استخدام القناصة-Cas9 إلى أدنى حد من آثار خارج الهدف كريسبر-Cas9 دون فقدان النشاط على الهدف عن طريق التطور الموجه

ملخص

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحسين كريسبر-Cas9 لتحقيق خصوصية أعلى دون فقدان النشاط على الهدف. نحن استخدام نهج تطور موجه تسمى قناص-الشاشة لتجد متحولة Cas9 مع الخصائص المرغوبة. قناص--Cas9 متوافق مع مبتوراً واحد-دليل الكشف والتسليم في شكل ريبونوكليوبروتين، الاستراتيجيات المعروفة لتحقيق خصائص أعلى.

الملخص

تطوير مجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر)-البروتينات المرتبطة بها 9 (Cas9) إلى الطرائق العلاجية يتطلب تجنب إثارة خارج الهدف يحتمل أن تكون ضارة. وتم استحداث عدة طرق للحد من هذه الآثار. نقدم هنا، الإشريكيّة القولونية-التطور الموجه استناداً إلى أسلوب يسمى قناص-الشاشة للحصول على متغير Cas9 مع خصوصية الأمثل والاحتفاظ بالنشاط على الهدف، دعا قناص-Cas9. استخدام شاشة قناص، التحديد الإيجابية والسلبية يمكن أن يؤديها في وقت واحد. كما يمكن أن يتكرر الشاشة مع غيرها تسلسل الحمض النووي الريبي (سجرنا) واحد-دليل لإثراء ليضرب إيجابية حقيقية. باستخدام المروج المزدوج CMV-PltetO1 للتعبير عن المتغيرات Cas9، يمكن التحقق أداء المكتبة مجمعة بسرعة في خلايا الثدييات. ويرد أيضا أساليب لزيادة خصوصية قناص-Cas9. أولاً، استخدام سجرناس مبتوراً سابقا قد ثبت لزيادة خصوصية Cas9. خلافا لغيرها Cas9s هندسيا، يحتفظ Cas9 قناص البرية من نوع (WT) مستوى النشاط على الهدف عندما جنبا إلى جنب مع سجرناس مبتورة. ثانيا، إيصال قناص Cas9 في شكل ريبونوكليوبروتين (رنب) بدلاً من تنسيق بلازميد ممكن دون التأثير على نشاطها على الهدف.

المقدمة

في هذه الورقة، ونحن نهدف إلى تحسين خصوصية Cas9 عن طريق الجمع بين استراتيجيات مختلفة. وقد وضعت أساليب مختلفة لتجنب آثار خارج الهدف كريسبر-Cas9. على سبيل المثال، يمكن استخدام سجرناس مبتوراً لتحقيق أعلى خصوصية¹. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تغيير طريقة تسليم Cas9 من شكل بلازميد إلى تنسيق رنب للحصول على أعلى خصوصية². بقايا محددة من الأحماض الأمينية Cas9 العقدية المقيّحة البروتين (SpCas9) قد تم تعديلها وفقا للرشيد تصميم الموصوفة سابقا^3،،من⁴⁵. بدلاً من ذلك، مخلفات الأحماض الأمينية قد تم تعديلها بطريقة عشوائية، وتم تحديد المتغيرات Cas9 مع خصوصية أعلى باستخدام خميرة⁶ أو^7، كولاي⁸ فحص النظام.

ومع ذلك، أفادت العديد من المجموعات أن المتغيرات Cas9 هندسيا باستخدام التصميم لإضعاف التفاعل غير محدد بين Cas9 والركيزة معرض منخفضة في توجيه الأنشطة^7،،من^{89، 10 , 11 , 12}-قمنا بتطوير كولاي-استناداً إلى نظام التطور الموجه، قناص-الشاشة الشاشة عشوائياً موتاجينيزيد Cas9 المتغيرات. كولاي فحص النظام مزايا أكثر من نظام خميرة بسبب كفاءات التحول وقتاً وأعلى سرعة مضاعفة كولاي.

التحديد السلبية والإيجابية على حد سواء، استناداً إلى ثلاثة والبلازميدات مختلفة وجينات للفائدة (غوي) دمج الجينوم كولاي ، تستخدم في شاشة قناص. يتم التعبير عن المتغيرات Cas9 تحت النظام المزدوج-مروج CMV-PltetO1 بلازميد رقم نسخة منخفضة حيث أنه يمكن أن يكون اختبار المرشحين التي تم تحديدها في كولاي في خلايا الثدييات دون الحاجة إلى سوبكلونينغ. هو عرض حكومة الهند في مجال المجين كولاي باستخدام نظام ينقول Tn7. بلازميد سجرنا، الذي يحتوي على مصدر حساسة للحرارة للنسخ المتماثل، وتعرب عن سجرنا الاستهداف غوي؛ ومع ذلك، سجرنا وتسلسل غوي عدم مطابقة تماما. يوجد موقع هدف سجرنا مطابقة تماما في بلازميد ثالثة التي تحتوي على الجين ككدب ، الذي يقوم بترميز منتجات مميتة التي السموم جيرسي. في هذا النظام، تتم إزالة الخلايا معربا عن المتغيرات Cas9 مع أنشطة خارج الهدف السامي لفواصل مزدوجة-ستراند (دسبس) تدخل في الموقع غير مطابقة الموجود في الحمض النووي الجينوم. من ناحية أخرى، يتم أيضا إزالة الخلايا معربا عن المتغيرات Cas9 مع انخفاض في توجيه الأنشطة بسبب الجينات القاتلة ككدب . يمكن تغيير مستوى التعبير من المتغيرات Cas9 بتغيير تركيز أنهيدروتيتراسيكليني (ATC)، الذي يضبط قوة الاختيار.

نحن مسبب أن تحديد موقع الهدف سجرنا غير متطابقة في الحمض النووي الجينومي بدلاً من بلازميد سيزيد من حساسية النظام. وميزة هذا النهج أن هناك موقع جينومي واحد فقط، في حين سيكون هناك العديد من البلازميدات، كل منها يحتوي على موقع هدف، ضمن واحدة خلية كولاي .

باستخدام هذا النظام، وقد حددنا متغير Cas9، قناص-Cas9، الذي يبين مستوى وزن في توجيه الأنشطة وتخفيض الأنشطة خارج الهدف مقارنة بوزن Cas9. قناص--Cas9 تحقيق أعلى نسب خصوصية باستخدام سجرناس مبتوراً أو التسليم على أساس رنب بدلاً من التسليم على أساس بلازميد.

البروتوكول

1-إدماج البشرية غوي في سلالة BW25141 كولاي

1. استنساخ من غوي
   1. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تضخيم بطول 500 bp البشرية غوي الذي يحتوي على مختلف المواقع المستهدفة المرشح عبر طرق PCR القياسية مع الإشعال تحتوي على مواقع إنزيم التقييد نوتي وزهوي.
      ملاحظة: في هذه التجربة، كان غوي EMX1 الجينات البشرية.
   2. هضم المنتج بكر وناقل¹³ pgrg36 مع إنزيمات التقييد نوتي وإكسهوي.
   3. هلام تطهير الأجزاء المطلوب (500 bp و 12 كيلو بايت).
   4. سد الأجزاء معا باستخدام ليجاسى T4. للقيام بذلك، مزيج 50 نانوغرام pgrg36 هضمها و 6 نانوغرام إدراج PCR في حجم رد فعل من 20 ميكروليتر تتضمن العازلة ليجاسى x 1 و 0.5 الإنزيم ليجاسى يو. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) بين عشية وضحاها.
   5. تحويل بلازميد الواصلة إلى الخلايا DH5-α المختصة. تنمو ترانسفورمانتس الناتجة في مرق (رطل) لوريا أجار لوحات تتضمن الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل) في 32 درجة مئوية، واحتضان بين عشية وضحاها. التقاط مستعمرة، وأنها تنمو في رطل الوسائط التي تحتوي على الأمبيسلّين بين عشية وضحاها. عزل بلازميد الحمض النووي من كولاي، استخدام مينيبريب متاحة تجارياً مجموعة. تأكيد إدراج الجزء غوي قبل سانغر التسلسل بلازميد الحصول عليها من إعداد (المصغر الإعدادية) المصغر بلازميد¹³.
2. إعداد BW25141-غوي
   1. تحويلغوي بلازميد pgrg36 التي تم الحصول عليها-إلى سلالة BW25141 كولاي . من الضروري استخدام سلالة BW25141 بغية التقليل من عدد المستعمرات الإيجابية الكاذبة.
   2. تنمو الخلايا المحولة في المخزن المؤقت رطل عند 32 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ويتم إدراج غوي الحمض النووي من سلالة BW25141 (BW25141-غوي). إزالة فيغوي بلازميد pgrg36-من سلالة BW25141-حكومة الهند باستخدام البروتوكول القياسي pgrg36¹³. بإيجاز، تمييع مستعمرة (حوالي 10⁷-إضعاف) وأنها تنمو على صفيحة رطل في 42 درجة مئوية بين عشية وضحاها. متتالية في المستعمرات على لوحة رطل وتنمو لهم في 42 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   3. تأكيد الإدراج غوي الصحيح بمستعمرة بكر، استخدام كبسولة تفجير اقترح في البروتوكول pgrg36: 5 '-جاتجكتجتجكجاجكتجت-3' و 5 '-جاتجاكجتتجتكاكاتجا-3'. التمهيدي تضخيم الحمض النووي الجينومي الإدراج الموقع، وسوف يكون حجم ناتج PCR 904 bp بالإضافة إلى حجم الإدراج (500 bp في هذه الحالة).
   4. إعداد اليكتروكومبيتينت الخلايا BW25141-غوي (يرد وصف بروتوكول مفصلة في الخطوات 3.2.6–3.2.10).

2-إعداد المكتبة البديل Cas9

1. إعداد المكتبة
   1. تحويل ناقلات Cas9⁷ تجاري كولاي mutator سلالة (الجدول للمواد) واتبع إرشادات الشركة المصنعة للحصول على مكتبة متغير (مكتبة Mutator).
   2. إجراء PCR عرضه للخطأ في تسلسل WT Cas9 كله في الموجه Cas9، استخدام مجموعة بكر عرضه لخطأ (جدول المواد).
      ملاحظة: اعتمد البروتوكول المعدل المنخفض-خطأ في قضية القناص-Cas9 لتجنب تعطيل الدالة الأصلية للبروتين.
   3. هضم ناقل Cas9 مع إنزيمات التقييد الملائمة. هلام تنقية المنتج بكر (من الخطوة 2.1.2) والعمود الفقري هضمها.
      ملاحظة: حجم الجين SpCas9 حوالي 4.3 كيلو بايت. زهوي وكبني اختيرت لهضم متجه ببلك-SpCas9 الذي كان يستخدم في قضية القناص-Cas9.
   4. تجميع الجزء العمود الفقري (من الخطوة 2.1.3) وإدراج تضخيمه باستخدام PCR عرضه للخطأ (من الخطوة 2.1.3) عن طريق جزئ متحاور في المختبر .
      ملاحظة: أكثر من 500 نانوغرام من العمود الفقري ضروري للحصول على تركيزات عالية من مكتبة (المكتبة بكر [EP] عرضه للخطأ). واستخدمت اثنين من مجموعات مختلفة PCR عرضه للخطأ لإعداد مكتبات الجيش الشعبي في قضية القناص-Cas9 (مكتبة الجيش الشعبي الأول والثاني).
   5. تنقية المنتجات من الجمعية العامة (من الخطوة 2.1.4) باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي يمكن شطف الحجم المنخفض (الجدول للمواد). الوت مع ميكروليتر 6 المياه خالية من نوكلاس (نفو) وقياس تركيز الحمض النووي.
   6. تحويل أكثر من 500 نانوغرام ناقلات مكتبة Cas9 (لكل مكتبة من المكتبات الثلاث) إلى 50 ميكروليتر من اليكتروكومبيتينت كولاي الخلايا (جدول المواد). انظر البروتوكول انهانسر في 3.2.1-3.2.4 الخطوات. لإعداد مكتبة هذا، استخدم 1 مل من شركة نفط الجنوب المتوسطة بدلاً من 250 ميكروليتر الواحد 50 ميكروليتر من الخلايا المختصة.
   7. جعل 1: 100، 1:1، 000، وتخفيف المضيفين من خليط تحتوي على خلايا تم استردادها مع شركة نفط الجنوب متوسطة. لوحة الخلايا المخفف على لوحات أجار مم 100 رطل وتستكمل مع الكلورامفينيكول (12.5 ميكروغرام/مل). لوحة الخلايا المتبقية على صفيحة² 245 مم. احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
2. حساب المكتبة تعقد
   1. تصوير لوحات تمييع عبر نظام توثيق هلام أو كاميرا رقمية عادية. تشغيل البرمجيات أوبينكفو¹⁴ وتحميل هذه صور لوحات تمييع. تعيين منطقة العد داخل صفيحة وإزالة المستعمرات كاذبة.
   2. مضاعفة عدد المستعمرات يدوياً على عامل تخفيف الحصول على العدد الأصلي من ترانسفورمانتس. تحويل هذه الأرقام إلى النموذج اللوغاريتمي (الأساس 10). حساب المتوسط لتحديد الطابع المعقد للمكتبة.
   3. عندما يتم الحصول على القيمة المرجوة من تعقيد، بجمع جميع المستعمرات على لوحة مربعة 245 مم (من الخطوة 2.1.7) باستخدام الناشرة ومل 20 ليبره تستكمل مع الكلورامفينيكول. لا تنمو المستعمرات التي تم جمعها وتنقية بلازميد المكتبة باستخدام مجموعة ميديبريب تجارية.
      ملاحظة: كلما زاد تعقيد مكتبة، كان ذلك أفضل. عندما حددت قناص-Cas9، كان تحقيق مجموعة متنوعة من 3 × 10⁶ لكل مكتبة.

3-الإيجابية والسلبية في الكشف عن تطور Cas9

1. تحديد الهدف والبناء بلازميد
   1. حدد تسلسل مباعدة سجرنا مستهدفة في حكومة الهند. استبدال بقايا واحد أو اثنين في النوكليوتيدات عشوائي لإنتاج تسلسل غير متطابقة.
      ملاحظة: استخدمت البشرية EMX1 موقع الهدف 3 (جاجتككجاجكاجاجاجا مع أم عبدالله) في قضية القناص-Cas9. يلي التسلسل غير متطابقة المستخدمة: جاجتككجاجكاجااجاجا، جاكككجاجكاجاجاجا، جاجتككجاجكاجاجاجا، وجاجكككجاجكاجاجاجا.
   2. إدراج التسلسل غير متطابقة (راجع الخطوة رقم 3.1.1) إلى بلازميد سجرنا استخدام معيار اليغنوكليوتيد (اليغو) استنساخ الإجراءات⁷.
   3. إدراج التسلسل غير متطابقة مع بام في نهاية 3 ' في p11-أسي-wtx1 (جدول المواد) لتشييد بلازميد ccdB استخدام إجراءات الاستنساخ اليغو القياسية¹⁵.
2. إعداد الخلايا المختصة فحص قناص كولاي
   1. ذوبان الجليد BW25141-غوي اليكتروكومبيتينت الخلايا على الجليد.
   2. أضف 1 نانوغرام كل بلازميد ccdB وبلازميد سجرنا مع عدم التطابق مزدوجة إلى 50 ميكروليتر من الخلايا BW25141-غوي المذابة. بلطف مزج الخلايا بيبيتينج ونقلها إلى ومبومو بريتشيليد سم 0.1 انهانسر.
   3. تحويل كولاي مع البلازميدات اثنين عن طريق انهانسر. إضافة 250 ميكروليتر من شركة نفط الجنوب المتوسطة فور انهانسر. بلطف "الماصة؛" الحل للمزج بين الخلايا والوسط. نقل الخليط إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
      ملاحظة: لأقصى قدر من الكفاءة، تعيين الجهد في 1.80 كيلو فولت، ووقت التشغيل يجب أن يكون بين 4.8 مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد 5.0.
   4. استعادة الخلايا المحولة واحتضانها لهم عند 32 درجة مئوية ح 1 مع الهز لطيف.
   5. لوحة ميكروليتر 125 الخلايا المستردة الأمبيسلّين (50 ميكروغرام/مل)/أجار رطل كاناميسين (25 ميكروغرام/مل) لوحة (شرط الثقافة). لوحة المتبقية الخلايا في الأمبيسلّين/كاناميسين/أرابينوز (1.5 ملغ/مل) طبق أجار رطل (ككدب-التعبير عن حالة). احتضان عند 32 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   6. تحقق من عدم وجود الباقين على قيد الحياة المستعمرات في ككدب-الإعراب عن لوحة الشرط. جمع المستعمرات من لوحة شرط الثقافة باستخدام الناشرة والثقافة لهم في 250 مل من مرق سوبر الأمثل (سوب) المتوسطة يكمل مع 50 ميكروغرام/مل من الأمبيسلّين و 25 ميكروغرام/مل من كاناميسين في 32 درجة مئوية، مع لطيف تهتز.
   7. عندما تشيل الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD₆₀₀) يصل إلى 0.4، قارورة على الجليد. إعداد بريشيليد المياه وحل بريشيليد 10% والغليسيرول (تعقيمها قبل الاستخدام).
   8. الطرد المركزي (في س 4,000 ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) في الخلايا وتجاهل المادة طافية. إضافة 200 مل مياه بريشيليد. ريسوسبيند الخلايا باستخدام ماصة مصلية من 10 مل. كرر هذه الخطوة 3 x.
   9. تغسل الخلايا مع 50 مل محلول الجلسرين 10% بريشيليد. الطرد المركزي لهم كما كان من قبل (في س 4,000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية).
   10. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 300 ميكروليتر من محلول الجلسرين 10%. جعل 50 ميكروليتر مختبرين وتجميدها في نيتروجين سائل. تخزين الخلايا (خلايا قناص-الفحص) في-80 درجة مئوية.
3. قناص-الفحص
   1. تحويل الخلايا قناص-الفحص (من الخطوة 3.2.10) مع 100 نانوغرام البلازميدات Cas9 البديل من كل مكتبة (من خطوة الخطوات 2.2.3.See 2.1.1 و 2.1.4). اتبع الخطوات انهانسر الموضحة في الخطوات 3.2.1–3.2.3.
   2. نقل 250 ميكروليتر من الخلايا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 طازجة. إضافة pg 250 من المنسوجات والملابس لجعل تركيز نهائي 10 نانوغرام/مل. استرداد كل المحتوية على المنسوجات والملابس والمنسوجات والملابس خالية من الخلايا (راجع الخطوة 3.2.4 لخطوة الاسترداد).
   3. لوحة 25 ميكروليتر من تعافي خلايا خالية من المنسوجات والملابس على طبق أجار كلورامفينيكول/كاناميسين رطل (حالة نونسيليكتيفي). إضافة اتفاق المنسوجات والملابس في الخلايا المحتوية على المنسوجات والملابس المستردة لجعل تركيز نهائي من 100 نانوغرام/مل على صفيحة رطل 245 مم. فورا لوحة الخلايا على طبق أجار كلورامفينيكول/كاناميسين/أرابينوز رطل (شرط اختياري). تبني بين عشية وضحاها في 32 درجة مئوية.
      ملاحظة: الحجم والعدد من لوحة رطل تتحدد بحجم التنوع ليشمل الفحص. وفي حالة 100 مم طبق بيتري مع 20 مل رطل، إضافة 2 ميكروغرام من المنسوجات والملابس.
   4. تصوير اللوحات. حساب عدد المستعمرات قابلة للتطبيق باستخدام البرمجيات أوبينكفو¹⁴. (راجع الخطوة 2.2.1) تأكد من أن عدد المستعمرات على لوحة نونسيليكتيفي على الأقل 10 x أكبر من تنوع المكتبة لتغطية كافة المتغيرات.
   5. حساب التردد البقاء على قيد الحياة كما يلي.
      بقاء التردد = عدد المستعمرات على طبق انتقائيا/(عدد المستعمرات على لوحة نونسيليكتيفي x 10)
   6. تجمع المستعمرات التي نجت على لوحات مختارة من جميع المكتبات الثلاثة. احتضان المستعمرات الباقين على قيد الحياة في 250 مل من رطل المتوسطة وتستكمل مع 12.5 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول في 42 درجة مئوية بين عشية وضحاها. عزل المكتبة Cas9 فحص الحمض النووي باستخدام مجموعة ميديبريب.
      ملاحظة: هذه الخطوة مسح بلازميد سجرنا.
   7. كرر عملية الفرز من 3.3.1–3.3.6 الخطوات حتى تصل إلى تواتر بقاء هضبة. استخدام 10 نانوغرام من بلازميد Cas9 المحدد للتحويل و 10 نانوغرام/مليلتر من المنسوجات والملابس أثناء عملية الاسترداد. الحفاظ على تركيز اتفاق المنسوجات والملابس في 100 نانوغرام/مل للشرط انتقائية.
4. خلط والفرز الثاني
   1. خلط المتغيرات المجمعة المحدد باستخدام البروتوكول الدنا التالية. [بكر] تضخيم إدراج Cas9 في بلازميد Cas9 استخدام ترافقه الإشعال، النيوكليوتيدات 150 من حدود إدراج. خلاصة 2 ميكروغرام لتضخيم PCR المنتج مع الدناز أنا لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   2. تنقية bp شظايا 70-200 في طول استخدام 2% [اغروس] هلام التفريد. [بكر] تضخيم الشظايا المنقي. استخدام المنتج كقالب لبكر تضخيم إدراج Cas9 مع الإشعال المناسبة المرافقة Cas9. استخدام PCR المنتج النهائي لبناء مكتبة Cas9 كما هو موضح في الخطوة 2.1.4.
   3. إعداد قناص-فحص خلايا جديدة (انظر القسم 3.2) مع آخر غير متطابقة سجرنا بلازميد (راجع الخطوة رقم 3.1.1). إعادة عملية الفرز (أقسام 3.2-3.3) حتى يصل إلى معدل البقاء على قيد الحياة الهضبة. استخدام 10 نانوغرام من بلازميد Cas9 المحدد للتحويل و 10 نانوغرام/مل المنسوجات والملابس أثناء عملية الاسترداد. الحفاظ على تركيز اتفاق المنسوجات والملابس في 10 نانوغرام/مل للشرط انتقائية.
5. اختيار تطورت والبلازميدات متحولة Cas9
   1. بعد آخر خطوة الفحص، عشوائياً اختيار المستعمرات مائة من لوحة انتقائية والثقافة لهم في رطل المتوسطة المحتوية على الكلورامفينيكول في 42 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   2. عزل البلازميدات استخدام إجراء مينيبريب وتسلسل سانجر إدراج استخدام تسلسل كبسولة تفجير داخل Cas9.
   3. حدد أعلى الخيارات الثلاثة الأكثر شيوعاً لاختبار لهم في خطوط الخلايا البشرية.

4-تقديم Cas9 رنب مع سجرنا مبتوراً

1. التحديد الجينات المستهدفة باستخدام Cas-أوفيندير
   1. اختيار المواقع المستهدفة مع الأكاديمية الصينية للعلوم-أوفيندير (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). حدد نوع بام مناسبة لنوع معين من Cas9 والجينوم المستهدفة (الإنسان، الماوس، الزرد، إلخ.). التعبئة في علامة التبويب سلاسل الاستعلام واختر عدم تطابق رقم، وانقر فوق الزر إرسال .
   2. بعد بضع ثوان، على الهدف (مع عدم تطابق عدد من '0') ومواقع خارج الهدف سوف تظهر. وبصفة عامة، اختيار المواقع خارج الهدف مع واحدة إلى ثلاث حالات عدم التطابق.
2. إعداد قالب سجرنا
   1. تأمر أوليجوس كرنا وتراكرنا مع قالب التسلسلات التالية، إلا وهي كرنا تسلسل:-تاتاكجاكتكاكتاتاجنننننننننننننننننننجتتتاجاجكتاجا 5 '-3'؛ تسلسل تراكرنا:-أجكاككجاكتكجتجككاكتتتتكاجتتجاتاكجاكتاجككتاتتتتاكتجكتاتتكتاجكتكتاااك 5 '-3'. ملء N20 في تسلسل كرنا مع تسلسل المستهدفة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.1.2. لتصميم سجرناس مبتوراً، قم بإزالة القواعد من النهاية 5 ' للحصول على تسلسلات سجرنا N19 أو N18 N17.
   2. إعداد الخليط PCR للتضخيم في التسلسل سجرنا-ترميز كما يلي: الجمع بين 10 ميكروليتر من 5 × المخزن المؤقت، ميكروليتر 0.5 من كرنا اليغو (100 pmol/ميكروليتر)، 0.5 ميكروليتر تراكرنا اليغو (100 pmol/ميكروليتر)، ميكروليتر 2.5 من دنتبس (10 ملم في كل)، ميكروليتر 0.5 من بوليميراز الدنا ، و 36 ميكروليتر من نفو (جدول المواد).
   3. تضخيم القالب باستخدام الشروط التالية، إلا وهي، تمسخ الأولى: 1 دقيقة عند 98 درجة مئوية؛ تمسخ، والصلب، وتمديد: 10 s عند 98 درجة مئوية، 15 s في 54 درجة مئوية، 20 ثانية في 72 درجة مئوية، لدورات 25؛ للتمديد النهائي: 5 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
   4. تحليل 2 ميكروليتر من القالب تضخيم الحمض النووي (من الخطوة 4.2.3) على 2% [اغروس] هلام. تنقية القالب باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR.
      ملاحظة: حجم القالب الحمض النووي هو 125 شركة بريتيش بتروليوم.
3. توليف سجرنا
   1. إعداد الخليط رد فعل لتوليف سجرنا كما يلي: الجمع بين 8.5 ميكروليتر من قالب الحمض النووي (من الخطوة 4.2.3)، 1 ميكروليتر من UTP (25 مم)، 1 ميكروليتر من الأداء النظري المركب (25 مم)، 1 ميكروليتر من غتب (25 مم)، 1 ميكروليتر من ATP (25 مم)، ميكروليتر 4.2 مجكل₂ (100 مم) ، ميكروليتر 4.5 من T7 رنا بوليميراز (50 ش/ميكروليتر)، ميكروليتر 3 من المخزن المؤقت للحمض النووي الريبي بوليميراز x T7 10، 1.2 ميكروليتر من بيروفوسفاتاسي (0.5 يو/ميكروليتر)، ميكروليتر 0.75 من رناسي المانع (40 ش/ميكروليتر) وميكروليتر 4.2 من نفو.
   2. احتضان الخليط رد فعل على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (على الأقل ح 10). إضافة 0.5 ميكروليتر من الدناز (يو 2/ميكروليتر) إلى خليط التفاعل واحتضان في 37 درجة مئوية ل 15 – 30 دقيقة نق سجرنا استخدام مجموعة مواد تنقية الحمض النووي الريبي.
   3. للحد من السمية الناتجة عن استجابة مناعية فطرية التي فجرتها 5-ثلاثي الفوسفات في سجرنا¹⁶، إزالة 5-ثلاثي من دليل الكشف مع العجل الفوسفاتيز القلوية المعوية (CIP) على النحو التالي: علاج 10 ميكروغرام المختبر في- الجيش الملكي النيبالي يدون مع 250 يو من المركز الدولي للبطاطا ح 3 في 37 درجة مئوية حضور 100 "يو رناسي" المانع. تنقية سجرنا يعامل CIP استخدام مجموعة مواد تنقية الحمض النووي الريبي.

5. التعبير البروتين Cas9 WT والقناصة وتنقية

1. تعبير البروتين في كولاي
   1. تحويل والبلازميدات الحيوانات الأليفة¹⁸ ترميز صاحب معلم WT-وقنص-Cas9 إلى BL21 (DE3) كولاي سلالة.
   2. تلقيح 50 مل من رطل المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين مع مستعمرة جديدة لإيواء الحيوانات الأليفة-Cas9 التعبير بلازميد ويهز ذلك بين عشية وضحاها (200 لفة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية (بريكولتوري).
   3. نقل 10 مل ثقافة بين عشية وضحاها إلى 500 مل متوسطة رطل الطازجة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين. احتضان الثقافة مع الهز (200 لفة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية ح 2.
   4. رصد OD₆₀₀ حتى يصل الثقافة إلى سجل منتصف مرحلة النمو (OD₆₀₀ ≈ 0.6 – 0.7).
   5. الحث على التعبير عن البروتين WT أو قناص Cas9 مع الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج، بتركيز 0.25 نهائي nM). احتضان ثقافة عند 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
2. تنقية البروتين
   1. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 5,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
   2. ريسوسبيند بيليه في تحلل المخزن المؤقت (50 مم نة₂بو₄، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 مم، 4 مم ديثيوثريتول [DTT]، بينزاميديني 5 مم، 100 مم فينيلميثيلسولفونيل الفلوريد [بمسف]، ودرجة الحموضة 8) في 20 مل كل غرام من الوزن الرطب.
   3. إضافة بمسف و DTT وليسوزيمي بتركيز 1 ملغ/مل كل نهائي واحتضان المخلوط على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   4. Sonicate الخلايا على الجليد. نبض مرارا وتكرارا لمدة 10 ق في ث 200-300 مع 10 s التبريد الفترة بين كل نبضة، لفترة إجمالية من 20 دقيقة.
   5. الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
   6. إزالة المادة طافية على أنبوب جديد. أضف 1 مل راتنج [اغروس] صاحب الربط إلى 5 مل من مسح ليستي وهزه برفق ح 1 في 4 درجات مئوية.
   7. تحميل خليط الراتنج ليستي/صاحب-ربط [اغروس] على عمود مع منفذ أسفل توج.
   8. إزالة الغطاء السفلي وجمع-التدفق عبر الأعمدة.
   9. أغسل العمود 2 x مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (50 ملم نة₂بو₄، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 20 مم، درجة الحموضة 8)؛ جمع الكسر الغسيل للتحليل بالصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة).
   10. الوت البروتين 10 x مع 1 مل شطف المخزن المؤقت (50 ملم نة₂بو₄، 300 مم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 250 ملم، درجة الحموضة 8)، جمع عينات للحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
   11. تركيز البروتين Cas9 WT أو القناصة الوتيد باستخدام عامل تصفية عمود كاتشين 100. تخزين العينات في حل من 10 ملم والغليسيرول تريس-HCl، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 50% في-80 درجة مئوية.

6-رنب التسليم

1. تعداء وإعداد الخلايا لتسليم رنب
   1. الحفاظ على خلايا HEK293T في دولبيكو لتعديل المتوسطة النسر (دميم) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والمضادات الحيوية 1% عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
   2. مزيج Cas9 WT أو قناص البروتين (2 ميكروغرام) مع سجرنا (2 ميكروغرام) واحتضانها لمدة 10 دقيقة في الرايت جعل مجمعات رنب.
   3. تريبسينيزي وحساب الخلايا. إعداد 2 × 10⁴ خلايا كل رد فعل واحد. تغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وأجهزة الطرد المركزي. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع انهانسر المخزن المؤقت.
   4. رنب اليكتروبوراتي المجمعات في الخلايا باستخدام الإعدادات التالية، إلا وهي 1,300 الخامس، 30 مرض التصلب العصبي المتعدد، وواحد النبض. لوحة الخلايا على لوحة 48-بئر مليئة 500 ميكروليتر من دميم وتستكمل مع FBS والمضادات الحيوية (كما هو موضح في الخطوة 6.1.1) اليمين بعد انهانسر. احتضان عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
   5. عزل الحمض النووي الجينوم مع مجموعة إعداد جدنا، ح 48 بعد تعداء.

7-تعداء والبلازميدات ترميز قناص-Cas9 وسجرنا

1. بناء بلازميد سجرنا
   1. النظام إلى الأمام وعكس أوليجوس مع تسلسل قالب التالية، أي إلى الأمام:-كاككجننننننننننننننننننن 5 '-3'؛ عكس:-آآكننننننننننننننننننننك 5 '-3'. استبدال N20 مع تسلسل المستهدفة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.1.2. قم بتقصير تسلسل الهدف على طول N19 أو N18 أو N17 توليف سجرنا مبتوراً.
   2. يصلب كلا أوليجوس في 1 × T4 الحمض النووي ليجاسى المخزن المؤقت.
   3. هضم مع إنزيم التقييد بساي ناقل pRG2.
   4. هلام تطهير ناقلات هضمها (3,300 bp) باستخدام نسبة 0.8% [اغروس] هلام.
   5. سد اليغو ملدن ويفتت المنقي استخدام ليجاسى T4 في 37 ° c: مزيج 50 نانوغرام من هضم pRG2 و 1 نانوغرام اليغو الملدن في حجم رد فعل من 20 ميكروليتر. تبني على RT لمدة 15 دقيقة.
   6. تحويل المزيج ربط إلى سلالة DH5 ألفا وتنمو ترانسفورمانتس على رطل أجار لوحات تتضمن الأمبيسلّين (100 ميكروغرام/مل) عند 37 درجة مئوية. تأكيد إدخال اليغو في الناقل بالتسلسل القياسي.
2. تعداء والبلازميدات ترميز قناص-Cas9 وسجرنا
   1. الحفاظ على خلايا HEK293T في دميم وتستكمل مع 10% FBS و 1% المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂. قبل تعداء، اليوم تريبسينيزي، وحساب الخلايا. عند العمل في نطاق 48، حسنا، لوحة 1 × 10⁵ خلايا كل بئر في 250 ميكروليتر من متوسط النمو الكامل. ينبغي أن تكون الخلايا روافد 50 ٪-80 ٪ في يوم تعداء.
   2. في الجدول 48، حسنا، إعداد 250 نانوغرام من بلازميد p3s-Cas9 و 250 نانوغرام بلازميد سجرنا تعداء، استخدام كاشف تعداء على أساس المادة الدهنية. مزيج من البلازميدات في 25 ميكروليتر من المصل مجاناً-الفنزويلية.
   3. تمييع 1 ميكروليتر من تعداء الكاشف مع 25 ميكروليتر من المصل مجاناً-الفنزويلية. احتضان المخلوط في RT لأدنى 5 الجمع الخلائط اثنين واحتضان الحل الناتجة في RT لمدة 20 دقيقة على شكل مجمعات بلازميد-ليبوفيكتاميني.
   4. بعد 20 دقيقة من الحضانة، بإضافة 50 ميكروليتر من الحل الذي يحتوي على مجمعات كاشف بلازميد-تعداء مباشرة إلى كل وأيضا الخلايا التي تحتوي على، والمزيج بلطف هزاز لوحة ذهابا وإيابا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في CO₂ حاضنة ح 48 – 72 وظيفة تعداء قبل المعايرة للتعبير التحوير.

8-حساب ترددات إينديل لتحديد الأنشطة في الهدف وخارج الهدف

1. استهدفت تسلسل عميق لتحليل المواقع خارج الهدف على الهدف والمحتملة
   1. عزل الحمض النووي من الخطوة 6.1.5 أو 7.2.4 مع مجموعة إعداد جدنا. إنشاء مكتبات تسلسل العميق بالتضخيم PCR لجدنا مع الإشعال الاستهداف على الهدف وخارج الهدف.
   2. استخدم فهرس كبسولة تفجير لتسمية كل عينة. موضوع المكتبات المجمعة لإقران نهاية تسلسل باستخدام جهاز تسلسل الجيل القادم.
2. تحليل تسلسل العميقة باستخدام Cas-محلل
   1. تحليل بيانات تسلسل العميق باستخدام أداة تقييم Cas-محلل¹⁷.
   2. اختر الملفات فستق ضمن علامات التبويب قراءة 1 و 2 القراءة (قراءة 1 = XX_SXX_L001_R1_001.fastq, 2 القراءة = XX_SXX_L001_R2_001.fastq).
   3. ملء علامة التبويب معلومات أساسية ، وانقر فوق علامة التبويب معلمات التحليل على زر الإرسال .

النتائج

بعد أن يتم تنفيذ قناص-الشاشة، يمكن حساب النسبة المئوية لبقاء المستعمرات بقسمة العدد المستعمرات على لوحة رطل المحتوية على الكلورامفينيكول، كاناميسين، أرابينوز، و "المنسوجات والملابس" (ككا) بالعدد المستعمرات في احتواء اللوحة رطل الكلورامفينيكول وكاناميسين فقط (كورونا). وكان هذه النسبة المئوية عادة ما تكون منخفضة جداً عندما أنجز قناص-الشاشة مع مكتبات SpCas9. يمكن إثراء يضرب إيجابية حقيقية بتكرار الشاشة مع تجمع الباقين على قيد الحياة. في هذا الممثل القناص الشاشة، على سبيل المثال، حصلت نسبة 100 ٪ البقاء على قيد الحياة بعد الشاشة الثالثة (الشكل 1). يمكن أن يتم استخدام رنبس أو ترميز بلازميد قناص-Cas9 ترانسفيكشنز لأهداف مختلفة والناتجة عن الهدف، واستهدفت الأنشطة خارج الهدف تقاس amplicon التسلسل (الشكل 2). في معظم الأهداف، قناص-Cas9 يظهر على نفس المستوى من الأنشطة على الهدف ويمكن أيضا استخدام أعلى نسب خصوصية سجرناس يقطع بالوزن بالمقارنة مع زيادة تحسين النوعية (الشكل 3). ولكن استخدامها يقتصر على سوى بضعة أهداف لأنها تؤدي إلى انخفاض الأنشطة على الهدف مقارنة بطول كامل سجرناس، في معظم الحالات. ولذلك، يجب اختبار سجرناس مع أطوال مختلفة (من 17-إلى 20-أسعار الصرف السوقية) ويجب أن يقاس على الهدف وخارج الهدف أنشطة لتحسين النوعية.

رقم 1: يؤديها الممثل قناص-شاشات مع مكتبات مختلفة من المتغيرات Cas9 عشوائية. مكتبة mutator, مكتبة الجيش الشعبي الأول، ومكتبة البرلمان الأوروبي الثاني تشير إلى المكتبات باستخدام مجموعات تجارية مختلفة. الأول والثاني والنهائي الإشارة إلى عدد المرات التي تم إثراء الشاشة أداء⁷. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.⁷. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: في الهدف وخارج الهدف يقترن أنشطة WT Cas9 أو Cas9 قناص تسلسل دليل 20-مير عبر بلازميد أو رنب. تم تحديد نسب خصوصية بتقسيم النشاط على الهدف من النشاط خارج الهدف. أشرطة الخطأ تشير إلى وزارة شؤون المرأة (n = 3)⁷. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.⁷. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 3: في الهدف وأنشطة قناص-Cas9 WT-Cas9 التي تم الحصول عليها باستخدام سجرناس ذات الطول المتغير استهداف المواقع FANCF01 وآفس بالمقارنة مع الهدف. وحددت نسب خصوصية بتقسيم الترددات إينديل في مواقع على هدف تلك في مواقع خارج الهدف منها. يتم الإشارة إلى سجرناس مع جوانين متطابقة في 5 ' المحطة (GX18 أو GX19) وتلك مع جوانين غير متطابقة (gX17 أو gX18 أو gX19 أو gX20). وحسبت نسب خصوصية لا عندما كانت الأنشطة المستهدفة في تطبيع < 70%⁷. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.⁷. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المناقشة

تتوفر لأولئك الذين يرغبون في تجنب إجراءات الفرز مرهقة للحصول على Cas9 قناص، البروتين Cas9 قناص وبلازميد الترميز. باستخدام هذه المواد، وطول سجرنا، التي توفر أعلى نسبة خصوصية، ينبغي تحديد أمثل. وباﻹضافة إلى ذلك، يوصي بتسليم القناص-Cas9 وسجرنا في شكل رنب نظراً لأنه عادة ما يؤدي إلى خصوصية أعلى نسبة من التسليم في شكل بلازميد. خلافا للقناص-Cas9، متغيرات Cas9 هندسية أخرى غير متوافقة مع^6،سجرناس مبتوراً⁷ أو التسليم في رنب الاستمارة رقم⁸ (باستثناء هيفي-Cas9).

لقناص-الشاشة، يتم اختيار التسلسل غير متطابقة أهم خطوة. وينبغي تجنب اختيار سجرنا غير متطابق الذي يقترن بالانقسام وانخفاض النشاط نحو تسلسل غوي . إذا لم يكن الأمر كذلك، سوف لا تنشق المتغيرات Cas9 بمستوى WT خصوصية كولاي المجينية الحمض النووي مع الموقع الهدف غير متطابقة. هذا التأثير سيؤدي إلى عدد كبير من المستعمرات الخلفية، تعرض للخطر كل الفحص الداخلي.

سبب كولاي بسرعة مضاعفة الوقت وكفاءة تحويل عالية مقارنة بالخميرة، قناص-الشاشة هو فائدة مقارنة بأساليب الفرز على أساس الخميرة. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكون القناص-الشاشة أكثر حساسية من غيرها كولاي-استناداً إلى النظم التي تتم في الموقع غير متطابقة بلازميد: هناك نسخة واحدة من الحمض النووي الجينومي وواحد فقط وبالتالي نسخة من الموقع غير متطابقة في نظامنا، ولكن عددا كبيرا من والبلازميدات داخل وحيدة الخلية كولاي .

ويمكن أيضا تحسين خصائص أخرى اندونوكليسيس الحمض النووي التي تحفز دسبس، مثل SaCas9 أو Cpf1s، أو باستخدام شاشة قناص. ولسوء الحظ، لا يمكن استخدام شاشة قناص زيادة خصوصية المحررين قاعدة مباشرة، نظراً لعدم حمل المحررين قاعدة دسبس في الحمض النووي الجينومي كولاي. كما استخدم المحررين قاعدة نيكس أو إصدار الميت من Cas9 في جوهر النظام الخاص بهم، يمكن زيادة الخصائص المميزة للمحررين قاعدة باستخدام عدد الزيارات التي تم الحصول عليها من قناص-الشاشة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الفوسفاتيز القلوي ، العجل المعوي (CIP)	NEB	M0290L
أمبيسلين ملح الصوديوم	فيشر كيميائي	BP1760-25
أنهيدروتيتراسيكلين هيدروكلوريد	سيجما ألدريتش	37919 أو 94664
محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات	Welgene	LS203-01	مكون الوسائط
BamHI	Enzynomics	R003L
Chloramphenicol	Sigma Aldrich	R4408
تنويع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الطفرات العشوائية	Clontech	630703	مجموعة تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرضة للخطأ
خلط الحمض النووي	جينا بيوساينس	PP-103
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)	Welgene	LM001-17	وسائط الثقافة
خلايا إندورا ذات الكفاءة الكهربائية (DUO)	Lucigen	60242-2	E. القولوني< م > خلايا ذات كفاءة كهربائية لإعداد المكتبة
مصل الأبقار الجنيني (FBS)	Welgene	S101-01	مكون
الوسائط Gene Pulser II	Bio-Rad		E. القولونية < / em> معدات التثقيب الكهربائي
GeneMorph II طفرات تكوين العشوائية	Agilent	200550	مجموعة PCR المعرضة للخطأ
الحمض النووي الجيني مجموعة	GenAll	106-152	gDNA-prep kit
Glycerol	BioShop	GLY001.1
GP / MP Cuvette ، 0.1 سم	Bio-Rad	BR165-2089	E. القولوني< EM> معدات التثقيب الكهربائي
HEK293T الخلية	ATCC	CRL-11268	خط الخلية
البشرية كبريتات الكاناميسين	Acros Organics	450810500
L- (+)- أرابينوز	سيجما ألدريتش	A3256-25G
طقم تنقية LaboPass PCR	Cosmogenetech	CMR0112
LaboPass البلازميد الصغير	Cosmogenetech	CMP0112	مجموعة الإعدادية المصغرة
LB Agar Miller	Formedium	LMM0202
LB Broth Miller	Formedium	LMM0102
Lipofectamine	Invitrogen	11668019	كاشف التعدين
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	تجميع جيبسون (متساوي الحرارة في المختبر < / em>إعادة التركيب) خليط
تعداء النيون	الحرارية	MPK5000	RNP معدات التثقيب الكهربائي
نظام نيون 10 & مايكرو ؛ L Kit	Thermo	MPK1096	RNP معدات التثقيب الكهربائي
NucleoBond Xtra Midi EF	Macherey-Nagel	740420.50	Midi-prep kit
Oligo Clean & amp	Zymo Research	D4061	التي تتيح الشطف منخفض الحجم
وسائط الإرسال Opti-MEM	Gibco
LS31985070 p11-lacY-wtx1	Addgene	# 123945
pgrg36	Addgene	# 16666	E. القولوني< / em> سلالة الطفرة
Phusion عالية الدقة DNA Polymerase	NEB	M0530L
Pyrophophatase	NEB	M2403L
Ribonucleotide	NEB	N0450L
RNase مثبط	NEB	M0314L
T7 RNA polymerase	NEB	M0251L
Turbo Dnase	Ambion	AM2238
XbaI	Enzynomics	R013L
XL1-Red Competence خلايا	Agilent	200129