عزل ماليجنانت وعدم ماليجنانت ب الخلايا من lck:eGFP الزرد

ملخص

الزرد المعدلة وراثيا lck:eGFP التعبير عن بروتينات فلورية خضراء عالية في الخلايا اللمفية تي، وقد استخدمت لدراسة التنمية الخلية T، وسرطان الدم الليمفاوي الحاد. يمكن استخدام هذا الخط للدراسة ب الخلايا، التي تعبر عن لك في المستويات الدنيا. ويصف هذا البروتوكول تنقية الخلايا ب الخبيثة وغير الخبيثة من الزرد lck:eGFP .

الملخص

الزرد (دانيو rerio) نموذج قوي لدراسة التنمية اللمفاويات. مثل الثدييات، تمتلك ريريو دال- المناعي التكيفي يشمل الخلايا الليمفاوية B و T. دراسات ليمفوبويسيس الزرد صعبة لأن الأجسام المضادة للاعتراف بعلامات سطح خلية ريريو دال- لا تتوافر عموما، تعقيد عزل وتوصيف للسكان اللمفاويات مختلفة، بما في ذلك النسب ب الخلايا. وكثيراً ما تستخدم خطوط المحورة وراثيا مع التعبير فلوروفوري الخاصة بالنسب للتحايل على هذا التحدي. السطر المعدلة وراثيا lck:eGFP قد استخدمت لدراسة التنمية الخلية تي ريريو دال ، وقد استخدمت أيضا لنموذج التنمية الخلية T وسرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-الكل). على الرغم من أن الأسماك lck:eGFP قد استخدمت على نطاق واسع لتحليل T-النسب، فلا قد استخدمت لدراسة الخلايا باء. في الآونة الأخيرة، اكتشفنا أن العديد من الزرد ب الخلايا أيضا التعبير عن لك، أن كان ذلك في المستويات الدنيا. ونتيجة لذلك، وبالمثل الخلايا lck:eGFP ب التعبير عن المستويات المنخفضة للتجارة والنقل. وبناء على هذا الاستنتاج، قمنا بتطوير بروتوكول لتنقية الخلايا ب-النسب من الزرد lck:eGFP ، الذي يقدم لنا هنا. لدينا طريقة توضح كيفية الاستفادة خلية تنشيط الفلورسنت فارز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لتنقية الخلايا ب من أسماك lck:eGFP أو خطوط ذات الصلة، مثل rag2:hMYCمن المعدلة وراثيا مزدوجة؛ سمكة lck:eGFP . في هذه الأسطر، ب الخلايا، خلايا ب خاصة غير ناضجة، التعبير عن التجارة والنقل على مستويات منخفضة ولكن يمكن كشفها، السماح لهم بأن تميز من خلايا تي، التي تعبر عن بروتينات فلورية خضراء عالية. يمكن أن تكون الخلايا ب المعزولة من نخاع الغدة الصعترية، والطحال، والدم أو الأنسجة الأخرى. هذا البروتوكول يوفر طريقة جديدة لتنقية الخلايا ب ريريو دال ، تمكين الدراسات ركزت على مواضيع مثل التنمية الخلية ب وب اللمفاويات الأورام الخبيثة.

المقدمة

وتقدم الزرد سمات قوية، مثل مانيبولابيليتي الجينية والخصوبة العالية والشفافية الضوئية والتنمية السريعة التي تسهل التنمية الفقاريات دراسة استخدام النهج الوراثية. هذه المزايا، جنبا إلى جنب مع الميزات المشتركة من هيماتوبويسيس تيليوست والثدييات، جعل ريريو دال- مثالية للتحليلات المجراة في الدالة ليمفوبويسيس واللمفاويات، من مظهرها أقرب في اليرقات طوال مرحلة البلوغ. يعتمد وضع الدم في الزرد مصانة جيدا العمليات الجينية المشتركة مع الثدييات، وهذه تشمل المناعي التكيفي. بالإضافة إلى ذلك، يحافظ الآليات الجزيئية التي تحكم التنمية اللمفاوية هي ملحوظ بين الزرد والثدييات¹.

على مدى العقدين الماضيين، المعدلة وراثيا ريريو دا....

البروتوكول

بموافقة جميع الإجراءات التي تنطوي على الزرد "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في مركز العلوم الصحية في جامعة أوكلاهوما.

1-عزل ب عدم الخبيثة والخلايا الليمفاوية T من المعدلة وراثيا lck:eGFP الأسماك

1. تخدير الأسماك استخدام تريكيني 0.02% (MS-222) في الأسماك نظام المياه.
2. فحص الأسماك 2-6 شهرا الفلورسنت تيمي، التي تقع في الجانب دورسوميديال في تجويف التطور الزرد وغيرها اريوكروماس¹⁴. استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي (470/40 الطول الموجي الإثارة وتصفية الانبعاثات 525/50) للكشف عن التجارة والنقل.
3. إعداد مقدما 50 مل من تصفية تعقيم 1 × روزويل بارك التذكاري المعهد ا....

النتائج

قمنا باستخدام التدفق الخلوي لتحليل ونظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل بروتينات فلورية خضراء^لو وبروتينات فلورية خضراء^مرحبا خلايا من الغدة الصعترية ونخاع الكلي والطحال من الزرد lck:eGFP المعدلة وراثيا. وكشف تحليل الأسماك عمره 3 أشهر الغدة الصعترية الوارد معظمها بروتينات فلورية خضراء⁺ لمفاوية. بروتينات فلورية خضراء⁺ الخلايا اقتصرت إلى حد كبير على بوابة اللمفاوية الموصوفة سابقا Traver et al.¹⁷. ^ويمكن ملاحظ.......

المناقشة

نحن البلدان المتقدمة النمو ويوفر بروتوكول لعزل الخلايا ب من lck:eGFP المعدلة وراثيا الزرد، إضافة إلى نماذج أخرى ريريو دال- ب-النسب التسميات^3،4هذا. بعض الشيء المثير للدهشة، ذهبت دون أن يلاحظها أحد تحديد بروتينات فلورية خضراء^لو ب الخلايا في هذا الخط منذ الوصف الخاص به في عام 2004. يعتبر عموما، لك أن تي خلية على حدة⁶، ولكن الدراسات الأخيرة وجدت التعبير غير متوقعة لك قبل القاتل الطبيعي والنقوي الخ.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
35 & الميكرو; m mesh	تكنولوجيا مرشح سيفار	7050-1220-000-13
5 مل أنبوب دائري من البوليسترين مع غطاء مصفاة خلية	Falcon Corning العلامة التجارية	352235
50 مل أنبوب مخروطي	VWR الدولي	525-0448
AZ APO 100 مجهر فلوري	نيكون
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC كامارا	نيكون
إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سلفونات. MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
مصل الأبقار الجنيني	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			انظر Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	الإصدار 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
مجانسات الأنابيب الدقيقة المدقة	علوم المجهر الإلكتروني	64788-20
نقاطات
البلاستيك rag2: hMYC< / em>-ER			انظر Gutierrez et al. ، 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030

نقل