يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

أتاك-seq المقايسة مع الحمض النووي منخفضة التلوث من الابتدائي البشرية CD4 + تي الخلايا اللمفية

12.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59120

⸱

مارس 22, 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Department of Computer Science and Engineering, University of California San Diego, 3Bioinformatics Program, Boston University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتنفيذ مقايسة الكروماتين ترانسبوساسي موجوداً التسلسل (أتاك-seq) على تنشيط اللمفاويات CD4 + البشرية. لقد تم تعديل البروتوكول للتقليل من تلوث الميتوكوندريا الحمض النووي ما يلي: من 50% إلى 3% من خلال إدخال مخزن مؤقت تحلل الجديدة.

الملخص

وأصبح أتاك-seq منهجية مستخدمة على نطاق واسع في دراسة التخلق بسبب نهجها سريعة وبسيطة لرسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً. في هذه الورقة نقدم بروتوكولا أتاك-seq محسنة تقلل تلوث الميتوكوندريا الحمض النووي ما يلي:. بينما ناضلت البروتوكولات أتاك-seq السابقة مع يقرأ بمعدل 50% تلويث الحمض النووي، تحلل الأمثل المخزن المؤقت في هذا البروتوكول يقلل من تلوث الحمض النووي mitochondrial إلى متوسط 3%. يسمح هذا البروتوكول أتاك-seq محسنة لتخفيض تكلفة التسلسل قريب 50%. ونحن تثبت كيف يمكن إعداد هذه المكتبات أتاك-seq عالية الجودة من تنشيط خلايا CD4 + الخلايا الليمفاوية، توفير إرشادات خطوة بخطوة من اللمفاويات عزل خلايا CD4 + من الدم كله من خلال تحليل البيانات. هذا البروتوكول أتاك-seq تحسين قد تم التحقق من صحتها في طائفة واسعة من أنواع الخلايا، وسوف يكون للاستخدام الفوري للباحثين الذين يدرسون إمكانية الكروماتين.

المقدمة

سرعان ما أصبحت المقايسة الكروماتين ترانسبوساسي موجوداً التسلسل (أتاك-seq) الأسلوب الرائد لاستجواب العمارة الكروماتين. أتاك-seq يمكن تحديد مناطق الكروماتين موجوداً من خلال عملية تاجمينتيشن، وتفتيت ووضع علامات على الحمض النووي من الإنزيم نفسه، لإنتاج المكتبات التي يمكن تحديد تسلسل الكروماتين إمكانية الوصول عبر جينوم أكمله. هو توسط هذه العملية تاجمينتاتيون ترانسبوساسي Tn5 مفرط، مما يقطع فقط فتح مناطق الكروماتين بسبب عائق الفراغية نوكليوسوميك. كما أنه يخفض، ترانسبوساسي Tn5 أيضا بإدراج تسلسل المحولات التي تسمح ببناء مكتبة السريع ببكر وتسلسل الجيل القادم من الكروماتين موجوداً على نطاق الجينوم1،2.

وقد أصبح أتاك-seq الأسلوب المفضل لتحديد مناطق الكروماتين إمكانية الوصول إلى سبب بروتوكول بسيط وسريع نسبيا، ونوعية ونطاق المعلومات التي يمكن تحديدها من نتائجها، وكمية صغيرة من ابتداء من المواد المطلوبة. مقابل seq الدناز3 (الذي يقيس أيضا إمكانية الحصول على نطاق الجينوم الكروماتين)، seq منسى4 (الذي يحدد مواقف نوكليوسومي في المناطق المفتوحة الجينوم)، وفورمالدهايد بوساطة فير-seq5، أتاك-seq أسرع، أرخص وأكثر استنساخه1. كما أنها أكثر حساسية، العمل مع ابتداء من المواد لعدد قليل من نويات 500، بالمقارنة مع الأنوية 50 مليون المطلوب ل seq الدناز3. وقد أتاك-seq أيضا القدرة على تقديم مزيد من المعلومات حول بنية الكروماتين من الأساليب الأخرى، بما في ذلك مناطق ملزمة عامل النسخ، نوكليوسومي لتحديد المواقع، و مناطق الكروماتين المفتوحة1. تم التحقق من بروتوكولات seq أتاك الفعال، خلية واحدة، تقديم معلومات عن العمارة الكروماتين في خلية واحدة المستوى6،7.

وقد استخدمت أتاك-seq لتوصيف العمارة الكروماتين عبر طائفة واسعة من أنواع البحوث والخلايا، بما في ذلك النباتات8،9من البشر، والعديد من الكائنات الحية الأخرى. كما كان حاسما في تحديد لائحة جينية للمرض الدول7. ومع ذلك، يشمل البروتوكول أتاك-seq الأكثر استخداماً العيب الرئيسي التلوث قراءة تسلسل الحمض النووي. في بعض مجموعات البيانات، ويمكن أن يكون هذا مستوى التلوث تصل إلى 60 في المائة من تسلسل النتائج1. وهناك جهد متضافر في الحقل لتقليل هذه القراءات المتقدرية تلويث بغية السماح للتطبيق أكثر كفاءة من أتاك-seq7،،من1011. هنا نقدم بروتوكولا أتاك-seq محسنة يقلل من معدل التلوث الحمض النووي mitochondrial إلى 3 في المائة فقط، مما يتيح الحد من حوالي 50% في تسلسل تكاليف10. أصبح هذا ممكناً من خلال عملية مبسطة اللمفاويات عزل خلايا CD4 + والتنشيط ومؤقت تحلل تحسن مهم في التقليل من تلوث الحمض النووي mitochondrial.

وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول seq موديفيداتاك مع مجموعة واسعة نطاق من الخلايا الابتدائية، بما فيها البشرية الدم المحيطي الابتدائي الخلايا وحيدات النوى (ببمكس)10ووحيدات الأساسية البشرية والخلايا الجذعية الماوس (غير منشور). فقد استخدمت أيضا بنجاح استجواب خطوط خلايا سرطان الجلد في شاشة يكرر المتناوب قصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) متفاوت المسافات من العناصر غير الترميز11. بالإضافة إلى ذلك، توفر الحزمة تحليل البيانات المبينة في هذا البروتوكول، وقدمت في GitHub الباحثين الجدد وذوي الخبرة مع أدوات لتحليل البيانات أتاك-seq. أتاك-seq هو التحليل الأكثر فعالية لتعيين الكروماتين إمكانية الوصول عبر جينوم أكمله والتعديلات على البروتوكول القائمة التي يتم إدخالها هنا ستسمح للباحثين لإنتاج بيانات عالية الجودة مع انخفاض التلوث الحمض النووي mitochondrial، تخفيض تكاليف التسلسل وتحسين الإنتاجية أتاك-seq.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يوفر هذا البروتوكول تحسين الإرشادات خطوة بخطوة لأداء أتاك-seq لخلايا CD4 + الخلايا الليمفاوية، من المواد بدءاً من الدم كله من خلال تحليل البيانات (الشكل 1).

1-عزل خلايا CD4 + تي الخلايا من الدم كله

ملاحظة: انطلاق المواد لهذا البروتوكول 15 مل دم كله الطازجة التي تم جمعها باستخدام الإجراءات القياسية، السماح لمصدر المواد البداية ليتم تحديده استناداً إلى متطلبات البحوث. نطاق البروتوكول حسب الحاجة. فوسفات الحارة قبل مخزنة المالحة (PBS) + 2% مصل العجل الجنين (FCS) بدرجة حرارة الغرفة (RT) وضبط أجهزة الطرد المركزي إلى RT قبل بدء الإجراء تخصيب خلية CD4 + T.

  1. إضافة ميليلتر 750 البشرية CD4 + تي خلية الإثراء كوكتيل إلى 15 مل دم كله في أنبوب 50 مل مخروطية والمزيج بلطف بانعكاس. تبني على RT لمدة 20 دقيقة. عند الانتهاء من الحضانة، إضافة 15 مل من برنامج تلفزيوني + FCS 2% إلى الأنبوب وتخلط بلطف بانعكاس.
  2. إعداد أنبوب مخروطي طازجة 50 مل مع 15 مل من الكثافة المتوسطة. طبقة العينة الدم المخفف على الأعلى من متوسط الكثافة، ويجري التأكد من عدم تعطيل الواجهة الكثافة المتوسطة/الدم الذي يشكل بعناية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1200 × ز و RT بالتعجيل بتعيين إلى 1، والفرامل تنازلي قبالة.
    ملاحظة: من المهم تعيين التسارع إلى 1 وتنازلي الفرامل قبالة في النابذة تفادي تعطل طبقة خلية في المتوسط الكثافة.
  3. جمع الخلايا CD4 + T المخصب من واجهة البلازما المتوسطة/كثافة استخدام ماصة نقل جذعية ضيق. نقل الخلايا التي تم جمعها إلى أنبوب مخروطي طازجة 50 مل. الطرد المركزي الخلايا CD4 + T التي تم جمعها لمدة 8 دقائق في 423 × ز والرايت
    ملاحظة: تأكد من العودة تسريع أجهزة الطرد المركزي إلى الفرامل 9 وتنازلي بشأن الخطوة 1.3 وكافة الخطوات التالية.
  4. تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه خلية مرتين مع 50 مل من برنامج تلفزيوني + FCS 2%، سينتريفوجينج لدقيقة 8 423 x ز وتجاهل الرايت المادة طافية النهائي تغسل وتعليق بيليه خلية غسلها في 2 مل من برنامج تلفزيوني + FCS 2%.
  5. حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. للمتابعة مع أتاك-seq، انتقل إلى الخطوة 2، 3. لتجميد الخلايا للمعالجة فيما بعد، تابع إلى الخطوة 1، 6.
  6. أضف 1 مل من الطازجة المتوسطة التجميد (FCS 90% + 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد) كل الخلايا 1 مليون. 1 مل الكوة الخلايا في تجميد المتوسطة في الأنابيب المبردة آمنة. ضع الأنابيب في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاوية تجميد بطيء. وفي اليوم التالي نقل أنابيب للنتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: سوف تكون خلايا CD4 + "تي" 1 مليون معزولة الواحدة 2 مل حجم الأصلي للدم كله. تجميد الخلايا 500,000 في مختبرين 1 مل من تجميد المتوسطة. جعل المتوسطة تجميد جديدة في كل استخدام.

2-تفعيل ونق ر خلايا CD4 +

ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول السريع لتفعيل وتنقية خلايا CD4 + T فقط ح 48 والنتائج في 95% قابلة للاستمرار، بتنشيط خلايا CD4 + T. بارد الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية قبل البدء بالبروتوكول.

  1. ذوبان الجليد قنينة 1 (500,000) من خلايا CD4 + T في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى مجرد قد ذاب الجليد. بلطف بنقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 9 مل من حرارة قبل الوسائط روزويل بارك التذكاري المعهد-1640 (ربمي-1640) تستكمل مع السفح 10%، يشار إلى ربمي كاملة.
    ملاحظة: لا تدع الخلايا ذوبان الجليد تماما لتجنب التعرض إلى [دمس].
  2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقيقة في 1500 x ز و 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وتعليق بيليه برفق في 2 مل ربمي كاملة. كرر وتدور إلى أسفل وتجاهل المادة طافية، وتعليق الخلايا في 0.5 مل ربمي كاملة بلطف.
  3. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. ضبط كثافة تعليق خلية مع ربمي كاملة لوحة خلايا 50,000 في 200 ميليلتر كل من لوحة أسفل جولة 96-جيدا جيدا.
    ملاحظة: من أنبوب المجمدة واحد ك 500 CD4 + "تي" الخلايا، لوحة 10 آبار 50,000 خلايا CD4 + T في 200 ميليلتر كل بئر.
  4. إعداد المغناطيسي الخرز مترافق مع البشرية المنشط تي-CD3 المضادة ومكافحة CD28 الأجسام المضادة.
    1. الكوة ميليلتر 12.5 من حبات المنشط تي-CD3/CD28 البشرية كل عينة أتاك-seq لأنبوب 1.5 مل. أغسل الخرز مع 1 مل من 1 x PBS ووضع الأنبوب في مغناطيس لمدة 1 دقيقة.
    2. بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية واضحة وإزالة الأنبوب من المغناطيس، وتعليق الخرز في 13 ميليلتر الكامل ربمي كل عينة أتاك-seq.
      ملاحظة: حساب كمية الخرز اللازمة استناداً إلى عدد العينات seq أتاك يجري تجهيزها. ويتطلب هذا البروتوكول 12.5 ميليلتر من حبات CD3/CD28 كل الخلايا 500,000، الذي يشكل أحد أتاك-seq عينة.
  5. تنشيط خلايا CD4 + T. جمع الخلايا 500,000 في 2.1 مل متوسطة ربمي كاملة في أنبوب مخروطي 15 مل وإضافة 12.5 ميليلتر من حبات المنشط تي البشرية قبل غسلها. المزيج بلطف بعكس الأنبوب.
  6. نقل الخلايا مع الخرز بلطف إلى عقيمة ميليلتر 200 خزان ولوحة الخلايا مع الخرز الواحدة جيدا من أسفل جولة لوحة 96-جيدا باستخدام ماصة متعدد القنوات. احتضانها ح 48 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة.
  7. مرحلة ما بعد الحضانة، والطرد المركزي لوحة 96-جيدا لمدة 8 دقائق في 423 × ز والرايت إزالة 100 ميليلتر من المتوسطة الواحدة وكذلك من لوحة 96، حسنا، جمع إلى أنبوب مخروطي قبل تجاهل لضمان عدم فقدان حبة. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميليلتر 100 المتبقية، وجمع كل شيء في أنبوب 1.5 مل.
    ملاحظة: سيتم جمع 10 آبار لتنشيط خلايا تي في وحدة تخزين 1 مل.
  8. أداء CD4 + العزل. إضافة 50 ميليلتر من قبل غسلها CD4 مترافق الخرز إلى خلايا 500,000 في 1 مل ربمي كاملة. دمج خلايا والخرز ماصة. احتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في الثلاجة. تحرض الخرز وخلية الخليط كل 6 دقيقة.
    ملاحظة: هذا البروتوكول استخدامها لنموذج واحد من الخلايا 500,000. ضبط حسب الضرورة لعينات اثنين أو أكثر من 000 500 دولار.
  9. عند اكتمال الحضانة، ضع الأنبوب على المغناطيس لإزالة الحد الأدنى 2 وتجاهل المادة طافية عندما واضحة. تغسل حبة ربط الخلايا بإزالة الأنبوب من المغناطيس وتعليق الخلايا حبة زمنياً في 1 مل من برنامج تلفزيوني + FCS 2% واستبدال الأنبوب في المغناطيس لمدة 1 دقيقة، وتجاهل المادة طافية واضحة. كرر هذه العملية لما مجموعة 3 يغسل.
    ملاحظة: احرص على عدم تجاهل أي حبات خلال يغسل.
  10. بعد الغسيل النهائي، ضع الأنبوبة في المغناطيس للحد الأدنى 1 إزالة وتجاهل المادة طافية ومكان بيليه على الجليد. انتقل إلى القسم 3 (أتاك-seq).

3-أتاك-seq

ملاحظة: في هذه الخطوة، نواة معزولة من تنشيط خلايا CD4 + T لما يليها أتاك تم تحسين تحلل المخزن المؤقت المستخدم في هذا البروتوكول أن يكون الطف على الأنوية، مما أدى إلى هضم أكثر كفاءة وأعلى جودة النتائج. يتم تنفيذ كافة الخطوات الطرد المركزي في القسم 3 بالطرد مركزي زاوية ثابتة الإبقاء على 4 درجة مئوية. بارد الطرد المركزي قبل البدء بالبروتوكول.

  1. إجراء العزل الأنوية. ريسوسبيند الخرز والخلايا مع تحلل الباردة المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4، 10 مم كلوريد الصوديوم، 3 مم MgCl2، بوليسوربيت 0.03% 20). الطرد المركزي فورا في 500 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة وتجاهل المادة طافية.
  2. القيام برد فعل ترانسبوساسي. تعليق بيليه نواة معزولة مع 50 ميليلتر من Tn5 ترانسبوساسي ميكس (الجدول 1). احتضان في ثيرموسيكلير مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع غطاء 40 درجة مئوية، عقد في 4 درجات مئوية عند الانتهاء.
  3. بعد ثيرموسيكلينج، فورا أداء تدور الطرد مركزي benchtop سريعة إلى أسفل ومكان الأنبوب في المغناطيس لمدة 1 دقيقة لإزالة الخرز من المنتج.
  4. نقل المادة طافية واضحة من الأنبوب في المغناطيس لعمود تنقية الحمض النووي. أغسل العمود مرة واحدة مع 250 ميليلتر من "الجريدة الرسمية المخزن المؤقت" ومرتين مع ميليلتر 750 من PE المخزن المؤقت. الوت العينة في 10 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت. انتقل مباشرة إلى الخطوة 3.5.
    ملاحظة: يضاعف هذه الخطوة الشظايا من الحمض النووي مع محولات الواصلة، يشار إليه هنا المكتبة أتاك-seq. من أجل متعدد عدة مكتبات أتاك-seq ليتم تشغيله على أحد خ ع لين، استخدام غير مفهرسة التمهيدي 1 لجميع العينات و 2 التمهيدي المفهرسة المختلفة للعينات الفردية (الجدول 2). وتستخدم كبسولة تفجير في العمل تركيزات ميكرومتر 1.25.
  5. قم بإعداد رد الفعل التضخيم بكر الأولى في أنبوب بكر نوكلاس خالية، الجمع بين المكونات الموجودة في النظام، ووحدة التخزين المحددة في الجدول 3- ضع الأنبوب بكر إلى ثيرموسيكلير وتشغيل البرنامج التضخيم PCR مع ظروف ركوب كما هو محدد في الجدول 4.
  6. مراقبة رد فعل عن طريق قبكر. قم بإعداد رد فعل قبكر في أنبوب بكر نوكلاس خالية، الجمع بين المكونات الموجودة في النظام والمبلغ المحدد في الجدول 5. مكان في آلة قبكر، ودورة كمحدد في الجدول 6.
    1. لتحديد العدد الأمثل للتضخيم إضافية دورات لرد فعل ميليلتر 45 المتبقية، خلق مؤامرة مع عدد دورة على المحور السيني والأسفار النسبي (رفو) على المحور الصادي. العدد الأمثل لدورات إضافية التضخيم هو ثلث عدد دورات يستغرق لرد فعل qPCR للوصول إلى الهضبة.
      ملاحظة: رصد رد فعل من جانب qPCR يسمح لتحديد العدد الأمثل لدورات PCR المطلوب للحصول على مكتبة الأمثل يفتت التضخيم مع تقليل GC محتوى وحجم التحيز.
  7. إكمال التضخيم PCR النهائي من ميليلتر 45 المتبقية لتفاعل PCR. ضع الأنبوب PCR مع رد فعل التضخيم من الخطوة 3.5 مرة أخرى في ثيرموسيكلير وتشغيل البرنامج كما هو موضح في الجدول 7.
    ملاحظة: لعينات معالجتها كما هو موضح في هذا البروتوكول، تقرر مثلى مجموع عدد دورات التضخيم بكر أن 12.
  8. بعد اكتمال التضخيم تنقية المكتبات باستخدام مجموعة أدوات تنظيف PCR بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، الوتينج في 25 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف.
    ملاحظة: يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية ليصل إلى 48 ح المكتبات تضخيم أو المجمدة في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

4-أتاك-seq مكتبة نوعية التحليل

ملاحظة: من المهم التحقق من نوعية وكمية من مكتبات seq أتاك قبل تسلسل الجيل القادم. ينبغي إجراء تقييم نوعية وكمية للمكتبات باستخدام أدوات متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد).

  1. تقييم نوعية وكمية من مكتبات seq أتاك باستخدام منصة المستندة إلى ميكروفلويديكس لتغيير الحجم والقياس الكمي ومراقبة الجودة للحمض النووي. انظر الشكل 2 لنتائج تقييم نوعية الممثل.
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز المكتبات أتاك-seq > 1 نانوغرام/ميليلتر للحصول على نتائج الجودة التسلسل. في المتوسط، 30 نانومتر في 25 ميليلتر تم الحصول عليها.

5-تسلسل وتحليل البيانات

ملاحظة: أنابيب تحليل هذا يسمح للمستخدمين بالتحكم في جودة ما يلي: تعيين الإجراء، ضبط إحداثيات للتصميم التجريبي، وتستدعي قمم تحليل المتلقين للمعلومات. فيما يلي بعض أسطر الأوامر وشرح للتنفيذ. تتوفر الحزمة تحليل البيانات (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).

  1. التسلسل المكتبات المعدة في التسلسل جيل القادم لمتوسط عمق قراءة من القراءات 42 مليون كل عينة.
  2. تقدير جودة ما يلي التسلسل بالتحقق من الملفات التي تم إنشاؤها بواسطة حزمة برامج12 فاستقك باستخدام الأمر:
    فاستقك-س < output_directory >< fastq_file >
  3. تقليم أسس ما يلي عن طريق تريموماتيك13 البرمجيات، إذا لزم الأمر، كما يحددها الاختيار نوعية فاستقك، باستخدام الأمر (لزوج انتهت):
    جافا-جرة < المسار إلى ملف جرة تريموماتيك > PE < input1 >< input2 >< زوجي output1 >< مزاوج output1 >< output2 زوجي >< مزاوج output2 > هيادكروب: < المحاصيل القواعد >
  4. محاذاة للجينوم البشرية المرجع (hg38) على ما يلي حسب البرنامج14 Bowtie2:
    bowtie2-x < مرجع الجينوم > < زوج الإدخال 1 ><-1 إدخال زوج 2 >-S < ملف الإخراج سام >
    ملاحظة: الحجة-x ل basename الفهرس للجينوم المرجع، و-S لسام تنسيق الإخراج.
  5. تحقق من ثيكواليتي من استخدام حزمة فلاجستات15 سامتولس المعين على ما يلي:
    سامتولس فلاجستات < أم ملف >
  6. فرز ملف معين على ما يلي، وإزالة التكرارات باستخدام أداة16 بيكار:
    جافا-جرة picard.jar "الإدخال سورتسام" = < اسم ملف الإدخال سام > الإخراج = < اسم ملف الإخراج فرزها أم > SORT_ORDER = تنسيق "و" جافا-جرة picard.jar ماركدوبليكاتيس الإدخال = < المفروزة أم ملف > الإخراج = < ملف الإخراج أم دون تكرارات > REMOVE_DUPLICATES = TRUE
  7. تقليم على كروموسوم غير المستخدمة ما يلي "أم مؤشر" الملف، وتحويل الإحداثيات للسبب التجريبي seq أتاك17:
    جافا-جرة picard.jar "الإدخال بويلدبامينديكس" = < أم ملف >
    سامتولس إيدكسستاتس < "أم إدخال" ملف > | قص-و 1 | شري-v grep | grep-v شرم | كرون-v grep | عرض سامتولس xargs-ب < ملف "الإدخال أم" >>< إخراج قلص أم ملف >
    بامتوبيد بيدتولس-i < اقتطاعها الإدخال ملف أم >>< إخراج قلص سرير ملف >
    awk 'تبدأ {OFS ="\t"}؛ {إذا ($6 = = "+") طباعة $1، $2 + 4، $3 + 4، 4 دولار، ومبلغ 5، 6 دولار؛ وطباعة آخر $1، $2-5، $3-5، 4 دولار، مبلغ 5، 6 دولار} ' < اقتطاعها الإدخال ملف سرير >< Trimmed تحول سرير ملف >
  8. حذف ما يلي: أن ينقل إلى التنسيق السلبية:
    awk '{إذا طباعة ($2 > 0) $1"\t"$2"\t"$3"\t"$4"\t"$5"\t"$6}' < "سرير إدخال" ملف >< ملف الإخراج التنسيق غير سالب سرير >.
  9. تحويل ملف سرير إلى ملف أم لتحليل18 ديفبيند التالية:
    بيدتوبام بيدتولس-i < "سرير إدخال" ملف >-ز < مرجع الجينوم >< "أم إخراج" ملف >
  10. إجراء استدعاء الذروة بحزمة البرامج18 ديفبيند:
    macs2 كالبياك-t < "أم إدخال" ملف >-إف أم-ز hs-نوموديل-نولامبدا-تبقى-الحزب الديمقراطي الوحدوي جميعا--نداء-مؤتمرات-أووتدير < مسار الدليل الإخراج >-n < اسم الإخراج >-ب-q 0.01-bdg-التحول-100-اكستسيزي 200
    ملاحظة: بعد تصفية، نتوقع متوسط القراءات 37 مليون كل عينة. وسوف تتراوح mitochondrial DNA التلوث بين 0.30 – 5.39% (1.96 في المائة في المتوسط). وسوف يكون هناك معدل منخفض لضرب المعينة ما يلي: (6.7%-56%، 19% في المتوسط) ونسبة عالية نسبيا من قابلة للاستخدام النووي يقرأ (60%-92%، 79 في المائة في المتوسط).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من 15 مل دم كله جديدة، ينشئ هذا البروتوكول في وسط خلايا CD4 + "تي" 1 مليون. وهذه يمكن المجمدة للمعالجة فيما بعد أو استخدامها على الفور. الجدوى لخلايا CD4 + T، طازجة أو المذابة، كان دائماً > 95%. يسمح هذا الأسلوب لعزل خلايا CD4 + T للمرونة في الوقت مصدر المواد وجمع. وتنتج هذا البروتوكول أتاك-seq تحسين مكتبة نهائي يزيد عن 1 نانوغرام/ميليلتر للتسلسل. يجب أن تثبت مراقبة جودة تنفيذ استخدام الأنظمة المتاحة تجارياً شظايا من الحمض النووي بين 200 و 000 1 شركة بريتيش بتروليوم (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ينص البروتوكول أتاك-seq المعدلة المقدمة في هذه المقالة النتائج استنساخه مع الحد الأدنى من التلوث الحمض النووي mitochondrial. البروتوكول قد المستخدمة لنجاح تميز الكروماتين العمارة البشرية الأولية ببمكس10، وحيدات البشرية، والخلايا الجذعية الماوس (غير منشور)، وخطوط الخلية الميلانوما مثقف11. ونحن نتوقع هذا تحلل تحسين حالة لديه القدرة على العمل من أجل أنواع الخلايا الأخرى، وكذلك. من المتوقع أيضا أن هذا البروتوكول العزلة الأنوية سوف تكون متوافقة مع نواة واحدة أتاك-seq البروتوكولا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن نشكر سيبا اتسيدي للدعم التقني. C.S.C. معتمد من قبل 1R61DA047032 منحة المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1x PBS ،يمكن 10010023Gibcoاستخدام منتجات أخرى مماثلة.
5810/5810  R دلو التأرجح المبردة الطرد المركزي مع 50 مل و 15 مل و 1.5 مل دلاء أنبوبيةEppendorf22625501يمكن استخدام منتجات أخرى مماثلة.
96 لوحة سفلية مستديرةجيدا Thermo Scientific163320يمكن استخدام منتجات أخرى مماثلة.
G2991AAنظام محطة الشريط Agilent Agilentلتقييم الجودة.
استخدام 374081 CryotubesThermo Scientificمنتجات أخرى مماثلة.
يمكن استخدام DMSOSigmaD8418منتجات أخرى مماثلة.
Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28Invitrogen Life Technologies11131Dالمكونات الحرجة
Dynabeads التي لم تمسها مجموعة الخلايا التائية البشرية CD4Invitrogen Life Technologies11346Dالمكونات الحرجة
DynamagnetInvitrogen Life Technologies12321Dالمكون الحرج
FCSGemini Bio Products100-500يمكن استخدام غيرها من المقارنة منتجات.
الحمض النووي عالية الحساسيةAgilent50674626مقترحة لتقييم الجودة.
كلوريد المغنيسيوم ، سداسي هيدرات ، البيولوجيا الجزيئية الصفسيجماM2393يمكن استخدام منتجات أخرى مماثلة.
طقم تنقية MinElute PCR (Buffer PB ، Buffer PE ، Elution Buffer)Qiagen28004المكون الحرج
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001يمكن استخدام منتجات أخرى مماثلة.
كلوريد الصوديوم ، البيولوجيا الجزيئية الصفSigmaS3014يمكن استخدام منتجات أخرى مماثلة.
NEBNext عالية الدقة 2x PCR Master MixNew England BioLabsM0541للمكون الحرج
Nextera (2x TD Buffer ، Tn5 Enzyme)يمكن استخدام IlluminaFC1211030المكونات الحرجة
خالية من النوكليز معقمة dH2< / sub>0Gibco10977015استخدام منتجات أخرى مماثلة.
Polysorbate 20 (Tween20)SigmaP9416يمكن استخدام منتجات أخرى مماثلة.
PowerUp SYBR Green Master MixApplied BiosystemsA25780يمكن
الحرجة الدقة لحمام الماءالحراري العلميTSGP02استخدام منتجات أخرى مماثلة.
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104مجموعة فحص المكونات الحرجة
Qubit dsDNA HSInvitrogen Life TechnologiesQ32851مقترحة لتقييم الجودة.
Qubit FlouroMeterInvitrogen Life TechnologiesQ33226مقترح لتقييم الجودة.
Rosette Sep Human CD4 +Density Medium Stem Technologies15705Critical Component
Rosette Sep Human CD4 + Enrichment CocktailStem Cells Technologies15022Critical Component
RPMI-1640Gibco11875093يمكن استخدام منتجات أخرى مماثلة.
يمكن استخدام Sterile ResevoirThermo Scientific8096-11استخدام منتجات أخرى مماثلة.
T100 Thermocycler مع غطاء ساخنBioRad1861096يمكن استخدام منتجات أخرى مماثلة.
استخدام Tris-HCLSigmaT5941منتجات أخرى مماثلة.
المعقمة اقتراح يمكن مجموعة مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي يمكن استخدام المكونات يمكن

المراجع

  1. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  2. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
  3. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
  4. Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
  5. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  6. Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
  7. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  8. Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41(2017).
  9. Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
  10. Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
  11. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  12. Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
  13. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  14. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  15. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  16. Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
  19. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  20. Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ATAC seq Tn5
أتاك-seq المقايسة مع الحمض النووي منخفضة التلوث من الابتدائي البشرية CD4 + تي الخلايا اللمفية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.