مقالة منهجية

قياس أية مصفوفة الخلوية العالمية والنشاط الأيضي في الهلاميات المائية 3D

7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59123

⸱

يناير 22, 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

في هذه المقالة

ملخص

ويرد هنا، بروتوكولا لتغليف واستزراع الخلايا في الهلاميات المائية poly(ethylene glycol) (شماعة) فونكتيوناليزيد مع أية مصفوفة فلوروجينيك (MMP)-الببتيد القابلة للتحلل. يتم قياس MMP الخلوية والنشاط الأيضي مباشرة من الثقافات المائية باستخدام قارئ ميكروسكوبية قياسية.

الملخص

ثلاثي الأبعاد (3D) خلية ثقافة النظم غالباً ما أوثق الخص في فيفو الاستجابات الخلوية ووظائف من النظم التقليدية من ثقافة ثنائية الأبعاد (2D). بيد أن قياس وظيفة الخلية في الثقافة 3D غالباً أكثر تحديا. تتطلب العديد من الاختبارات البيولوجية استرجاع المواد الخلوية التي يمكن أن تكون صعبة في الثقافات 3D. طريقة واحدة للتصدي لهذا التحدي هو وضع المواد الجديدة التي تمكن من قياس وظيفة الخلية داخل المواد. هنا، يقدم طريقة لقياس نشاط أية (MMP) مصفوفة الخلوية في 3D الهلاميات المائية في شكل 96-جيدا. في هذا النظام، هو فونكتيوناليزيد المائية poly(ethylene glycol) (شماعة) مع جهاز استشعار كليافابلي نظام التمثيل التناسبي المختلط فلوروجينيك. الخلوية نظام التمثيل التناسبي المختلط نشاط يتناسب مع شدة الأسفار ويمكن أن يقاس مع قارئ ميكروسكوبية قياسية. التصغير من هذا التحليل بشكل جيد 96 تخفيض الوقت اللازم لإعداد تجريبية باستخدام 50% وكاشف بنسبة 80% في حالة مقارنة بالإصدار السابق 24-جيدا للفحص. هذا التحليل أيضا متوافقة مع قياسات أخرى لوظيفة الخلوية. على سبيل المثال، تحليل نشاط أيضي يتجلى هنا، التي يمكن أن تجري في وقت واحد مع نظام التمثيل التناسبي المختلط قياسات النشاط داخل المائية نفس. ويتجلى المقايسة مع الخلايا البشرية سرطان الجلد مغلفة عبر مجموعة من الخلية البذر الكثافة لتحديد كثافة التغليف المناسبة لنطاق العمل التحليل. بعد 24 ساعة تغليف الخلية، MMP وقراءات النشاط الأيضي كانت متناسبة مع الخلية البذر الكثافة. بينما يتجلى المقايسة هنا مع واحد فلوروجينيك الركيزة القابلة للتحلل، يمكن تكييفها وفقا لمجموعة متنوعة من النظم المائية وأجهزة استشعار أخرى الفلورسنت المقايسة والمنهجية. مثل هذا تحليل يوفر منبرا تثقيف 3D العملية وكفاءة والوصول إليها بسهولة لمجموعة متنوعة من التطبيقات.

المقدمة

نظم الثقافة (3D) ثلاثية الأبعاد غالباً ما أوثق الخص في فيفو الاستجابات الخلوية من نظم الثقافة (2D) ثنائي الأبعاد التقليدية، انظر عدة منشورات ممتازة1،،من23 . بيد استخدام نظم الثقافة ثلاثية الأبعاد لقياس وظيفة الخلية قد تم تحدي نظراً لصعوبة استرجاع الخلوية وكذلك عينة التجهيز. يحد هذا الصعوبة قياس العديد من الوظائف الخلوية في نظم الاستزراع 3D. للتغلب على هذه الصعوبة، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة تمكن من السهل قياس وظيفة الخلية داخل بيئات 3D. طريقة واحدة لمعالجة هذه الحاجة هو وضع المواد التي لا دعم الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد فحسب بل تشمل أيضا أجهزة استشعار لقياس وظيفة الخلية. على سبيل المثال، أدرجت العديد من النظم المائية فلوروجينيك البروتياز مويتيس كليافابلي لتمكين التصور حوزتي النشاط داخل بيئات 3D4،5،،من67. بينما هذه الأنظمة استخدمت أصلاً للتصوير المجهري، هذه النظم كما يمكن تطويعها للاستخدام في مقايسة نشاط أية (MMP) مصفوفة عالمية استخدام قارئ لوحة قياسية، مما يتيح قياس سهلة لوظيفة الخلية في 3D 8من البيئة.

يتولى، فوق عائلة من الزنك البروتياز، تلعب أدواراً حاسمة في التوازن أنسجة طبيعية وفي العديد من الأمراض. يتولى تتحلل ويعيد المصفوفة خارج الخلية (ECM)، وتنشق مستقبلات سطح الخلية والسيتوكينات وتفعيل أخرى يتولى9،10. يتولى دوراً حاسما في العمليات الفسيولوجية مثل التئام الجروح والأمراض مثل التهاب المفاصل وتصلب الشرايين، ومرض الزهايمر، والسرطان (انظر ملاحظات في 9،،من1011). بالسرطان، وهي مستويات عالية من التعبير MMP ارتباطاً وثيقا بسرطان خبيث وسوء التشخيص12. وعلاوة على ذلك، يتولى المساهمة في تطور الورم بالتشجيع على غزو خلايا السرطان والهجرة، العمليات الخلوية التي هي ظواهر طبيعتها 3D13،14. ولذلك، هناك الكثير من الاهتمام في القدرة على قياس نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط في الثقافة 3D في سياقات عديدة، بما في ذلك الدراسات البيولوجية الأساسية وفحص فحوصات المخدرات.

الهلاميات المائية شماعة تستخدم على نطاق واسع للثقافة خلية ثلاثية الأبعاد بسبب مضمونها ارتفاع المياه، ومقاومة للبروتين الامتزاز، والطابع الانضباطي. قد تم فونكتيوناليزيد شماعة الهلاميات المائية مع عدد من مويتيس لوظيفة الخلية مباشرة، كما هو الحال مع الببتيدات ECM mimetic مثل إدارات RLD وإيكفاف تسهيل التصاق الخلايا، أو توجيه الربط لعوامل النمو مثل تحويل عامل النمو-بيتا (TGF-β) 15،16. في الآونة الأخيرة، وقد تم فونكتيوناليزيد شماعة الهلاميات المائية مع استشعار الببتيدات التي تمكن من قياس وظيفة الخلية ك جيدا5،8. على وجه التحديد، استخدام نظام هيدروجيل شماعة فونكتيوناليزيد مع فلوروجينيك القابلة للتحلل MMP قياس الببتيد تمكين النشاط MMP الخلوية في الثقافات 3D مع قارئ لوحة قياسية ومطلوب لا إجراء مزيد من المعالجة. هذه الأنظمة أيضا متوافقة مع قياسات أخرى لوظيفة الخلوية، بما في ذلك النشاط الأيضي. ويرد هنا، بروتوكول لقياس نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط للخلايا المستزرعة في هيدروجيل شماعة 3D فونكتيوناليزيد مع فلوروجينيك ببتيد القابلة للتحلل نظام التمثيل التناسبي المختلط، والنتائج المعروضة تبين التجارب الأولية التحسين اللازمة لاستخدام هذه المقايسة. تم تغليف الخلايا البشرية سرطان الجلد (A375) في الهلاميات المائية فلوروجينيك عبر طائفة من البذر الكثافة لتحديد كثافة البذر المناسبة التي تقع ضمن نطاق العامل المقايسة. بعد 24 ساعة تغليف، قيست MMP والنشاط الأيضي في استخدام قارئ ميكروسكوبية قياسية. المقبل، كان تطبيع نشاط نظام التمثيل التناسبي المختلط للنشاط الأيضي لتحديد كثافة البذر داخل نطاق الخطي المقايسة. وأخيراً، حسبت معامل داخل لوحة من اختلاف النسب المئوية (% السيرة الذاتية) بين تريبليكاتيس للتفكير في إمكانية تكرار نتائج النتائج التي تم الحصول عليها. ويتيح هذا الأسلوب الثقافة خلية 3D بسيطة وسريعة وسهلة القياس حوزتي نشاط بعينه الحد الأدنى من المعالجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد المكونات المائية

  1. توليف الفلورسنت الببتيدات حوزتي التحلل كما هو موضح في مكان آخر8، استخدام فلوريسسين كجزيء فلوري ودابسيل كما يحتوي. حل الببتيد في [دمس] لتركيز من 10 ملم ومخزن في ثلاجة-80 درجة مئوية في مختبرين (~ 30 ميليلتر) صغيرة لتجنب دورات تجميد أذاب المتكررة.
    ملاحظة: هذه الببتيدات كما يمكن شراؤها تجارياً. ويتطلب هذا البروتوكول سيستين ج-طرفية في تسلسل الببتيد لتمكين التساهمية إدماج الشبكة البوليمر هيدروجيل.
  2. تعد الذراع 40 8 كاتشين بولي (جليكول) أمين (شماعة)-نوربورنيني (ملحوظة) كوصف17. تحقق من نهاية المجموعة الروغان من أكبر من 90% باستخدام 1"ح الرنين المغناطيسي النووي". حل شماعة ملحوظة في المخزن المؤقت الفوسفات عقيمة المالحة (PBS) في 25% w/v ومخزن في الثلاجة-80 درجة مئوية في مختبرين (~ 300 ميليلتر).
    ملاحظة: ربط فونكتيوناليزيد مع نوربورنيني كما يمكن شراؤها تجارياً.
  3. توليف تريميثيلبينزويلفوسفيناتي فينيل 2,4,6 الليثيوم صور-البادئ (LAP) كما هو موضح في مكان آخر من18. حل اللفة في الماء المعقم لتركيز 68 ملم وتخزينها في ثلاجة-80 درجة مئوية في مختبرين (~ 300 ميليلتر).
    ملاحظة: كبديل لذلك، إيرجاكوري (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) يمكن استخدامها كالصور-البادئ. اللفة وإيرجاكوري ويمكن شراؤها تجارياً.
  4. حل crosslinker الببتيد القابلة للتحلل نظام التمثيل التناسبي المختلط (KCGPQG↓IWGQCK) وخلية التصاق الببتيد (كرجدس) في الماء المعقم لتركيز 200 و 100 ملم على التوالي، وتخزينها في ثلاجة-80 درجة مئوية (~ 300 ميليلتر و ~ 30 ميليلتر) مختبرين، على التوالي.

2-تحليل إعداد وسائل الإعلام

  1. إعداد معطل الحرارة، والفحم جردت الجنين المصل البقري (FBS) لتحليل نظام التمثيل التناسبي المختلط:
    ملاحظة: يمكن أن تنتج البروتياز في FBS إشارة خلفية عالية بفحص نظام التمثيل التناسبي المختلط؛ لذلك، من المستحسن إلغاء تنشيط الحرارة والفحم قطاع FBS لوسائل الإعلام المقايسة.
    1. إلغاء تنشيط 100 مل FBS بتدفئة لمدة 30 دقيقة في 55 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدم 100 مل FBS هنا اليقوتينج ومخزن في-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. ويمكن استخدام أحجام أصغر حسب الحاجة.
    2. إضافة 0.25% w/v من الفحم المنشط و 0.025% w/v من ديكستران إلى كمية صغيرة من FBS (حوالي 5 مل) ويقلب حتى يتم تشكيل الطين. ثم إضافة بقية FBS ويقلب لمدة 30 دقيقة في 55 درجة مئوية.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 1,962 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. ثم نقل المادة طافية إلى سفينة أخرى.
    4. كرر الخطوة 2.1.2 ولكن عند 37 درجة مئوية، تليها الخطوة 2.1.3. تعقيم المادة طافية باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر وثم فلتر 0.2 ميكرون.
  2. إعداد مقايسة وسائط الإعلام باستخدام وسائط الإعلام وتستكمل مع الفحم 1% جردت FBS، 2 مم ل الجلوتامين، 10 يو/مليلتر البنسلين، 10 ميكروغرام/مل والستربتوميسين.
    ملاحظة: ينصح وسائل الإعلام دون الأحمر الفينول لأنها أقل تدخلا الأسفار. إضافات أخرى إلى وسائل الإعلام بالانزيم مثل الأنسولين، عوامل النمو، يمكن إضافة إلخ. طالما امتصاص والأسفار الطيف الذري لا تتداخل مع أجهزة الاستشعار (494 nm nm/521).
  3. إنزيم كولاجيناز البكتيرية تمييع النوع الأول في 10 و 000 1 ميكروغرام/مل في مقايسة وسائط الإعلام كعنصر إيجابي.

3-Hydrogel تغليف إعداد وخلية

  1. إعداد الحل السلائف المائية.
    1. إضافة الكواشف إلى أنبوب 1.5 مل بالترتيب التالي، فورتيكسينج بعد إضافة كل مكون من مكونات: تسليح 20 مم 8 40 كاتشين شماعة ملحوظة، مم 12.75 crosslinker MMP التحلل الببتيد، 17.8 مم هيدروكسيد الصوديوم، 1 مم كرجدس مم 2 اللفة، والببتيد فلوروجينيك القابلة للتحلل MMP 0.25 مم.
      ملاحظة: يبين الجدول 1 محتويات الحل السلائف المائية، تركيزات الأسهم، وتركيزات العامل، معادلات حساب الحجم ووحدات التخزين المطلوبة اللازمة لجعل ميليلتر 120 المائية السلائف الحل، وكافية للقيام تجربة مع 10 الهلاميات المائية. لحساب خسارة الحل المائية بسبب بيبيتينج، زيادة الحجم الإجمالي بنسبة 20%. غالباً ما يتم تزويد الببتيدات التجارية في حلاً كلوريد الهيدروجين حمضية؛ لذلك، تتم إضافة هيدروكسيد الصوديوم إلى تحقيق الرقم الهيدروجيني نهائية من 7. ينبغي تأكيد الرقم الهيدروجيني للحل النهائي من قبل المستخدم.
    2. تقسيم الحل السلائف المائية متعددة 1.5 مل أنابيب، أنبوب واحد كل حالة يجري اختبارها.
      ملاحظة: يتم اقتراح عدة شروط المراقبة التي تعد الهلاميات المائية دون إضافة الخلايا. عنصر تحكم سلبية، حساب تدهور غير محددة من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك، شرط المائية واحد يمكن أن يكون المحتضنة مع مراقبة المركبات أو الوسائط التجريبية وحدها إذا لم يكن هناك أي شروط المعاملة. لعنصر تحكم إيجابي والمعايرة بين التجارب، يمكن المحتضنة الهلاميات المائية بحوزتي المعروف أن تنشق استشعار فلوروجينيك. على سبيل المثال، استخدمت تركيزات اثنين من كولاجيناز البكتيرية هنا.
  2. تغليف الخلايا في الهلاميات المائية.
    1. إعداد تعليق خلية واحدة فقط كمناسبة لنوع الخلية المستخدمة. على سبيل المثال، غسل طبق 10 سم من خلايا سرطان الجلد A375 مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. تريبسينيزي الخلايا باستخدام التربسين 0.05% واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 للحد الأدنى 3 حساب الخلايا مع هيموسيتوميتير لتحديد عدد الخلايا الإجمالي.
    2. الطرد المركزي حل الخلية في 314 x ز لمدة 3 دقائق، ونضح ثقافة وسائل الإعلام، ثم إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني في ما يقرب من ثلاثة إضعاف أعلى مطلوب بذر كثافة للتجربة. على سبيل المثال، استخدم تعليق خلية مع كثافة 21 × 106 خلايا هنا لتحقيق كثافة مغلفة نهائي 7 × 106 خلايا/مل.
    3. عد الخلايا مرة أخرى لضمان تركيز خلية دقيقة.
    4. إضافة خلايا مع وقف التنفيذ وبرنامج تلفزيوني لكل أنبوبة من حل السلائف المائية وفقا لكثافة البذر المطلوب (0.25، 0.5، 1، 2، 3، 4، 5 و 6، و 7 × 106 خلايا/مل في هذا المثال). إضافة برنامج تلفزيوني للشروط مع أي من الخلايا بدلاً من الخلايا مع وقف التنفيذ.
      ملاحظة: جميع الشروط ينبغي أن يكون وحدة التخزين الحل النهائي المائية السلائف نفسها لضمان النسبة بين المكونات المائية، وبرنامج تلفزيوني ثابت. هل أنابيب دوامة لا أن الخلايا فيها، "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بقوة دون خلق فقاعات من أجل خلط الحل السلائف.
    5. الاستغناء عن 10 ميليلتر من الحل السلائف المائية إلى أسود عقيمة جولة أسفل لوحة 96، حسنا، ضمان أن التلميح يتركز في وسط البئر كل حين الاستغناء عن.
    6. بلمرة المائية السلائف الحل بتعريض اللوحة للضوء (الأشعة فوق البنفسجية) البنفسجي الترا في 4 ميغاواط/سم2 لمدة 3 دقائق.
      ملاحظة: مصباح الأشعة فوق البنفسجية (UVL-56 "يده مصباح الأشعة فوق البنفسجية"، أوفب، في المرتفعات، كاليفورنيا) ينتج ضوء الأشعة فوق البنفسجية-أ في طول موجه الأشعة فوق البنفسجية طويلة (365 نانومتر)، التي لا تؤثر على سلامة الخلوية.
    7. إضافة 150 ميليلتر من مقايسة وسائط الإعلام لجميع الآبار باستثناء شروط مراقبة إيجابية دون خلايا مغلفة. إلى عناصر إيجابية، إضافة 150 ميليلتر من حل إنزيم كولاجيناز.
    8. إضافة 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للآبار الخارجي من اللوحة تخفيض التبخر أثناء الحضانة.

4-نظام التمثيل التناسبي المختلط، وقياس النشاط الأيضي

  1. قياس الأسفار فورا بعد التغليف لإنشاء مقياس fluorescence أساس وضمان التوحيد في البلمرة المائية. قراءة لوحة استخدام ميكروسكوبية fluorescence القارئ استخدام بروتوكولا كامد 96-جيدا لوحة تبلغ مساحتها مسح الإعداد في 494 نانومتر nm/521 (الإثارة/الانبعاثات). وسيكون هذا ح 0 قراءة.
  2. احتضان لوحة في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2 ح 18.
  3. إضافة كاشف النشاط الأيضي (ريسازورين) في 01:10 (v/v) لكل بئر.
  4. احتضان لوحة في حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2 ح 6 إضافية.
    ملاحظة: قد تختلف هذه المرة الحضانة تبعاً لنوع الخلية.
  5. قياس fluorescence في تغليف بعد 24 ساعة. قراءة لوحة استخدام ميكروسكوبية fluorescence القارئ استخدام بروتوكولا كامد 96-جيدا لوحة تبلغ مساحتها مسح الإعداد في 494 نانومتر nm/521 (الإثارة/الانبعاثات) للنشاط MMP و 560 نانومتر nm/590 (الإثارة/الانبعاثات) للنشاط الأيضي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وكان التحليل الحالي مقتبسة من نظام ثقافة المائية 3D المتقدمة سابقا وتتسم فونكتيوناليزيد مع استشعار كليفابل نظام التمثيل التناسبي المختلط فلوروجينيك8. جهاز استشعار نظام التمثيل التناسبي المختلط فلوروجينيك المستخدمة هنا يتكون من تسلسل الببتيد، جبلاك (بميوبزل) ↓WARKDDK (عدو) ج (↓ يشير إلى موقع الانقسام) الذي كان سابقا الأمثل للانقسام ب نظام التمثيل التناسبي المختلط-14 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-1119. تتم تسمية الببتيد جزيء فلوري (فلوريسسين)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويجمل العديد من الجوانب الهامة للبيئة الحية في زراعة الخلايا في المختبر 3D. ومع ذلك، ثقافة 3D يجعل أيضا تقييم الدالة cell وإشارات صعبة، تتطلب العديد من الاختبارات البيولوجية استرجاع الخلوية وإعداد كبيرة من الخلايا. ولذلك، وضع نظام بسيط الثقافة 3D التي تمكن من قياس وظيفة الخلوية دون عينة أخرى تجهيز سيزيد إلى حد كبير فائدة نظم الثقافة 3D. نظام 3D الموصوفة هنا يمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من التطبيقات المختلفة. يمكن تغيير تسلسل استشعار فلوروجينيك للكشف عن البروتياز الأخرى. على سبيل المثال، فلوروجينيك استشعار كليفابل التسلسل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

المؤلف يود أن ينوه أوهايو السرطان البحث (OCR)، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية لتمويل هذا العمل فضلا عن الملك سعود جامعة (جامعة الملك سعود)، الرياض، المملكة العربية السعودية لمقدمي البلاغ الأول. وتم قياس الوزن الجزيئي لاستشعار الببتيد نيون استخدام مصفوفة المساعدة، الامتزاز الليزر-التأين، وقت الطيران الكتلي (استخدام-TOF) مع مساعدة من الحرم الجامعي الكيميائية صك مركز قياس الطيف الكتلي والبروتينات مرفق في جامعة ولاية أوهايو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1X الفوسفات المخزن الملحيفيشر العلمي10-010-049
الفحم المنشط   ؛Sigma-AldrichC3345
صفيحة سوداء مستديرة ذات 96 بئرBrand-Tech89093-600
ببتيد التصاق الخلية (CRGDS)GenScript USA Inc.نوع
I & nbsp ؛لايف تكنولوجيز17100-017
ديكسترانسيجما-ألدريتشD4876
DMEM عالية الجلوكوز ميديافيتروجين11965118
مصل الأبقار الجنيني (FBS) Seradigm1500-500
قارئ الألواح الدقيقة الفلورية  BioTekCytation 3
الدمهوسر العلمية3200
L-glutamineLife Technologies25030-081
MMP الرابط المتشابك الببتيد القابل للتحلل (KCGPQG & darr; IWGQCK)GenScript USA Inc.حسب الطلب NaOH
Fisher ScientificS318500
البنسلين / الستربتومايسينتقنيات الحياة15140-122
Resazurin (Alamar Blue)Life TechnologiesDAL1100
ضوء الأشعة فوق البنفسجية   ؛الأشعة فوق البنفسجية95-0006-02
إنزيم الكولاجيناز المخصص مقياس

المراجع

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  3. Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
  4. Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
  5. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  6. Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
  7. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
  8. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  9. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  10. Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178(2016).
  11. Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
  12. Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
  13. Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
  14. Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
  15. Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
  16. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  17. Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
  18. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  19. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  20. Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
  21. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
  22. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  23. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

A375

مقالات ذات صلة