو حتى مرئياً لون أزرق.
ملاحظة: وجود فيري-وفيروسيانيد في جوس الحل التقليل من نشر نواتج التفاعل وتقديم الترجمة أكثر دقة.
تحذير: استخدام غطاء دخان، وارتداء الملابس الواقية عند التعامل مع مشتقات السيانيد السامة في حل غوس (سيانيد البوتاسيوم وفيروسيانيد البوتاسيوم). وينبغي التخلص منها الركيزة غوس والمواد المتاحة بأمان. - إزالة غوس تلطيخ الحل وتخلص منه في حاويات مناسبة.
- أداء الغسالات اثنين مع الإيثانول 70% (v/v).
- مراقبة تحت مجهر حقل مشرق.
ملاحظة: غوس تلطيخ مستقر لبضعة أسابيع؛ ومع ذلك، خلال الأسبوع الأول، إشارة غوس واضح، وينشر أقل في الخلايا المجاورة. لتخزين أطول، ختم الأنبوب وتخزينها في 4 درجات مئوية.
الجدول 1: وصفه الحل المصبوغة غوس.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
رهيزوجينيس المتبعة -بوساطة تحويل البطاطا
ويرد في هذه المخطوطة، الإجراء خطوة بخطوة للحصول على الجذر المحولة مع رهيزوجينيس أ . الشكل 1 نظرة عامة من الإجراءات، التي تحيط بالإجمال حوالي 5-6 أسابيع (من حقن أ رهيزوجينيس للحصول على جذور شعر نمواً كاملا). ثم، يمكن دراسة المصنع كمركب (نوع البرية تبادل لإطلاق النار، والجذر المعدلة وراثيا) أو جذر شعر...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في البطاطا، يستخدم النظام الأكثر شيوعاً للحصول على النباتات المعدلة وراثيا كاملة مستقرة التحول بسلالات tumefaciens المتبعة التي تتطلب أورجانوجينيسيس باستخدام فيتوهورمونيس الخارجية. على الرغم من أن البروتوكولات المتبعة على أساس لديه القدرة على دمج متجه غير-تي-الحمض النووي التسلسل25، هذه المنهجية يتوفر لا يزال أسهل وأقل تكلفة لتحويل نباتات البطاطا. خلال السنوات الماضية، المصلحة في رهيزوجينيس (أ)-تحول الوساطة قد حصلت على اهتمام الباحثين للسماح للحصول على جذور المعدلة وراثيا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
شكر وتقدير
هذا العمل كان يدعمها y Innovación دي وزارة العلوم (AGL2009-13745، منحة الاستثمار في الحوافظ المالية للجريدة الرسمية) ص دي وزارة الاقتصاد كومبيتيتيفيداد و FEDER التمويل (AGL2012 36725، AGL2015-67495-C2-1-R) وجامعة جيرونا (منحة الدكتوراه لسادس، ومنحة SING11/1). الكتاب ممتنون للدكتور إنجي شقيق (معهد "استخدام الأراضي"، جامعة روستوك، روستوك، ألمانيا)، والدكتور سالومي برات (Centro ناسيونال دي الفن التكنولوجيا الحيوية، مدريد، إسبانيا) لتوفير رهيزوجينيس (أ) وسلالة توميفاسينس (أ) ، على التوالي، والدكتور مارسال سولير والدكتورة أنا بلاسينثيا للمساعدة والدعم الذي تتلقاه في الشروع في تجارب التحول رهيزوجينيس ألف (جامعة تولوز الثالث بول ساباتييه-يزار، ومختبر البحوث النباتية (لرسف)، كاستانيت التخصص، فرنسا). يشكر المؤلفون سارة غوميز (خلية دي بيولوجيا، UdG، جيرونا) لمساعدتها القيمة في الاضطلاع بالأعمال المختبرية والعناية بالنباتات، وفونتديكابا فيران وكارلا سانشيز الذي ساعد مع بعض التجارب بينما كانوا يفعلون مشاريعها الدرجة النهائية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| < ص>الأسيتون < / ص > | < ص > بانريك < / ص > | < ص > 1.310.071.21 < / ص > | |
| < ص>أسيتوسيرينغون < / ص > | < ص > أكروس < / ص > | < ص >115540050< / ص >< | |
| ص > مضخة حوض السمك < / ص >< | ص > Prodac < / p > | < p>MP350 < / p > | |
| الأوتوكلاف < / p> | < ص > راجبا ستريليماتيك < / ص > | < ص >< / ص > | |
| < ص > أجار بكتريولوجي < / ص > | < ص > مختبر كوندا < / ص > | < ص > 1800 < / ص > | |
| < ص > ب < / ص > | < ص > دوشيفا < / ص >< | ص > B0904 < / ص | |
| < ص > مستخلص اللحم البقري < / ص > | < ص > مختبر كوندا < / ص > | < ص>1700 < / ص > | |
| < ص>خزانة زراعة النباتات < / ص > | < ص > Nuaire < / ص > | < ص >< / ص >< | |
| ص > كاربينيسيلين < / ص > | < ص > دوشيفا < / ص > | < ص > C0109 < / ص > | |
| < ص > سيفوتاكسيم الصوديوم < / ص > | < ص > دوشيفا < / ص > | < ص > C0111 < / ص > | |
| < ص > DMSO< / ص > | < ص > ميرك < / ص > | < ص >1029310161< / ص > | |
| < ص > إيكوترون إنفورز < / ص >< | ص > HT < / ص > | < ص > 29378 < / ص > | |
| < ص > الإيثانول < / ص | > < ص > ميرك < / ص > | < > 1،009،831،011 < / ص > | |
| ص > أنبوب الصقر < / ص > | < ص > التحكم في التكنولوجيا < / ص> | < ص >CFT011500< / ص > | |
| < ص > فيريسيانات < / ص > | < ص > سيجما < / ص > | < ص >101001081< / ص > | |
| < ص > فيروسيانات < / ص >< | ص > سيجما < / ص > | < ص >100979088< / ص > | |
| قارورة < بقطر >8.06 سم وارتفاع 11.3 سم) وغطاء بلاستيكي لثقافة in vitro < / em > ثقافة< / ص> | <ص>Apiglass< / p> | ref16< / p> | |
| GA3< / p> | Sigma< / p> | G7645< / p> | |
| Gamborg B5 media< / p> | Duchefa< / p> | G0210< / p> | |
| Gelrite< / p> | Duchefa< / p> | < p>G1101< / p> | |
| Glucosa< / p> | Sigma< / p> | G5767< / p> | |
| Kanamycin< / p> | Sigma< / p> | K1377< / p> | |
| Leukopor tape< / p> | BSN Leukopor< / p> | BDF47467< / p> | |
| Lupe< / ص > | < ص > وايلد هيربروج < / ص > | < ص > M420 < / ص > | |
| < ب > شاكر مغناطيسي < / ص > | < ص > Agimatic < / ص > | < ص >7000243< / ص > | |
| < ص > هيدرات < / ص > | < ص > سيجما < / ص > | < ص > M2933-25G < / p > | |
| < p>MgSO4< / sub>< / p> | Panreac< / p> | 131404< / p> | |
| Microscope< / p> | Olympus< / p> | < / p> | |
| Minufugue 5415R< / p> | Eppendorf< / p> | < p> | |
| Murashige and Skoog media< / p> | Duchefa< / p> | M0254.0050 | |
Na2HPO4 | Panreac | 131679 | |
| NAA | Duchefa | N0903 | |
| NaCl | Panreac | 131659< / p> | |
NaH2PO4 | Sigma | 58282 | |
| NightSea Stereo | SFA Moonting Adapter | ||
| Parafilm | < ص>أنورسا < / ص > | < ص > PRFL-001-001 < / ص > | |
| < ص > بيبتون < / ص | > < ص > لاب كوندا < / ص > | < ص > 1616 < / ص > | |
| < ص > أطباق بتري (90 × 14) < / ص >< | ص > أنورسا < / ص > | < ص > 200200 < / ص > | |
| < ص > pHmetre < / p> | < p> Crison < / p> | < ص>< ص> | |
| <ص>فيتوترون< / ع> | <ص>إنكوا | RFTI-R5485 | |
| Plant Agar | Duchefa | P1001 | |
| Refrigeratot | Liebherr Medline | ||
| Rifampicin | Duchefa< / p> | R0146< / p> | |
| Spectinomycin< / p> | Sigma< / p> | 59007 < / p> | |
| Spectrophotometer< / p> | Shimadzu < / p> | < / p> | |
| لوحات مربعة (120 × 120) < / p> | Deltalab< / p> | < ع>200204< ع> | |
| < ص>الستربتومايسين< / ع> | < ص>سيجما< ص> | < ص>S6501< / ص> | |
| السكروز< / ص> | Panreac< / p> | 131621< / p> | |
| الشفرات الجراحية< / p> | Swann-Morton< / p> | 201< / p> | |
| إبرة جراحية< / ص > | < ص > نيبرو < / ص > | < ص > 015/0204 < / ص > | |
| < ص > Triptone < / p >< | p >Lab Conda < / p > | < p > 1612 < / p > | |
| < p > Triton < / p > | < p>Serva < / p >< | p> 37240 < / p | |
| < p>Unimax 1010 shaker < / p > | < p> Heidolph < / p> | < ص >< / ص > | |
| < ص > فراغ < / ص > | < ص > دينكو < / ص > | < ص >< / ص > | |
| < ص > × GlcA (5-برومو -4-كلورو -3-إندوكسيل بيتا د حمض جلوكورونيك ، ملح الصوديوم اللامائي ) < / ص > | < ص > المركب الحيوي < / ص > | < ص > ب - 7398 < / ص > | |
| < ص > مستخلص الخميرة < / ص > | < ص > مختبر كوندا < / ص > | < ص> 1702.00< / ص > | |
| < ص >زيتين ريبوسيد < / ص > | < ص > سيجما < / ص | > < ص >1001042850< / ص> |
المراجع
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm's water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. Behavior. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
