هنا، يتم شرح بروتوكولات إجراء التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية (microCT) لثلاثة من الحيوانات اللافقارية البحرية بالتفصيل. تصف هذه الدراسة خطوات مثل تثبيت العينة، وتلطيخ العينة، والتركيب، والمسح الضوئي، وإعادة بناء الصورة، وتحليل البيانات. كما تقدم اقتراحات بشأن كيفية تعديل البروتوكول لعينات مختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ميكروفوكس الأشعة السينية CT (microCT) التصوير من أكتينيا إكوينا (Cnidaria)، Harmothoe sp. (Annelida)، وXenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتقليديا، كان على علماء الأحياء أن يعتمدوا على أساليب تدميرية مثل التشعب من أجل التحقيق في الهياكل الداخلية للكائنات الحية غير الشفافة. أصبح التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية (microCT) غير المدمرة بروتوكولًا قويًا وناشئًا في علم الأحياء، وذلك بسبب التقدم التكنولوجي في أساليب تلطيخ العينات والابتكارات في أجهزة microCT وأجهزة المعالجة والبيانات تحليل البرمجيات. ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول غير شائع الاستخدام، كما هو الحال في المجالين الطبي والصناعي. أحد أسباب هذا الاستخدام المحدود هو عدم وجود دليل بسيط ومفهوم يغطي جميع الخطوات الضرورية: جمع العينات، والتثبيت، وتلطيخ، وتركيب، والمسح الضوئي، وتحليل البيانات. وثمة سبب آخر هو التنوع الواسع للميتازوان، ولا سيما اللافقاريات البحرية. وبسبب الأحجام المتنوعة لللافقاريات البحرية، والمورفولوجيا، والفيزيولوجيا، من الأهمية بمكان ضبط الظروف التجريبية وتكوينات الأجهزة في كل خطوة، حسب العينة. هنا، يتم شرح أساليب التصوير المجهري بالتفصيل باستخدام ثلاثة لافقاريات بحرية متنوعة وراثيا: أكتينيا إكوينا (أنثوزوا، كانيداريا)، هارموتهو سب(بوليشيتا، أنيليدا)، وXenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). كما تقدم اقتراحات بشأن إجراء التصوير المجهري على مختلف الحيوانات.
المقدمة
وكان على الباحثين البيولوجيين عموما أن يقوموا بأقسام رفيعة وأن يقوموا بالمراقبة عن طريق المجهر الضوئي أو الإلكتروني من أجل التحقيق في الهياكل الداخلية للكائنات الحية غير الشفافة. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب مدمرة وإشكالية عند تطبيقها على عينات نادرة أو قيمة. وعلاوة على ذلك، عدة خطوات في الأسلوب، مثل التضمين والمقطع، تستغرق وقتاً طويلاً، ويمكن أن يستغرق عدة أيام لمراقبة عينة، اعتماداً على البروتوكول. وعلاوة على ذلك، عند التعامل مع العديد من الأقسام، هناك دائما إمكانية إلحاق الضرر أو فقدان بعض الأقسام. تقنيات إزالة الأنسجة متاحةلبعض العينات 1،2،3،4،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التثبيت
- لActinia equina،والاسترخاء الحيوانات في 10٪ MgCl2 مياه البحر لمدة 15 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. نقل إلى 70٪ الإيثانول وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- لHarmothoe sp.، التخدير الحيوانات عن طريق وضعها في مياه البحر الباردة الجليد لمدة 15 دقيقة تقريبا نقل إلى 10٪ (V / v) حل رسمي مع مياه البحر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- لXenoturbella جابونيكا،والاسترخاء الحيوان باستخدام 7٪ MgCl2 في المياه العذبة. إصلاح في 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في مياه البحر المصفاة بين عشية وضحاها. مكان في الإيثانول 70٪ وتخزينها في 4 درجة مئوية.
تحذير: PFA خطرة ويجب التعامل معها بعناية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قمنا بتصوير ميكروCT على A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida), and X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) بعد تلطيخ العينات بمحلول لوغول بنسبة 25%. وأدى تلطيخ الأنسجة بنجاح إلى تعزيز تباين الهياكل الداخلية في جميع العينات،مما مكّن من رصد الأنسجة الرخوة الداخلية (الشكل 6). جنبا إلى جنب مع التقارير السابقة6،7،16،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المثبتات باستخدام الفورماين، مثل 10٪ (v / v) حل الفورمالين في مياه البحر المستخدمة في هذه الدراسة، ومن المعروف للحفاظ على مورفولوجيا اللافقاريات البحرية المتنوعة وغالبا ما تستخدم لتصوير microCT18،24،25 ،26،28،30،33. ومع ذلك، أصبحت القيود المفروضة على استخدام هذه المادة الكيميائية صارمة في ب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر توشيهيكو شيرويشي على مساعدته وعلى توفير البيئة البحثية خلال هذه الدراسة. ونحن ممتنون لكينسوكي ياناغي وتاكاتو إيزومي للحصول على المشورة بشأن A. equina، وMasaatsu تاناكا للحصول على المشورة بشأن عينة Harmothoe sp. نود أن نشكر الموظفين في مركز شيمودا للبحوث البحرية، جامعة تسوكوبا، ومحطة ميساكي البيولوجية البحرية، جامعة طوكيو لمساعدتهم في مجموعات العينات. نود أن نشكر Editage (www.editage.jp) لتحرير اللغة الإنجليزية. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة المساعدة المقدمة للعلماء الشباب (A) (JP26711022) إلى HN، وJAMBIO، الرابطة اليابانية للبيولوجيا البحرية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| قارورة إرلين ماير سعة 250 مل | كورنينج | CLS430183 | |
| 5 مل أنبوب أخذ العينات ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| أنبوب بولي بروبلين 50 مل | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60 مم طبق غير معالج | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| طرف من الدرجة البيئية (أزرق) 1000 & ميكرو; ل | BMBio | BIO1000RF | |
| الإيثانول | واكو للصناعات الكيماوية النقية | 057-00451 | |
| الفورمالين | واكو للصناعات الكيماوية النقية | 061-00416 | |
| اليود | واكو للصناعات الكيماوية النقية | 094-05421 | |
| سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم | واكو للصناعات الكيماوية النقية | 135-00165 | |
| عارض OsiriX DICOM | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical | Industries 163-25983 | |
| إبرة معنقة | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| يوديد البوتاسيوم | واكو بيور للصناعات الكيماوية | 166-03971 | |
| ملاقط دقيقة 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI طرف مناسب (أصفر) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| شفرات حلاقة | ريشة | FA-10 | |
| ملاقط حلقية | NAPOX | A-26 | |
| مجهر مجسم | Leica | MZ95 | |
| نظام التصوير بالأشعة السينية Micro-CT | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
المراجع
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
