نقدم هنا بروتوكولا لتحليل نمو رشاشيه الخنزير وإنتاج الأفلاتوكسين في حبات الذرة معربا عن البروتينات المضادة للفطور. استخدام سلالة الإعراب عن التجارة والنقل (أ) الخنزير نحن رصد العدوى وانتشار الفطريات في حبات ناضجة في الوقت الحقيقي. المقايسة سريعة وموثوق بها، واستنساخه.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تثبيط النمو رشاشيه الخنزير و "إنتاج الأفلاتوكسين" في "الإعراب عن الذرة المعدلة وراثيا" المانع α-الأميليز من purpureus لابلاب ل.
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلوث الأفلاتوكسين في المحاصيل الغذائية والعلفية يمثل تحديا كبيرا في جميع أنحاء العالم. الأفلاتوكسين، التي تنتجها الفطريات الخنزير رشاشيه (الخنزير (أ)) من المواد المسرطنة القوية التي تقلل إلى حد كبير قيمة محصول الذرة والمحاصيل الغنية النفط الأخرى مثل الفول السوداني إلى جانب مما يشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان والحيوان. نهج مختلفة، بما في ذلك التربية التقليدية، والتعبير المعدلة وراثيا المقاومة المرتبطة البروتينات، والجيش الملكي النيبالي التدخل ([رني])-على أساس إسكات الجينات التي يسببها المضيف الحرج الخنزير (أ) يجري تقييم أهداف الجينات، زيادة المقاومة الأفلاتوكسين في المحاصيل عرضه. وقد أظهرت الدراسات السابقة دوراً هاما من α-الأميليز في إنتاج المرضية والافلاتوكسين الخنزير (أ) ، مما يشير إلى هذا الجين/الإنزيم هدف محتمل للحد من نمو الخنزير (أ) وإنتاج الأفلاتوكسين. وفي هذا الصدد، وأجريت الدراسة الحالية تقييم تعبير مغايرة (تحت سيطرة المروج 35S كامب التأسيسي) بروتين مثبط مثل α-الأميليز purpureus لابلاب L. (أيلب) في الذرة ضد الخنزير (أ). أيلب هو بروتين 36-كاتشين، الذي هو مثبط تنافسي لأنزيم الأميليز α الخنزير (أ) ، وينتمي إلى أسرة بروتين مثبط يكتين – أرسلان – α-الأميليز المشتركة فول. وقد أثبتت الدراسات في المختبر قبل العمل الحالي دور أيلب في تثبيط النشاط α-الأميليز الخنزير (أ) ونمو الفطريات. وتم رصد نمو الفطريات وإنتاج الأفلاتوكسين في حبات ناضجة في الوقت الحقيقي باستخدام سلالة الإعراب عن بروتينات فلورية خضراء الخنزير (أ) . بسيط جداً لإعداد نواة هذا الفحص المقايسة (المملكة العربية السعودية) ويوفر بيانات موثوقة واستنساخه في الإصابة ومدى انتشار التي يمكن قياسها كمياً لتقييم الأصول الوراثية وخطوط محوره وراثيا. الأسفار من إجهاد بروتينات فلورية خضراء النمو ارتباطاً وثيقا للفطريات، واستطراداً، أنها مرتبطة جيدا لقيم الأفلاتوكسين. وكان هدف العمل الحالي لتطبيق هذه المعرفة السابقة في محصول تجارياً هاما مثل الذرة لزيادة مقاومة الأفلاتوكسين. نتائجنا تشير إلى انخفاض 35%-72% في نمو الخنزير (أ) في حبات الذرة المعدلة وراثيا معربا عن أيلب التي، بدورها، ترجمت إلى 62%-88% انخفاضا في مستويات الأفلاتوكسين.
المقدمة
تلوث ميكوتوكسين من أجناس الفطريات، رشاشيه، تحززو Penicilliumو م هو مشكلة رئيسية للغذاء وتغذية المحاصيل المزروعة في جميع أنحاء العالم1،،من23. من بين هذه الفطريات فيتوباثوجينيك، قد رشاشيه أعلى الأثر السلبي على قيمة المحاصيل وصحة الإنسان والحيوان. رشاشيه الخنزير (الخنزير (أ)) هو ممرض مصنع انتهازية التي تصيب المحاصيل الزيتية غنية مثل الذرة والزيت والفول السوداني وينتج المواد المسرطنة القوية، الأفلاتوكسين، فضلا عن العديد من الأيض الثانوية السامة (SMs). الذرة غذاء هاما وتغذية المحاصيل التي تزرع في جميع أنحاء العالم وهو ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-بلازميد بنيات وتحويل الذرة
- [بكر] تضخيم لابلاب أيلب إدراج استخدام كبسولة تفجير 5 '-تاتكتاجاكتاجتجاتاككاتجكتكك-3' و 5 '-أتاكتجكاجاتجكاتجكاجاجتاجتاكتج-3'. تتضمن الشروط PCR خطوة أولية تمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 30 s (الخطوة 1)، تليها تمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 10 s (الخطوة 2)، الصلب في 55 درجة مئوية لمدة 30 ق (الخطوة 3)، استطالة عند 72 درجة مئوية 20 s (الخطوة 4)، دورات 31 من الخطوة 2 إلى الخطوة 4 ، وخطوة استطالة نهائي عند 72 درجة مئوية لأدنى 5 استنساخ متجهة المنتج بكر في بكامبيا تعديل 1,300 استخدام Xbaأنا و الباسيفيكيأنا مواقع التقييد. تسلسل ناقل الوجهة المحطة النهائية لتأكيد الاتجاه وتسلسل الجين أيلب المستنسخة في الناقل.<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحويل الذرة والفحص الجزيئي للنباتات المعدلة وراثيا
تم تحويل الأجنة غير ناضجة من الذرة مرحبا-ثانيا خطوط استخدام سلالة EHA101 tumefaciens المتبعة التي تحتوي على ناقل الوجهة المحطة النهائية معربا عن الجين أيلب purpureus لابلاب الخاضعة لسيطرة كامب 35S مروج. كانت متقدمة خمس خطوط الذرة محولة بشكل مستقل لتوليد T6 للدراسات اللاحقة. نباتات الذرة المعدلة وراثيا كانت أصغر بكثير وأقل قوة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
العائد الخسائر في المحاصيل الزراعية بسبب مسببات الأمراض والآفات هو مشكلة عالمية20. حاليا، هو تطبيق لمبيدات الآفات ومبيدات الفطريات الاصطناعية الوسيلة الغالبة للسيطرة من مسببات الأمراض النباتية والآفات، ولكن سمية المتبقية من هذه بيوشميكلس في الأغذية والأعلاف يمكن أن تشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان والحيوان21. ونظرا للأهمية الاقتصادية للذرة كالأغذية والمحاصيل العلفية، خفض أو القضاء على التلوث الأفلاتوكسين من الأهمية بمكان2،3.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد المؤلفون لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ونحن نشكر ديفيد مينتس، جامعة أركنسو لمساعدته في وضع وتحليل الذرة المعدلة وراثيا خلال الأجيال المبكرة. هذا العمل وتلقى دعم مالي من وزارة الزراعة-أرس "المراكز الجهوية للاستثمار" المشروع 6054-42000-025-00D. الإشارة إلى الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المادة هو فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من قبل "وزارة الزراعة الأمريكية". سياسة وزارة الزراعة أرس الفرصة (تكافؤ) ولايات تكافؤ الفرص لجميع الأشخاص ويحظر التمييز في جميع جوانب سياسات شؤون الموظفين التابعة للوكالة، والممارسات والعمليات.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agar | Caisson | ||
| Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
| C1000 Touch CFX96 نظام الوقت | الحقيقي Bio-Rad | ||
| Corning أطباق صقر لزراعة الأنسجة ، 60 مم | فيشر ساينتفيك | 08-772F | |
| Eppendorf ؛ 5424 قارورة فيشر | Scientific | ||
| Erlenmeyer مع سدادة ، 50 مل | Ace Glass | 6999-10 | |
| Ethanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| دوائر ورق الترشيح النوعي المخدد ، 15 سم | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| فرن الهواء VWR | |||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno / Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| قفازات مقاومة للمذيبات العضوية متعددة الفينيل المحسنة | Ansell | 012-15-554 | |
| Innova 44 حاضنة شاكر | Brunswick Scientific | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| غريفين منخفضة الشكل من النيتروجين | |||
| السائل ، 100 مل | DKW علوم الحياة | 14000-100 | |
| ميثانول | |||
| كلوريد | |||
| Nexttec طقم عزل الحمض النووي بخطوة واحدة للنباتات | Nexttec | 47N | |
| نيكون Eclipse E600 المجهر مع كاميرا نيكون DS-Qi1 | نيكون | ||
| نيكون SMZ25 مجهر مجسم مع إضاءة أسقفية C-HGFI وكاميرا Andor Zyla 4.2 sCMOS | Nikon | ||
| Nunc Square Bioassay | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
| قوارير بولي كربونات ، 15 مل | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| بطاطس غطاء مرق | |||
| ، 22 مم | DKW علوم الحياة | 242612 | |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سباعي هيدرات | سيجما-ألدريتش | ||
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | سيجما-ألدريتش | ||
| طيف طقم الحمض النووي الريبي الكلي | سيجما-ألدريتش | STRN50 | |
| طحن من الفولاذ المقاوم للصدأ ، 3/8 بوصة | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
| Stir Plate | |||
| Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 juice | Campbell's | ||
| Whatman Qualitative Grade Plain Sheet ، الصف 3 | فيشر ساينتفيك | 09-820P | |
| شاكر المعصم | بوريل Scientific |
المراجع
- Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
- Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contaminati....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
