مقالة منهجية

نموذج واجهة دماغ دم البشري لدراسة نقاط عبور الحاجز بمسببات الأمراض أو الأدوية وتفاعلاتها مع الدماغ

DOI:

10.3791/59220

⸱

أبريل 9, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكول وصف الإعداد سيلولو في بي بي بي (حاجز الدم في الدماغ)-إدراج الثقافة البوليستر مسامية الغشاء مينيبرين النظام بغية تقييم نقل الجزيئات الحيوية أو العوامل المعدية عبر BBB بشرية وعلى فسيولوجية تؤثر على خلايا المخ المجاورة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقت مبكر فحص الأدوية العصبي على صلة وموثوق بها في طراز بي بي بي سيلولو على الاختراق وتفاعلها مع الحاجز ولحمة الدماغ ما زالت حاجة غير ملباة. ولسد هذه الفجوة، قمنا بتصميم 2D في نموذج سيلولو، بي بي بي-مينيبرين، من خلال الجمع بين من بوليستر في الأغشية المسامية الثقافة إدراج البشرية BBB النموذجي مع مينيبرين التي شكلتها ثقافة ثلاثي لخلايا الدماغ البشري (الخلايا العصبية وخلايا microglial astrocytes). BBB-مينيبرين سمح لنا باختبار نقل مرشح المخدرات محصن (على سبيل المثال، نيوروفيتا)، عن طريق بي بي بي، لتحديد استهداف محددة لهذا الجزيء على الخلايا العصبية، وإظهار أنه كان الحفاظ على الممتلكات محصن من المخدرات بعد المخدرات قد عبرت بي بي بي. كما أثبتنا أن BBB-مينيبراين يشكل نموذجا جديرا باهتمام للكشف عن مرور جزيئات الفيروس عبر حاجز غشائي الخلايا ومراقبة العدوى من مينيبراين بجسيمات الفيروس نيوروينفاسيفي. BBB-مينيبرين نظام موثوق به، سهلة للتعامل مع الباحثين المدربين في خلية ثقافة التكنولوجيا والتنبؤيه لتعمل خلايا الدماغ بعد العلاج أو الإهانة. الفائدة من هذا القبيل في اختبار سيلولو ستكون ذات شقين: إدخال ديريسكينج خطوات مبكرة في وضع المخدرات من جهة، والحد من استخدام الحيوانات في التجارب من ناحية أخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدماغ يفصلها عن الدوران الجهازي بنية غير المسامية التي تحد من التبادل بين حمة المخ، والدم، ويسمى حاجز الدم في الدماغ (BBB). معظمها تتألف من خلايا بطانة الأوعية الدموية الدماغية، بي بي بي بشكل حيوي تتفاعل مع astrocytes وارتشاح microglia والخلايا العصبية من حمة المخ المجاورة. أن المهام الرئيسية الثلاث ل BBB هي إنشاء وصيانة التوازن الأيوني للوظائف العصبية، إمداد الدماغ بالمواد المغذية، والحماية من الإصابات السمية أو دخول مسببات الأمراض1،2، التي تسهم في الحفاظ على التوازن في الدماغ ولها وظائف3. هذا الحاجز كفاءة حتى أن المخدرات قليلة فقط يمكن عبر4،بي بي بي5. وفي الوقت الحاضر، الأساليب المتاحة للتنبؤ بما إذا كان جزيء سيتم تمرير BBB ومنتشر في المخ تتكون من السابقين فيفو الدراسات المتعلقة بتتبع الصورة المادية، تشريح الجثة في دماغ متطوعين من البشر بالتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) أو الحيوانات الأليفة (الانبعاث المركز التصوير المقطعي) أو الدوائية والدراسات السريرية الحرائك الدوائية في الحيوانات6،،من78. هذه التقنيات ونماذج لها بعض القيود، مثل القرار محدودة من الحيوانات الأليفة وانخفاض حساسية التصوير بالرنين المغناطيسي6،8، صعوبة تحديد حجم الجزيئات (أي جزيئات الأجسام المضادة التي تعتمد على سبيل المثال) أن سوء اختراق الدماغ7، الإكلينيكية دراسات تكلفة مرتفعة، ومنتجع للتجارب الحيوانية.

والنقطة الأخيرة مهم لأنه، حسب 3R القواعد (الاستبدال والحد وصقل التجارب الحيوانية) طلبت الإدارات التنظيمية أن الباحثين على وجه السرعة إيجاد بديل علمياً دقيقا للحيوان التجريب9،10،11،،من1213،،من1415.

على مدى العقود الماضية، واقترحت عدة نماذج في المختبر من بي بي بي16،،من1718 بزراعة على تصفية غشاء إدراج خلايا بطانية من مختلف الأنواع مثل الماوس والفئران والأبقار والخنازير. وبقدر ما يتعلق بالجنس البشري، توافر الخلايا الأولية النادرة والصعبة دفعت الباحثين تطوير نماذج البشرية تستند إلى خلايا الدماغ مخلدة بطانية أو الخلايا الجذعية المشتقة من الإنسان19،20، 21. هذه الحواجز هي البدائل المناسبة في المختبر من BBB شريطة أن يعربون عن علامات خلية بطانية، علامات تقاطع ضيق، والناقلين افلوكس، ذائبة الناقلين، المستقبلات، والاستجابة ل المحفزات غشائي 20. كانت جزيئي عدد قليل من النماذج بي بي بي باستخدام تصفية غشاء إدراجات المغلفة مع خلايا بطانية وأنواع الخلايا الأخرى (أي، أستروسيتيس، والخلايا العصبية أو بيريسيتيس22،23،24). والهدف من هذه الثقافات المشتركة زيادة الخصائص الفيزيائية BBB بالاستفادة من إفراز العوامل القابلة للذوبان astrocytes/الخلايا العصبية أو بيريسيتيس.

ومع ذلك، يتضمن أيا من هذه النماذج حمة الدماغ الدراسة والتنبؤ بمصير مرشح المخدرات بعد أن اجتاز الحاجز. ولذلك، كان هدفنا بناء سيلولو في الدم/الدماغ واجهة, BBB-مينيبرين، بالجمع بين نموذج BBB وثقافة من خلايا المخ المختلطة في مجموعة واحدة. BBB-مينيبرين يستخدم نظام ثقافة يتكون من عامل تصفية مسامية إدراجها في بئر لوحة الثقافة خلية مولتيويل. عامل التصفية فهي مغلفة بالخلايا هكميك/D3، خط خلية غشائي دماغ البشري قد ثبت موثوق بها للغاية لاختبار25،،من2627، لتشكيل BBB المخدرات بي بي بي. مينيبرين، التي هي ثقافة المشاركة متباينة من الخلايا العصبية البشرية و astrocytes المستمدة من28،خط الخلية NTera/Cl2.D129 مختلطة جنبا إلى جنب مع خط الخلية البشرية microglial Cl5 كم/30 بالنسبة المقابلة microglia مقابل نسب astrocytes العصبية ل الدماغ31، يزرع في الجزء السفلي من اللوحة جيدا.

إلى جانب دراسة مرور المخدرات عبر BBB ومصيرهم في حمة، واجهة الدم في الدماغ في طراز سيلولو يمكن أن تكون أداة قوية لمعالجة دخول مسببات الأمراض في الدماغ (نيوروينفاسيفينيس)، التشتت في الدماغ (نيوروتروبيسم) والسمية (الفوعة العصبية) أنها يمكن أن تمارس على خلايا المخ الحشوي. ستستفيد من تطوير الكفاءة في نموذج سيلولو الدراسات الفوعة العصبية ونيوروينفاسيفينيس ويكون مفيداً لتحل محل النماذج الحيوانية. استخدام طقم BBB-مينيبرين32، أثبتنا النمط الظاهري نيوروينفاسيفي من طفرات الفيروسية النادرة التي تراكمت في سلالة الفيروس "تم الفرنسية" من "فيروس الحمى الصفراء" (أي، الهولندي-يفف،من3334) المستخدمة لإعداد وقف لقاح يفف الحي ومرور بيوموليكولي نيوروريجينيراتيفي ومحصن تسمى نيوروفيتا (يشار بولاية نيفادا من الآن فصاعدا في المخطوطة)35. لأن NV بطبيعة الحال لا يعبر غشاء الخلية ولا بي بي بي، نيفادا تنصهر مع الجزء المتغير (فة) من جسم واحد في سلسلة من اللاما تعبر الأغشية البيولوجية بما في ذلك بي بي بي ويعمل كخلية اختراق جزيء (CPM)36. ويبدو ممتلكات CPM فة يتوقف عند نقطة isoelectric وطول فة37.

هذا في اختبار سيلولو يجب أن تجعل من الممكن لفرز الجزيئات التي يمكن أن يحتمل أن تعبر BBB قبل الاضطلاع الحرائك الدوائية وتحليل الدوائية في الحيوانات، ومن الناحية المثالية في نفس الوقت لتكون قادرة على التنبؤ بسلوكهم في الجهاز العصبي حمة. هذا النظام بيولوجيا ذات الصلة ويسهل إعداد والتعامل مع من مهنيين مدربين تدريبا جيدا في خلية ثقافة26،29،،من3038. الفائدة من هذا القبيل في اختبار سيلولو سيكون من شقين هما: خفض تكاليف الاختبارات الإكلينيكية من ناحية، والحد من استخدام اختبار الحيوانات من ناحية أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-خلية ثقافة عمل نتيرا/CL2. D1 إلى إعداد ثقافة المشارك هنيورونس بعد الانقسامية وهاستروسيتيس (NT2-n/A)

ملاحظة: هذا هو مكون مينيبرين (الشكل 1).

  1. استزراع في Ntera/Cl2.D1
    1. إزالة قنينة خلايا المجمدة من خزان النتروجين السائل. الحفاظ على الجليد.
    2. ذوبان الجليد الخلايا سرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    3. نقل الخلايا في أنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة (تعديل النسر المتوسطة دولبيكو: المتوسطة F-12 مزيج المغذيات) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، الجلوتامين 2 مم، والبنسلين 100 وحدة دولية و 100 ميكروغرام ستربتوميسين (أي إكمال دميم F12 المتوسطة).
    4. الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). ننأى بيليه في 2 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
    5. نقل في قارورة زراعة الأنسجة T75 في البوليسترين مع معاملة محددة للخلايا ملتصقة الحساسة (T75Cell+) التي تحتوي على 13 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
    6. الثقافة الخلايا في حاضنة الحفاظ على 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة حتى التقاء 90% (أي حوالي 5 أيام). تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
  2. سوبكولتورينج Ntera/Cl2.D1 والتضخيم
    1. إزالة المتوسطة من قارورة.
    2. شطف أحادي الخلية في الطبقة مع 10 مل من الفوسفات المخزن المؤقت المالحة (PBS) وتستكمل مع Ca2 + و Mg2 +.
    3. شطف المونولاير الخلية مع 10 مل من محلول يدتا (أبقى على RT).
    4. أضف 3 مل من محلول يدتا التربسين (0.05% التربسين، يدتا 0.02 في المائة)، واحتضان 2 دقيقة في الرايت
    5. اهتز قارورة وتأكد من أن يتم فصل الخلايا من سطح البلاستيك.
    6. أضف 10 مل متوسطة F12 دميم كاملة لإلغاء تنشيط التربسين، ونقل في أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ز في الرايت
    7. فصل بيليه مع 10 مل متوسطة كاملة واستخدام 1 مل لتطعيم كل قارورة جديدة التي تحتوي على 14 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
      ملاحظة: ثلاثين خلية T75+ قوارير مطلوبة لكل الاختلاف.
    8. احتضان قوارير في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة حتى التقاء 90%.
  3. التفريق بين NTera/Cl2.D1 في أستروسيتي الخلايا العصبية البشرية ثقافة المشارك
    ملاحظة: هذا هو العنصر الرئيسي مينيبراين.
    1. في اليوم 0، فصل الخلايا مع التربسين-يدتا كما هو موضح في الخطوة 1، 2 وتنأى بيليه خلية لكل قارورة مع 2 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
    2. أضف 1 مل تعليق خلية (الموافق 5 × 106 خلايا) في أطباق بيتري بلاستيكية 60 من 85 مم تحتوي على 11 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
      ملاحظة: الخلايا سوف لا نعلق على البلاستيك وسيتم تجميعها بشكل زائف نيوروسفيريس (انظر الصورة في اللوحة السفلي من الشكل 1). احتضان أطباق بيتري 60 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة لمدة يوم واحد.
    3. في يوم 1، أضف 1 مل من كاملة F12 دميم المتوسطة وتستكمل مع 130 ميكرون لكل-ترانس حمض الريتينويك (ATRA) كل طبق بتري (تركيز نهائي ATRA 10 ميكرومتر) وعودة الأطباق على 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة ح 24.
    4. في يوم 2، نقل المتوسطة التي تحتوي على مجالات خلية لكل Petri Dish في أنبوب 50 مل والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 50 س ز والرايت ديسوسياتي بعناية بيليه فضفاضة مع 13 مل من كامل F12 دميم المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكرون ATRA بعناية فائقة وإضافة ال (ه) 13 مل في قطر 85 ملم جديدة طبق بيتري.
      ملاحظة: عبر الممرات المختلفة، بالغة الأهمية للحفاظ على كثافة مجالات ترتفع كثافة الحصول عليها في اليوم 2 (أي، حول كثافة 70%). ولذلك، إذا كان يتم تخفيض كثافة المجال، تقليل العدد الإجمالي من أطباق بيتري وفقا لعدد الخلايا.
    5. تكرار الإجراء أعلاه (الخطوة 1.3.4) في أيام 4 و 6 و 8.
    6. في يوم 10، كرر الإجراء أعلاه ولكن إضافة المجالات بقوارير T75 خلية+ بدلاً من أطباق بتري. إضافة الخلايا من صحن بيتري واحد إلى واحد خلية T75+ قارورة.
    7. في 11 يوما، 13 و 15 و 17، تغيير الوسيطة المستخدمة مع 14 مل من F12 دميم كاملة وتستكمل مع 10 ميكرون ATRA.
    8. في يوم 19، تغيير المتوسطة مع 14 مل متوسطة F12 دميم كاملة دون ATRA كل قارورة.
    9. وفي يوم 20 ننأى بلطف الخلايا مع التربسين/يدتا على النحو التالي.
      1. لكل قارورة T75 خلية+ ، شطف الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع Ca2 + و Mg2 +؛ احتضان الخلايا مع 4 مل يدتا لمدة 5 دقائق في الرايت
      2. إزالة بعناية يدتا وإضافة 2 مل يدتا التربسين واحتضان 7 دقيقة في الرايت هزة بلطف جداً قارورة وإضافة بعناية 8 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة.
      3. أجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة على 160 × ز والرايت ننأى بيليه الخلية في 13 مل من إكمال F12 دميم المتوسطة ونقل في قارورة T75 خلية+ .
        ملاحظة: سيسمح تفارق لطيف جداً مع التربسين يدتا يتعافى ATRA متباينة من الخلايا من الخلايا تيراتوكارسينوما الأصلية، والتي ترتبط بشدة البلاستيك وير.
    10. وفي يوم 21، إزالة المتوسطة والخلايا الميتة. إضافة 14 مل من كامل F12 دميم المتوسطة وتستكمل مع 5% FBS، الجلوتامين 2 مم والبنسلين 100 وحدة دولية، 100 ميكروغرام ستربتوميسين و 0.5 ميكرومتر من أراك (سيتوزين β-د-أرابينوفورانوسيدي) (إكمال 5% FBS دميم F12-أراك).
    11. في 23 يوما، 25 و 28، تستخدم استبدال المتوسطة مع 14 مل من 5% FBS دميم F12-أراك.
    12. في 29 يوما ما يصل إلى 49 (كل يوم اثنين)، تستخدم استبدال المتوسطة مع 14 مل من إكمال المتوسطة F12 دميم تستكمل مع 5% مصل بقرى الجنين، الجلوتامين 2 مم، البنسلين 100 وحدة دولية، 100 ميكروغرام ستربتوميسين، 5 ميكرون من فودر (2-5-مخفضات ' ديوكسيوريديني) و 10 ميكرون Urd (أردين) (الكامل 5% FBS دميم F12-فودر-Urd).
    13. في 50 يوما، المتوسطة استبدال المستخدمة مع 14 مل من كامل F12 دميم المتوسطة وتستكمل مع 5% FBS، الجلوتامين 2 مم، 100 وحدة دولية البنسلين، 100 ميكروغرام ستربتوميسين و 10 ميكرون Urd (إكمال 5% FBS دميم F12-Urd).
    14. في 51 يوما ما يصل إلى 95 (مرتين في أسبوع)، تستخدم استبدال المتوسطة مع 14 مل كاملة 5% FBS دميم F12-Urd.
      ملاحظة: يمكن أن تكون الخلايا المستخدمة لإجراء التجارب من يوم 51 لكن لا يتجاوز اليوم 95. يسمح استخدام علاجات التسلسلي مع مثبطات الانقسام استرداد السكان نقية من ثقافة المشارك هنيورون بعد الانقسامية وهاستروسيتيس (NT2-n/A).
    15. أن البذور الخلايا، المضي قدما في تريبسينيزيشن لطيف كما هو موضح ليوم 20.

2-خلية عمل الثقافة البشرية microglial الخلايا كم/Cl5

ملاحظة: هذا هو عنصر ميكروجليال مينيبرين (الشكل 1).

  1. Microglial البشرية استزراع الخلايا كم/Cl5
    1. إزالة قنينة خلايا المجمدة من خزان النتروجين السائل. الحفاظ على الجليد.
    2. تحسن سريع في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    3. نقل الخلايا في أنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل من إكمال المتوسطة F12 دميم تستكمل مع 5% مصل بقرى الجنين، الجلوتامين 2 مم، والبنسلين 100 وحدة دولية و 100 ميكروغرام ستربتوميسين (أي، المتوسطة FBS دميم F12 5% كاملة).
    4. الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت ديسوسياتي بيليه مع 2 مل متوسطة FBS دميم F12 5% كاملة.
    5. نقل في قارورة T75 خلية+ التي تحتوي على 13 مل من 5% اكتمال F12 دميم FBS المتوسطة.
    6. خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة حتى التقاء 90%. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
  2. سوبكولتورينج الخلايا البشرية microglial كم/Cl5
    1. إزالة المتوسطة من قارورة.
    2. شطف أحادي الخلية في الطبقة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع Ca2 + و Mg2 +.
    3. شطف المونولاير الخلية مع 10 مل من محلول يدتا (أبقى على RT).
    4. أضف 3 مل من محلول يدتا التربسين واحتضان 2 دقيقة في الرايت
    5. اهتز قارورة وتأكد من أن يتم فصل الخلايا من سطح البلاستيك.
    6. أضف 10 مل من 5% FBS دميم F12 المتوسطة كاملة لإلغاء تنشيط التربسين، ونقل في أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز والرايت
    7. فصل بيليه مع 10 مل متوسطة كاملة واستخدام 1 مل لتطعيم كل قارورة جديدة تحتوي على 14 مل متوسطة FBS دميم F12 5% كاملة.
    8. احتضان قوارير في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة حتى التقاء 90%.

3-ثقافة العمل مع هكميك/D3 معطف إدراجات المليئة بالثغرات وإعداد بي بي بي

  1. استزراع الخلايا البطانية البشرية هكميك/D3 (الشكل 2)
    1. تمييع نوع أنا فأر الكولاجين إلى 01:30 مع الماء المعقم النقي (خلية ثقافة الصف).
    2. نقل 10 مل في قارورة T75 خلية+ واحتضان ح 2 في 37 درجة مئوية، ونسبة 5% CO2 وحاضنة الرطوبة 95%.
    3. إزالة الحل الكولاجين واستبدله مع 15 مل متوسطة غشائي خلية يكمل مع 10 ملم هيبيس (يشار إلى الخلية البطانية كاملة المتوسطة).
    4. إزالة البرد قنينة من الخلايا من خزان النتروجين السائل. الحفاظ على الجليد.
      ملاحظة: الخلايا المزروعة، وقدم الكثير بذور كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. خط الخلية مشمول باتفاق لنقل مواد بيولوجية. الخلايا يتم الحصول عليها في الممر رقم 25، ولا ينبغي أن تستخدم أكثر من مرور 35.
    5. تحسن سريع في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    6. نقل الخلايا في قارورة T75 خلية+ والعودة قارورة على 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة ح 2 إلى 4.
    7. إزالة المتوسطة بعناية دون فقدان أو إزالة الخلايا. شطف الخلايا مرة واحدة مع 10 مل متوسطة الخلية البطانية كاملة.
    8. إضافة 15 مل متوسطة الخلية البطانية كاملة.
    9. خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 95% رطوبة حتى التقاء 100% (لا تقل عن 4 أيام) دون تغيير في المتوسط.
  2. سوبكولتورينج هكميك/D3 لإعداد الإدراج من بي بي بي
    1. معطف قارورة T75 خلية+ جديدة أو إدراج مع النوع أنا "الكولاجين الفئران" كما هو موضح أعلاه (الخطوة 3.1).
    2. إزالة المتوسطة من قارورة. شطف أحادي الخلية في الطبقة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع Ca2 + و Mg2 +.
    3. إضافة 2 مل من محلول يدتا التربسين واحتضان 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. اهتز قارورة والتأكد من أن الخلايا بعيدة تماما عن سطح البلاستيك.
    5. إضافة 4 مل متوسطة الخلية البطانية كاملة لإلغاء تنشيط التربسين.
    6. مع 5 مل ماصة بلاستيكية، ميكانيكيا ننأى بالخلايا يسفط ومسح تعليق خلية في حين الحفاظ على ماصة 5 مل إلى أسفل قارورة 5 مرات على الأقل.
    7. عد الخلايا واستخدام 5 × 104 خلايا/إدراج ثقافة 12 غشاء بوليستر أيضا إدراج insert و 2 × 106 خلايا لقارورة T75 خلية+ . تعد أيضا ثلاث مرشحات دون خلايا لتجارب PELy (أي، نفاذية خلايا بطانية لإبليس الأصفر انظر أدناه الفقرة 4.2) مع إدراج الثقافة غشاء البوليستر.
    8. احتضان قوارير أو إدراج في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة حتى التقاء 100%.
    9. لا تقم بتغيير وسيلة لقارورة T75 خلية+ حتى مرور جديدة. على العكس من ذلك ل BBB على ثقافة غشاء البوليستر إدراج: تغيير متوسطة في أيام 2 و 4، استخدم بي بي بي لإجراء تجارب عليها في يوم 6.

4-البناء ومراقبة الجودة من BBB-مينيبرين (الشكل 2)

  1. إعداد "البوليستر" BBB-مينيبرين إدراج الثقافة غشاء الجهاز (الشكل 2)
    1. تنمو خلايا هكميك/D3 12 البوليستر إدراج الثقافة غشاء مرشحات لمدة 6 أيام في المتوسط غشائي خلية قبل استخدامها للتجربة.
    2. معطف 12 لوحة جيدا مع بولي-د-يسين (1 مل/حسنا، 10 ميكروغرام/مل، ح 4 في RT)، ثم لامينين (1 مل/حسنا، 1 ميكروغرام/ملليلتر، بين عشية وضحاها في RT).
    3. إزالة laminin وإضافة 1 مل من الخلية البطانية المتوسطة وتستكمل مع 5% FBS (متوسط الخلايا البطانية 5%).
    4. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    5. بلطف تريبسينيزي NT2-n/A (كما هو موضح في الخطوة 1.3.9) وكم/Cl5 (كما هو موضح في الخطوة 2، 2) وفصل الكريات الخلية مع خلية غشائي الكامل المتوسطة.
    6. عد الخلايا، ومزيج 3.6 × 105 NT2-n/A و 0.4 × 105 كم/Cl5 الخلايا/حسنا والبذور 12 لوحة جيدا.
    7. عند T = 24 ساعة (24 ساعة بعد البذر): تغيير المتوسطة المستخدمة مع الخلية البطانية كاملة الطازجة المتوسطة (مينيبرين الخلايا والخلايا البطانية) ونقل الثقافة غشاء البوليستر هكميك/D3 إدراج تصفية أعلى الخلايا مينيبرين. احتضان BBB-مينيبرين في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
      ملاحظة: ثم BBB-مينيبرين التي سوف تتألف من طبقة من الخلايا البطانية البشرية هكميك/D3 في تصفية عزل المقصورة لومينال (أو حجرة "الدم") وثقافة مختلطة للخلايا البشرية hNT2-n/A وحكم/Cl5 (مينيبرين) في الجزء السفلي من تعريف جيد حجرة أبلومينال (أو "الدماغ" حجرة) (الشكل 2).
  2. التحقق من صحة نفاذية غشائي BBB-مينيبرين (مراقبة الجودة) (الشكل 2)
    1. إعداد المخزن المؤقت النقل (السل)، وهو المخزن المؤقت لحبس (هانكس متوازن الملح حل) مع Ca2 + و Mg2 + تستكمل مع بيروفات صوديوم حبيس و 1 ملم 10 ملم.
    2. إعداد 12 لوحات جيدا مع 1.5 مل من المخزن المؤقت للنقل كل بئر.
    3. T = 0، جعل جديدة تستكمل نقل المخزن المؤقت مع 50 ميكرومتر إبليس الأصفر (LY-السل).
    4. عكس كل مرشح رأسا إزالة بعناية متوسطة دون التأثير على حاجز غشائي خلية.
    5. وضع عامل التصفية على اللوحة جيدا 12 شغلها وإضافة 0.5 مل لي السل.
    6. احتضان اللوحات في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    7. في نقل T = 10 دقيقة عوامل التصفية في السل الجديد شغل 12 لوحات جيدا والحفاظ على حجرة أبلومينال اللوحة الأولى للقراءة OD.
    8. T = 25 دقيقة، كرر الخطوة 4.2.7.
    9. T = 45 دقيقة، وقف النقل عن طريق إزالة عوامل التصفية من اللوحات. الحفاظ على أبلومينال ومقصورات لومينال لتدابير التطوير التنظيمي.
    10. نقل في 96 الظلام أيضا لوحات العينات: 10 ميليلتر مع 190 تيرابايت ميليلتر للي--السل والمقصورات لومينال، 200 ميكروليتر من عينة للمقصورات أبلومينال.
    11. قياس fluorescence LY-السل الموجودة في العينات المختلفة في λ428 شمال البحر الأبيض المتوسط λ535 شمال البحر الأبيض المتوسط (طول الإثارة وانبعاث أمواج، على التوالي).
    12. حساب نفاذية غشائي (Pe) تجاه LY-السل (PeLY) وفقا سيفلينجير-بيرنبويم، A et al. (1987)39 ودا كوستا، A et al. (2018)34 باستخدام الصيغة:
      1/السوق = (1/الباسيفيكي) – (1/PSf) و PeLY= PSe/س.
      ملاحظة: PSf هو نفاذية عامل التصفية دون خلايا، الباسيفيكي هو نفاذية عامل التصفية مع الخلايا، PSe هو نفاذية الوقت أحادي الطبقة غشائي سطح أحادي الطبقة، S هو سطح أحادي الطبقة (لعامل تصفية جيدا 12 = 1.12 سم2 )، وأعرب عن peLY في سم/دقيقة. هكميك/D3 Peلي ينبغي أن يكون بين 0.7 و 1.2 x 10-3 سم/دقيقة يتوقف أساسا من FBS استخدامها في التجارب. هام: Peلي أعلى مما يعني 1.2 BBB لا ضيق ما يكفي ويمكن ملاحظة بعض التسرب. تجاهل هذه الحواجز.

5-استخدام BBB-مينيبرين لتسليط الضوء على وجود الجزيئات الفيروسية العصبية الغازية في عينة لقاح "فيروس الحمى الصفراء"، أن الفيروس "تم الفرنسية"، يفف-الهولندية 34 (الشكل 3)

  1. معبر BBB وتكاثر فيروسات الحمى الصفراء في مينيبرين
    1. استخدام BBB-مينيبرين إعداد كما هو موضح في الخطوة 4.1.7 24 ساعة قبل إضافة هذا الفيروس؛ يستعاض عن المتوسط بواسطة الخلية البطانية FBS 2%.
      ملاحظة: أنها بالغة الأهمية لتجنب تغيير المتوسطة فقط قبل إضافة هذا الفيروس. تغيير الوسيلة يمكن تنشيط الخلايا البطانية البشرية وعابر فتح الحاجز الذي سيسمح بمرور الفيروس. هنا يتم تغيير المتوسطة 24 ساعة قبل البدء التجربة.
    2. T = 0, إضافة 3500 اللوحة تشكيل وحدات (بفو) من يفف-الهولندي المخفف في 50 ميليلتر من 2% FBS خلية غشائي المتوسطة بعناية شديدة على رأس المقصورة لومينال. يتم تلقيح تحكم BBB-مينيبرين مع 50 ميليلتر من 2% FBS خلية غشائي المتوسطة دون الفيروس. تحديد Peلي على رفيق جيد.
    3. احتضان BBB-مينيبرين في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    4. بعد 24 ساعة، إزالة جهاز عامل التصفية إدراج الثقافة غشاء البوليستر وتحديد PeLY، عينة 1 مل من حجرة أبلومينال وتيتراتي الفيروس كما هو موضح بألف دا كوستا وآخرون (2018)34. استبدال المتوسطة مع الطازجة 2% FBS غشائي الخلايا المتوسطة.
    5. احتضان BBB-مينيبرين في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    6. بعد 72 ساعة، عينة المتوسطة من حجرة أبلومينال وتيتراتي الفيروس، أو استخراج الجيش الملكي النيبالي من الخلايا مينيبراين لتحليل التعبير الجيني كما هو موضح بألف دا كوستا وآخرون (2018)34.
  2. تضخيم متغيرات تم من يفف-الهولندي على خلايا مينيبرين بمقاطع من المسلسل
    1. استخدام مينيبرين الخلايا المغلفة 12 لوحات جيدا (أي خطوات 4.1.6 و 4.1.7).
    2. الوقت أشر ح 0، إضافة 3,500 اللوحة تشكيل وحدات من يفف-الهولندي المخفف في 50 ميليلتر من 2% FBS خلية غشائي المتوسطة بعناية شديدة على رأس الخلايا (لومينال المقصورة).
    3. بعد ح 1، إزالة المتوسطة مع العدوى الفيروس واستبدال مع الطازجة 2% FBS غشائي الخلايا المتوسطة.
    4. بعد 48 ساعة، عينة من 500 ميليلتر من المتوسط الثقافة وتصيب الطازجة مينيبرين الخلايا
    5. بعد ح 120، عينة من 500 ميليلتر من المتوسط الثقافة وتصيب الطازجة مينيبرين الخلايا.
    6. بعد ح 192، حفظ الثقافة المتوسطة (= مخزون فيروس المخصب) واستخراج الجيش الملكي النيبالي من الخلايا مينيبرين لتحليل التعبير الجيني كما هو موضح بألف دا كوستا وآخرون (2018)34.

6-استخدام BBB-مينيبرين لدراسة عبور BBB والدماغ استهداف خلية بيوموليكولي

  1. النقل عبر BBB من خلية تستهدف بيوموليكولي
    1. استخدام مينيبرين-بي بي بي أعد كخطوة وصفت 4.1.7.
    2. في الوقت نقطة ح 0، إضافة بيوموليكولي (في المثال ينص في القسم نتيجة، أضيفت 58.75 نانوغرام/BBB من جزيئات نيوروتاج NV بيرمينت الخلية الواحدة BBB-مينيبرين إدراج.
    3. احتضان BBB-مينيبرين في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    4. بعد 24 ساعة، إزالة جهاز عامل التصفية إدراج الثقافة غشاء البوليستر وتحديد Peلي، ثم وصمة عار الخلايا مينيبراين على هنيورونس نيوروفيلامينت Nf200 والكشف عن وجود بيوموليكولي في مينيبراين (في المثال المتوفرة في النتيجة القسم، نيوروتاج NV تم الكشف عن استخدام جسم مضاد ضد بكتيريا العلامة أنه يحتوي على35،40).
  2. النقل عبر بي بي بي بيوموليكولي نيوروريجينيراتيفي والمقايسة محصن اللاحقة في مينيبراين بعد بيوموليكولي وقد عبرت بي بي بي
    1. استخدام مينيبرين-بي بي بي إعداد كما هو موضح في الخطوة 4.1.7.
      ملاحظة: لجزيئات تستهدف فقط من الخلايا العصبية، الخلايا مينيبراين يمكن الاستعاضة عن الخلايا العصبية فقط الخلايا (NT2-N)38.
    2. في الوقت نقطة ح 0، إضافة 58.75 نانوغرام/BBB-مينيبرين جيدا من الخلية بيرمينت NV جزيئات (النموذج النشط CPM-نيوروتاج-NV، النموذج غير نشط CPM-نيوروتاج-NVΔ) وصف جيم براد et al. (2014)35.
    3. احتضان BBB-مينيبرين في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    4. بعد ح 4، جعل الجروح الفردية مع إبرة حقن (26GX1/2 "، 12-4.5، تيرومو، بلجيكا) في الخلايا مينيبرين. جعل خدوش على الأقل 10 لكل فرد كذلك. تحديد Peلي على الرفيق جيد.
    5. احتضان BBB-مينيبرين في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    6. بعد ح 8، يستعاض عن المتوسط في حجرة أبلومينال بواسطة الخلايا غشائي كاملة جديدة.
      ملاحظة: من المهم استبدال المتوسطة في هذه الخطوة نظراً لإصابة الخلايا مينيبرين يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية، ومن ثم الإفراج عن المركبات السامة للخلايا.
    7. احتضان BBB-مينيبرين في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% رطوبة.
    8. بعد 48 ساعة، الملون الخلايا لتجديد إكسون هنيورونس كما هو موضح بجيم براد et al. (2013)40.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB-مينيبرين سيلولو في تجريبية النموذجية لواجهة الدم في الدماغ.

يتم إعداد BBB-مينيبرين على نظام إدراج الثقافة غشاء البوليستر لتقليد حجرة دم في الطابق العلوي وحجرة الدماغ في الطابق السفلي من الواجهة الدم في الدماغ (الشكل 2 أ، ب). فإنه يتكون من حجرة لومينال مع خلايا البطانية هكميك/D3 على تصفية تشكيل بي بي بي ومقصورة أبلومينال، الذي يحتوي على مينيبرين البشرية الثلاثي-ث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة قد دللنا على كيفية بناء سيلولو في الدم/الدماغ واجهة, BBB-مينيبرين، من خلال الجمع بين نموذج BBB وثقافة مختلطة الدماغ الخلايا الدماغية (مينيبرين) في مجموعة واحدة. وهذا النظام بيولوجيا ذات الصلة، من السهل إعداد والمجربون مدربة تدريبا جيدا في خلية ثقافة للتعامل.

أما بالنسبة لأي نموذج آخر في المختبر من بي بي بي، أن الحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها إذا تم تطبيق التحكم الشديد من ضيق الحاجز. وينبغي اختبار إدراج بعناية النفاذية وإدراج أي مع قيم النفاذية غير كافية (أي، PeLY...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكانت الملكية الفكرية للنظام براءات الاختراع المشار إليه في 32و 35 و 38.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الدراسة وأيد بالمنح الداخلية من معهد باستور، بما في ذلك منحة إينسيتاتيفي (PTR 435) ومنحة قدمت "Contrat de مناصرة à la بحوث" سانوفي باستور لمعهد باستور. ) أ (دا كوستا وأيده منح شركة سانوفي-باستور وفلوريان باكا هو المستفيد منحة الدكتوراه المقدمة من ANRT (الرابطة الوطنية للبحوث وتكنولوجي de la). ونحن مدينون "العلاقات العامة" بيار أوليفييه كورو والدكتور ميلر فلورنسا لإجراء مناقشات مفيدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
12 لوحة بئرCorning3336
5-fluoro-2 ' ديوكسيوريدينميرك-سيجما ألدريتشF0503
طبق بتري 85 ممSarstedt83-3902-500
Anti-Nf200Merck-Sigma AldrichN4142
& beta & -mercapto-ethanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME / Cl5Unit é ; de Neuroimmunologie Viraleبناء على طلب إلى الدكتور لافون
CMCكالبيوكيم217274
السيتوزين بيتا ؛ -D-arabinofuranosideMerck-Sigma AldrichC1768
Dark 96 ألواح بئرCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004الخلية البطانية المتوسطة
الإيثانولكارلو إربا529121
FBSهيكلونSV30015-04
الفورمالديهايدميرك سيجما ألدريتش252549
GIEMSARAL التشخيصي320310
الماعز المضاد للفأرجاكسون للأبحاث المناعية115-545-003
الماعز المضاد للأرانبالحرارية ScientificR37117
HBSS مع Ca2 + -Mg2 +Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC / D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-glutaminThermofisher Scientific25030-024
Lucifer YellowMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera / Cl2D.1ATCCCRL-1973
بارافورمالديهايد15714
PBS بدون Ca2 + -Mg2 +Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2 + -Mg2 +Thermofisher Scientific14040-091
Pen / StrepEurobioCXXPES00-07
Poly-d-LysineMerck-Sigma AldrichP1149
إطالة الذهبThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
Rat Collagen ICultrex3443-100-01
حمض الريتينويك All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
طقم تنقية الحمض النووي الريبيQIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
بيكربونات الصوديوم 5.6٪EurobioCXXBIC00-07
الصوديوم بيروفاتثيرموفيشر العلمي11360
خلية T75 + قارورةSarstedt83-1813-302قارورة البوليسترين لزراعة الأنسجة مع معالجة سطحية محددة (خلية +) للخلايا الملتصقة الحساسة
TranswellCorning3460إدراج ثقافة الغشاء المسامي البوليستر
Trypsin-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
Ultra Pure WaterThermofisher Scientific10977-035
UridineMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVقارورةداكار
علوم المجهر الإلكتروني IP لقاح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37(2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671(2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408(2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة