هنا نقدم طريقة لإعداد أورجانوتيبيك الثقافات شريحة من المخيخ الماوس وغمد المايلين تلطيخ من إيمونوهيستوتشيميستري مناسبة للتحقيق في آليات مييلينيشن وريميلينيشن في الجهاز العصبي المركزي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد و Immunostaining أورجانوتيبيك ميليناتينج شريحة الدماغ الثقافات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الجهاز العصبي، هو المايلين بنية غشاء معقدة التي تم إنشاؤها بواسطة ميليناتينج الدبقية الخلايا، هي محاور عصبية انشياثيس وتسهل التوصيل الكهربي السريع. لقد ثبت تحوير المايلين تحدث في الأمراض العصبية المختلفة، حيث أنها مرتبطة بعجز وظيفي. وهنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للسابقين فيفو النموذجي يتكون من شرائح الدماغ أورجانوتيبيك الماوس، التي يمكن الاحتفاظ بها في الثقافة لعدة أسابيع وكذلك يكون المسمى لتصور المايلين.
المقدمة
الخلايا العصبية هي الخلايا عالية الاستقطاب، التي تتكون من حجرة الدهليزي الجذعية التي تتلقى مدخلات من بيئتها، ومحور عصبي يضمن توليد ونشر للنبضات الكهربائية إلى خلايا أخرى. الانتشار السريع، والتسليم في الوقت المناسب للمعلومات أمر أساسي للأداء السليم للجهاز العصبي. في الفقاريات، فإنه يسر مييلينيشن، الذي يتيح زيادة سرعة التوصيل محواري1. المايلين بنية متخصصة التي شكلتها طبقات المضغوطة من غشاء البلازما المتولدة عن إطلاق ميليناتينج، إلا وهي أوليجوديندروسيتيس في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وخلايا شوان في الجهاز العصبي المحيطي (PNS). في كل من الجهاز العصبي المركزي والسندات الإذنية، التفاعلات أكسوجليال محرك تشكيل المجالات محواري المتخصصة: رانفييه للعقد و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع الأعمال التي تنطوي على الحيوانات الامتثال للسياسات المؤسسية والمبادئ التوجيهية التي وضعتها UPMC و INSERM والفرنسية وتوجيه مجلس الجماعة الأوروبية 86/609/EEC.
1-إعداد متوسطة الثقافة والثقافة بإدراج (التدريب العملي على الوقت ≈ 10 – 15 دقيقة)
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء ثقافة تدفق تحت ظروف معقمة
- إعداد 40 مل من الثقافة المتوسطة، التي تتألف من 50% BME, متوازن الملح الحل 25% هانك (س 1)، 25% معطل الحرارة الحصان المصل، تستكمل مع مشتقات الجلوتامين 2 مم، 100 وحدة دولية/مل البنسلين-ستربتوميسين و 4.5 ملغ/مل د-الجلوكوز. قم بضبط ال pH إلى 7.4.
- عامل التصفية-تعقيم المتوسطة من خلال عا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أمثلة على إيمونوستينينجس المايلين الممثل في شرائح الدماغ أورجانوتيبيك التي تم الحصول عليها من C57black6 P9 P10 البرية من نوع (WT) (الشكل 2A)، فضلا عن حزب العمال التقدمي-بروتينات فلورية خضراء الفئران المحورة وراثيا (الشكل 2)، جنبا إلى جنب مع خلايا بوركنجي تلطيخ. شرائح الدماغ ميليناتي من هذه المسألة الأبيض مسارات منطقة الشرائح صوب المحيط فندق folia وميليناتيون خلايا بوركنجي يتحقق معظمها بعد 6 إلى 7 شعبة. في شعبة 7، تقلد ديمييلينيشن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لإنشاء السابقين فيفو نموذج المقابلة لثقافات شريحة أورجانوتيبيك الدماغ الماوس، تكييفها من قبل أساليب نشر15،،من1619 والمايلين اللاحقة إيمونوستينينج لهذه الاستعدادات. توفر هذه الاستراتيجية إمكانية تصور مكونات المايلين مع ذات الدقة العالية في الدول على حد سواء سليمة ومرضية.
أورجانوتيبيك الدماغ شريحة الثقافات المأخوذة من الفئران عمره 10 أيام نموذج تجريبي راسخة للتحقيق الآليات.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لدى أي من أصحاب المصالح المتنافسة أو المصالح المتضاربة.
شكر وتقدير
ونحن نشكر الدكتور شون فريمان، والدكتورة ناتالي سول-فولون والدكتور توماس رو لتعليقات قيمة على المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من INSERM، ICM، والمنح أرسيب R13123DD، R17127DD ANR (إلى ميلادي) والعلاجات الزمالة، SPF20110421435 (إلى ميلادي)، FDT20170437332 (لتم). ونشكر مرفق الثقافة الخليوي سيليس و icm. منصة التصوير ضليع في الرياضيات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| BME متوسط | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank ' s محلول ملح متوازن (10x HBSS) | ThermoFisher | Scientific 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| مصل الحصان المعطل بالحرارة | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin & ndash ؛ الستربتومايسين (10.000 وحدة دولية / مل) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey محلول الملح المتوازن | سيجما ألدريتش | G9779-500ML | |
| D-Glucose (45٪) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) علوم | المجهر الإلكتروني | 15714 | |
| الإيثانول المطلق (100٪ الإيثانول) | VWR Chemicals | 20821.330 | تبرد عند -20 درجة ؛ C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10٪ مصل ماعز عادي (NGS) | ThermoFisher Scientific | ||
| EuroMEDEX | ET330-A | درجة الحموضة 7.4 | |
| الأجسام المضادة المضادة ل GFP (متعددة النسيلة ، الدجاج) | ميرك ميليبور | 06-896 | التخفيف 1/300 |
| الأجسام المضادة للبروتين الأساسي المضاد للمايلين (MBP) (متعدد النسيلة ، الدجاج) ميرك | ميليبور | AB9348 | التخفيف 1/150 |
| الأجسام المضادة للبروتين الأساسي المضاد للمايلين (MBP) (أحادية النسيلة ، الفأر IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | التخفيف 1/200 |
| الأجسام المضادة ل PLP (الفئران ، الورم الهجين) | هدية من الدكتور ك. إيكيناكا. أوكاساكي ، اليابان | التخفيف 1/5 إلى 1/10 | |
| قناة مضادة للصوديوم ، جسم مضاد عموم (أحادي النسيلة ، الفأر IgG1 ، استنساخ K58 / 35) | تخفيف Sigma Aldrich | S8809 | 1/150 |
| الأجسام المضادة لمكافحة Caspr (متعددة النسيلة ، الأرنب) | Abcam | ab34151 | التخفيف 1/500 |
| الأجسام المضادة الثانوية للماعز مترافقة مع Alexa Fluor 488 أو 594 أو 647 أو 405 | التخفيف العلمي ThermoFisher | 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| مفرمة مناديل | ماكلوين | ||
| شفرات | |||
| مقص كبير | FST | 14101-14 | |
| مقص صغير | FST | 91500-09 | |
| ملقط مستقيم ناعم | FST | 91150-20 | |
| ملقط منحني ناعم | FST | 11297-00 | |
| أطباق زراعة الخلايا (60 مم و 100 مم) | TPP | ||
| 4 ، 6 ألواح ثقافة آبار | TPP | ||
| إدراج ثقافة Millicell (0،4 & micro ؛ م ، قطر 30 مم) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| حاضنة | 37 درجة ؛ C ، 5٪ CO2 | ||
| أطراف ماصة دقيقة | Dutscher | 134000CL | |
| أطراف ماصة واسعة التجويف | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| حقنة معقمة | Terumo Europe | 20 أو 50 مل | |
| مرشحات حقنة معقمة | Terumo Europe | 0.22 & micro ؛ m | |
| مشرط | سوان مورتون | 0510 | |
| فرشاة | |||
| مجهر شرائح | RS فرنسا | 76 مم × 26 مم × 1.1 مم | |
| أغطية زجاجية | RS France | 22 مم × 22 مم | |
| Kimtech Sciences مساحات المناديل | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| مجهر | مجهر |
المراجع
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple scleros....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
