تشريح المحلية Ca2 + الإشارات في الخلايا المستزرعة بالمؤشرات المستهدفة للغشاء Ca2 +

Hiroko Bannai; Matsumi Hirose; Fumihiro Niwa; Katsuhiko Mikoshiba

doi:10.3791/59246

مقالة منهجية

تشريح المحلية Ca^{2 +} الإشارات في الخلايا المستزرعة بالمؤشرات المستهدفة للغشاء Ca^{2 +}

9.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59246

⸱

مارس 22, 2019

Hiroko Bannai¹^,² , Matsumi Hirose² , Fumihiro Niwa²^,³ , Katsuhiko Mikoshiba²

¹Japan Science and Technology Agency, PRESTO, ²Laboratory for Developmental Neurobiology, RIKEN Center for Brain Science, ³École Normale Supèrieure, Institut de Biologie de l'ENS (IBENS), Institut national de la santè et de la recherche mèdicale (INSERM), Centre national de la recherche scientifique (CNRS), École Normale Supèrieure, PSL Research University

في هذه المقالة

ملخص

وهنا يقدم بروتوكول ل Ca^{2 +} التصوير في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، الذي يتيح لتشريح Ca^{2 +} إشارات في القرار سوبسيلولار. هذه العملية لا تنطبق على جميع أنواع الخلايا التي تسمح للتعبير عن وراثيا المرمزة Ca^{2 +} المؤشرات.

الملخص

أيون الكالسيوم (Ca^{2 +}) هو جزيء رسول عالمي داخل الخلايا التي تحرك مسارات إشارات متعددة، مما يؤدي إلى نواتج البيولوجية المتنوعة. التنسيق بين اثنين من Ca^{2 +} إشارة المصادر – "Ca^{2 +} تدفق" من خارج الخلية وتخزين "Ca^{2 +} الإصدار" من داخل الخلايا Ca2 + هيولى (ER) – يعتبر أن تكمن وراء أنماط الزمانية المتنوعة من كاليفورنيا ^{2 +} الإشارات التي تسبب متعددة الوظائف البيولوجية في الخلايا. والغرض من هذا البروتوكول هو وصف Ca^{2 +} تصوير أسلوب جديد يتيح الرصد من اللحظة الأولى من "Ca^{2 +} تدفق" و "Ca^{2 +} الإصدار". OER GCaMP6f مؤشرا وراثيا مرمزة Ca^{2 +} (جيتشي) تتألف من GCaMP6f، التي تستهدف الغشاء الخارجي ER. ويمكن رصد OER-GCaMP6f Ca^{2 +} الإصدار بدقة الزمانية أعلى من GCaMP6f التقليدية. جنبا إلى جنب مع جيسيس المستهدفة لغشاء البلازما، يمكن وصف الزمانية Ca^{2 +} إشارة النقش بدقة سوبسيلولار. سوبسيلولار استهدفت Ca^{2 +} المؤشرات الموضحة هنا، من حيث المبدأ، متاح لجميع أنواع الخلايا، حتى المجراة في التصوير ايليجانس كاينورهابديتيس الخلايا العصبية. في هذا البروتوكول، إدخال Ca^{2 +} تصوير في الخلايا من خطوط الخلايا والخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الثقافات الأولية منفصلان، ووصف إعداد الأوراق المالية المجمدة للفئران الخلايا العصبية القشرية.

المقدمة

Ca^{2 +} إشارات تمثل برفع Ca^{2 +} تركيز داخل الخلايا. Ca^{2 +} هو الرسول الثاني العالمي للخلايا حقيقية النواة. استخدام Ca^{2 +}, خلايا تعمل عبر مسارات الإشارات داخل الخلايا المتنوعة وحمل النواتج البيولوجية المختلفة. على سبيل المثال، في الخلايا العصبية، الإصدار حويصلة متشابك في محطة presynaptic، التعبير الجيني في نواة، وتحريض اللدونة متشابك في بوستسينابسي ينظمها Ca^{2 +} إشارات مميزة التحديد تنشيط المناسبة المصب الإنزيمات في المواقع الصحيحة، ومع التوقيت الدقيق¹.

أنماط الزمانية المكانية محددة من Ca^{2 +} إشارات تنشيط الإنزيمات المتلقين للمعلومات المحددة. Ca^{2 +} إشارات يتم إنشاؤها بواسطة التنسيق بين Ca^{2 +} مصدرين مختلفين: Ca^{2 +} تدفق من الفضاء خارج الخلية و Ca^{2 +} الإصدار من هيولى (ER)، الذي يخدم كمرجع مصدق Ca داخل الخلايا^{2 +}تخزين. معنى الزمانية المكانية Ca^{2 +} مما يشير إلى نمط للحث على وظيفة خلية محددة أيضا معتمد من قبل نانودومينس من 10-100 ميكرون Ca^{2 +} التي تم إنشاؤها بالقرب من Ca^{2 +} قنوات في غشاء البلازما أو ER الغشاء². الأهم من ذلك، مصدر Ca^{2 +} إشارات واحد من أهم العوامل المحددة للإنتاج البيولوجي المتلقين للمعلومات. في الخلايا العصبية، قد Ca^{2 +} تدفق و Ca^{2 +}الإفراج عن آثار عكسية على تجميع حمض غاما – أمينوبوتيريك (GABA) مستقبلات (GABA_AR) عند نهايات جابايرجيك، المسؤولة عن تثبيط ³من استثارة الخلايا العصبية. Ca^{2 +} تدفق مصحوبة بالإثارة العصبية الضخمة يؤدي إلى تشتت متشابك GABA_AR الكتل، وبينما كاليفورنيا مستمرة^{2 +} الإصدار لائحة يشجع تجميع غابا متشابك_ألفروبية. مجموعات أخرى كما أفاد أن ضبط اتجاه النمو والأقماع اعتماداً على المصدر من Ca^{2 +}الإشارة: Ca^{2 +} تدفق يدفع النفور، بينما Ca^{2 +} الإفراج عن أدلة الجاذبية لنمو الخلايا العصبية مخروط⁴. ولذلك، من المهم أن نفهم تماما Ca^{2 +} إشارات المسارات الأساسية لنواتج محددة الخلوية، تحديد مصدر Ca^{2 +} الإشارات بوصف Ca^{2 +} إشارات في القرار سوبسيلولار.

في هذا البروتوكول، يصف لنا Ca^{2 +} تصوير أسلوباً تقرير Ca^{2 +} إشارات في القرار سوبسيلولار، الذي يسمح تقدير Ca^{2 +}إشارة المصادر (الشكل 1). Ca^{2 +} ميكرودومينس تحت غشاء البلازما فقط بنجاح تحت مراقبة مرمزة وراثيا Ca^{2 +} مؤشرات (جيسيس) يستهدف غشاء البلازما عن طريق إلحاق إشارة التعريب غشاء البلازما لك داخل Src كيناز إلى N-تيرميني جيسيس⁵. للكشف عن نمط Ca^{2 +} إشارة قرب لائحة بأفضل دقة المكاني والزماني، مؤخرا وضعنا OER-GCaMP6f، في أي GCaMP6f⁶ أهداف لائحة الغشاء الخارجي، استخدام البروتين transmembrane ER. يمكن تقرير OER-GCaMP6f إحساس مرهف Ca^{2 +} الإصدار لائحة بأفضل دقة الزمانية المكانية من GCaMP6f نونتارجيتيد التقليدية في كوس-7 خلايا⁷ و الخلايا HEK293⁸، بتجنب نشر Ca^{2 +} وجيسيس . أكدنا أيضا أن عفوية Ca^{2 +} الارتفاع في astrocytes هيبوكامبال مثقف عنها OER-GCaMP6f أظهرت نمطاً الزمانية المكانية مختلفة مقارنة بالتي ترصدها GCaMP6f المستهدفة لغشاء البلازما (لك-GCaMP6f)⁷ ^،⁹، مما يشير إلى أن Ca^{2 +} التصوير مع OER-GCaMP6f في تركيبة مع GCaMP6f لك يسهم في تشريح Ca^{2 +} إشارات في القرار سوبسيلولار لتحديد مصادرها.

في الوقت الحاضر، نحن تفاصيل البروتوكول المتعلق بتشريح Ca^{2 +} الإشارات في خلايا هيلا والعصبية-astrocyte مختلطة الثقافات مطلي على الزجاج كوفيرسليبس. Ca^{2 +} التصوير تقنية مع جيسيس المبين هنا، لك-GCaMP6f، مستهدفة من قبل غشاء البلازما RCaMP2¹⁰ (لك-RCaMP2)، وقابلة للتطبيق على كافة الخلايا التي يمكن التعبير عن هذه جيسيس OER-GCaMP6f (الشكل 1).

البروتوكول

جميع التجارب الموضحة هنا أقرتها لجنة السلامة بتبريد والحيوان تجربة اللجنة، طبقاً للمبادئ التوجيهية الصادرة عن وزارة التعليم والثقافة، والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا اليابانية.

1-إعداد الخلايا

إعداد بولي (اثيلينيميني)--المغلفة كوفيرسليبس
ملاحظة: ينصح بطلاء Poly(ethyleneimine) (بي) للجهاز الزجاج، كما أنه يسمح للخلايا العصبية و astrocytes لإرفاق أحكام كوفيرسليبس دون منع تطورها. ومع ذلك، أساليب طلاء أخرى (مثل ornithine بولي وبولي L-يسين، laminin طلاء) تتوفر أيضا، إذا لزم الأمر، للاطباق أسفل الزجاج.
1. ضع ساترة زجاجية قطرها 18 مم في كل من لوحة 12-جيدا جيدا. إعداد 0.04% بي الحل (12.5 مل/12-بئر لوحة) باستخدام الماء المعقم.
2. أضف 1 مل محلول بي 0.04% لكل بئر. التأكد من أن هناك لا فقاعات تحت كوفيرسليبس.
3. احتضان اللوحات في حاضنة₂ CO بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
4. وفي اليوم التالي يغسل كوفيرسليبس المغلفة 3 x مع 1 مل من الماء المعقم. إزالة الحل بي مع المضخة وإضافة 1 مل من الماء المعقم لكل بئر ويهز لوحة 12-جيدا حيث أنه يمكن أن تغسل بالحل بي بين اللوحة وساترة دقة. كما بي المتبقية السامة للخلايا، ضمان أن الماء بعد الغسيل النهائي ويستنشق تماما.
5. تجفيف وتعقيم كوفيرسليبس داخل غطاء محرك السيارة مع الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) خفيفة لمدة 15 دقيقة على الأقل. ويمكن تخزين الطبق المغلفة بي عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين. إلقاء الضوء على الأطباق مع الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
6. إضافة 5 مل ماء المقطر المعقم في المسافة بين الآبار لمنع تبخر المتوسطة الثقافة.
طلاء خطوط الخلايا
ملاحظة: وينص هذا البروتوكول مجرد مثال واحد تعداء في الخلايا من خطوط خلايا الثدييات، مثل خلايا هيلا وخلايا كوس-7. يمكن للمستخدمين تطبيق البروتوكولات تعداء الأخرى التي هي الأمثل للتجارب التي تقوم بها. في هذا القسم، وسوف يصف لنا البروتوكول ثقافة الخلية هيلا، الذي ينطبق أيضا على خلايا كوس-7.
1. في اليوم قبل تعداء، ثقافة الخلايا في طبق ثقافة 10 سم حتى بلوغهم التقاء 70%-90%.
2. بريوارم المتوسط الثقافة (انظر الجدول للمواد) إلى 37 درجة مئوية.
3. تغسل الخلايا 2 x مع الفوسفات مخزنة المالحة دون Ca^{2 +} و Mg^{2 +} (برنامج تلفزيوني [-]).
4. نضح في PBS(-) وإضافة 1 مل من الإيثيلين التربسين 0.5% حمض (يدتا) الحل واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ل 90 ثانية حتى بلوغهم شكل دائري.
5. إضافة مل 9 من بريوارميد الثقافة المتوسطة لوقف تريبسينيزيشن. تمييع الخلايا مع الثقافة المتوسطة بنسبة 1:6.
6. البذور 1 مل مخففة الخلايا المغلفة بجزيرة الأمير إدوارد كوفيرسليبس في لوحات 12-جيدا.
إعداد الثقافة هيبوكامبال astrocyte العصبية مختلطة من الجرذان أو الفئران
ملاحظة: الأقسام 1.3 و 1.4 يجب أولاً إعادة النظر ووافق رعاية الحيوان مؤسسية واستخدام اللجنة ويجب أن تتبع الإجراءات المعتمدة رسميا لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. ويرد المخطط الانسيابي للبروتوكول ثقافة العصبية في الشكل 2.
1. إعداد جميع الكواشف تحت غطاء محرك السيارة الاندفاق الصفحي. مم الثقافة المتوسطة النسر تعديل "مكان دولبيكو" (دميم) إلى 100 اثنين الأطباق (حوالي 20 مل/طبق) الموجودة في ثلاجة.
2. إعداد 50 مل من تشريح متوسطة تتألف من دميم وحمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك عيار 20 ملم 4 (حبيس) (انظر الجدول للمواد)، والاستغناء عن المتوسط إلى ثلاثة أطباق الثقافة 60 مم (حوالي 7 مل/طبق) وثمانية من 35 مم أطباق الثقافة (حوالي 2 مل/طبق). وضع الأطباق في الثلاجة آخر.
3. إعداد 50 مل من المحلول الملحي الحضانة، تتألف من الحل الملح المتوازن هانكس تستكمل مع 20 مم حبيس (انظر الجدول للمواد)، ومكان 8 مل من المحلول الملحي في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد.
4. إعداد متوسطة الطلاء مع الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM) تستكمل مع B-27، الجلوتامين والبنسلين والستربتوميسين (انظر الجدول للمواد). الحفاظ على هذه الوسيلة في درجة حرارة الغرفة (20-28 درجة مئوية).
5. تعقيم الأدوات الجراحية مع الإيثانول 70%.
6. ضع منشفة ورقية في وعاء زجاجي مع غطاء و 1 مل من إيسوفلوراني. واسمحوا isoflurane تتبخر لمدة 1 دقيقة.
7. ضع الفئران حوامل أو ماوس في جرة المعدة وفقا للخطوة 1.3.6 وإبقاء الحيوان في الجرة حتى أنه تم تخديره من عميق (حوالي 30 ثانية إلى 1 دقيقة).
8. يأخذ هذا الحيوان أنيسثيتيزيد من الجرة وتطهير الحيوان ومعدات تشريح بالرش لهم مع الإيثانول 70%. قطع خط الوسط البطني مع مقص تشريح القياسية وملاقط واستخراج الرحم من الفئران الحوامل أو الماوس.
9. استخراج الأجنة E18 – 19 من الرحم الفئران الإناث تخديره أو الماوس، استخدام مقص تشريح دقيق، ثم وضع الأجنة المستخرجة مع ملقط خاتم إلى دميم المثلج في صحن 10 سم للتخدير البارد.
10. قطع رأس الجنين مع مقص تشريح غرامة ووضع رأسه في دميم المثلج في صحن 10 سم.
11. استخراج المخ من كل الجنين بالملقط سيمكين 13 سم منحنى والملقط مع نصائح الجميلة. الحفاظ على الدماغ في الأجلين المتوسط وتشريح المثلج في صحن 60 ملم.
12. إزالة هيبوكامبي، استخدام الملقط اثنين مع نصائح الجميلة، على المديين المتوسط وتشريح المثلج في الأطباق 35 ملم والحفاظ على الأنسجة المعزولة في حضانة المحلول الملحي توضع في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد.
13. أغسل هيبوكامبي مع المالحة الاحتضان واحتضان مع التربسين (1.25 ملغ/مل) والدناز أنا (0.25 مغ/مل) في المياه المالحة الحضانة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. حجم حاضنات الموصى به 2.7 مل من المحلول الملحي حضانة و 150 ميليلتر من 20 x التربسين الأسهم 150 ميليلتر من الأسهم x 20 الدناز (انظر الجدول للمواد).
14. أغسل هيبوكامبي 3 x مع المالحة المثلج الحضانة.
15. نضح المياه المالحة الاحتضان وإضافة 1 مل الوسط الطلاء الذي يحتوي على الدناز أنا (10 ميليلتر من حل الأسهم؛ انظر الجدول للمواد). تعليق الأنسجة العاشر لا يزيد عن 20 بيبيتينج وقياس كثافة خلايا قابلة للتطبيق، باستخدام عداد الخلية والمقايسة تريبان الأزرق.
16. تمييع الخلايا هيبوكامبال لكثافة 1.4 × 10⁵ صالحة خلايا/مل للفئران و 2.5 × 10⁵ قابلة للحياة الخلايا/مليلتر بالنسبة للفئران. البذور 1 مل تعليق خلية المخفف على كوفيرسليبس المغلفة بجزيرة الأمير إدوارد في لوحات الثقافة 12-جيدا.
17. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في CO2 حاضنة لمدة 2 – 3 أيام.
18. إزالة المتوسطة والطلاء. لا تدع الخلايا تجف. بلطف وبسرعة إضافة المتوسطة صيانة بريوارميد (انظر الجدول للمواد).
إعداد ثقافة العصبية-أستروسيتي القشرية مختلطة الفئران والخلايا المجمدة، وإحياء الثقافات المجمدة
ملاحظة: وكان أسلوب نعد للخلايا القشرية previously11 وصف. ويرد هنا، تعديل بروتوكول التي يمكن تخزين الخلايا القشرية في-80 درجة مئوية لمدة 3 أشهر على الأقل. ويبين الشكل 2المخطط الانسيابي لهذا البروتوكول.
1. إعداد دميم والمتوسطة تشريح والمالحة الاحتضان وتصفيح المتوسطة كما هو مبين في الخطوات 1.3.1–1.3.4، و جدول للمواد.
2. إعداد المتوسطة الغسيل يشكل دميم وإبطال الحرارة الجنين المصل البقري والبنسلين والستربتوميسين (انظر الجدول للمواد)، إذا لزم الأمر.
3. استخراج الأجنة E18 – 19 من الرحم الفئران الإناث تخديره أو الماوس، استخدام مقص التشريح الدقيق، واستخدام الملقط الدائري لوضع كل الأجنة المستخرجة في دميم المثلج للتخدير البارد.
4. إزالة الأدمغة الأجنة والاحتفاظ بها في تشريح المثلج المتوسطة. إزالة كورتيكسيس والحفاظ عليها في المياه المالحة حضانة توضع في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد.
5. أغسل كورتيكسيس مع المالحة الاحتضان واحتضان كورتيكسيس مع التربسين (1.25 ملغ/مل) والدناز أنا (0.25 مغ/مل) في المحلول الملحي الحضانة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. حجم حاضنات الموصى بها كورتيكسيس 12 مل 5.4 المالحة حضانة و 300 ميليلتر من 20 x التربسين الأسهم 300 ميليلتر من 20 x الأسهم الدناز أنا.
6. أغسل كورتيكسيس 3 x مع المالحة المثلج الحضانة.
7. إزالة المادة طافية وإضافة 2 مل متوسطة الطلاء تستكمل مع 150 ميليلتر من الدناز أنا الأسهم. فصل الخلايا من بيبيتينج أقل من 20 السكتات الدماغية، وتصفية الخلايا باستخدام مصفاة خلية مع حجم مسام 70 ميكرون.
8. أغسل مصفاة الخلية مع 20 مل الوسط والطلاء لطلاء. لإعداد مخزون الخلايا المجمدة، تغسل الخلايا مع 20 مل المتوسطة يغسل (انظر الجدول للمواد)
9. قياس كثافة الخلايا قابلة للتطبيق، باستخدام عداد خلية واﻷسلوب تريبان الأزرق.
10. تمييع الخلايا القشرية لكثافة 1.4 × 10⁵ قابلة للحياة خلايا/مل مع المتوسطة والطلاء وإضافة 1 مل تعليق خلية المخفف كوفيرسليبس المغلفة بجزيرة الأمير إدوارد في لوحات الثقافة 12-جيدا.
11. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة₂ CO لمدة 2 – 3 أيام وتغيير الثقافة المتوسطة إلى المتوسطة الصيانة.
12. بعد خطوة 1.4.9، إعداد مخزون الخلية القشرية المجمدة من سينتريفوجينج الخلايا في 187 س ز 3 دقيقة، باستخدام دوار سوينغ.
13. نضح المادة طافية وإضافة المتوسطة للواسمات (انظر الجدول للمواد) أبقى في 4 درجات مئوية، للحصول على كثافة خلية 1 × 10⁷ خلايا/مل. 1 مل الكوة من تعليق خلية في أنابيب التبريد.
14. وضع الأنابيب في خلية تجميد حاوية بمعدل تجميد-1 درجة مئوية/دقيقة، حتى يتم التوصل إلى درجة حرارة-80 درجة مئوية، ونقل الحاوية التجميد في ثلاجة-80 درجة مئوية. ويمكن تخزين الخلايا لمدة 3 أشهر على الأقل في-80 درجة مئوية.
15. لإحياء خلايا مجمدة، بريوارم بغسل المتوسطة (حوالي 13 مل لكل أنبوبة المبردة) والصيانة المتوسطة للخلايا القشرية المجمدة (انظر الجدول للمواد).
16. ذوبان الجليد الخلايا المجمدة سريعاً في 37 درجة مئوية في حمام مائي.
17. تمييع الخلايا المذابة بلطف مع المتوسطة بريوارميد المياه والصرف الصحي. الطرد المركزي الخلايا في 187 س ز 3 دقيقة، باستخدام دوار سوينغ.
18. تعليق بيليه في 1 مل من غسل المتوسطة وقياس كثافة خلايا قابلة للحياة.
19. تمييع الخلايا مع الصيانة المتوسطة للخلايا القشرية المجمدة تسفر عن كثافة خلية 3.0 x 10⁵ خلايا/مل قابلة للاستمرار، والبذور 1 مل تعليق خلية في لوحات 12-جيدا المغلفة بجزيرة الأمير إدوارد.

2-التعبير عن جيسيس المستهدفة للغشاء

تعداء الخلايا
1. إضافة 250 نانوغرام بلازميد جيتشي (أي، GCaMP6f لك أو لك-RCaMP2 OER-GCaMP6f مع المروج CMV)^7,8,9 إلى 100 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط (انظر الجدول للمواد) كل بئر. كوترانسفيكشن لك RCaMP2 و OER-GCaMP6f، استخدام 250 نانوغرام لكل بلازميد في 100 ميليلتر من المصل انخفاض متوسط في كل بئر.
2. إضافة 0.5 ميليلتر من تعداء كاشف (انظر الجدول للمواد) الواحدة وكذلك في المخلوط المتوسط خفض بلازميد المصل. بالنسبة كوترانسفيكتيون لك RCaMP2 و OER GCaMP6f، إضافة 0.5 ميليلتر من تعداء كاشف كل بئر.
3. احتضان هذا الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-28 درجة مئوية).
4. إضافة 100 ميليلتر من الخليط لكل ساترة بطريقة دروبويسي.
5. احتضان الخلايا ح 48 – 72 في حاضنة₂ CO في 37 درجة مئوية للسماح بالتعبير عن جيسيس.
تعداء والإصابة بعدوى الفيروس المرتبط بالغدد الخلايا العصبية هيبوكامبال أو القشرية
ملاحظة: تعداء لمدة 3 – 5 أيام في المختبر (DIV) يؤدي ارتفاع معدل تعداء الخلايا العصبية. تعداء في الدرجة 6 – 8 المفضل للتعبير الأمثل عن جيسيس في أستروسيتيس. للتعبير عن جيسيس في الثقافة منفصلان الخلايا العصبية بعد 9 DIV، يوفر عدوى نواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) كفاءة أفضل تعبير. استخدام HEK293 الخلايا الناقلة إف للتعبير عن GCaMP6f لك ولك-RCaMP2 OER-GCaMP6f تحت EF1a المروجين أعدت كما هو موضح سابقا،¹² (انظر الجدول للمواد).
1. تعداء 3 – 8 أيام بعد الطلاء، تسمية اثنين أنابيب، واحدة للحمض النووي بلازميد والآخر لكاشف تعداء.
2. إضافة 50 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط (انظر الجدول للمواد) كل بئر لكل أنبوبة.
3. إضافة 0.5 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي كل ساترة وميليلتر 1 الملحق مصحوبا بكاشف تعداء للخلايا العصبية (انظر الجدول للمواد) الواحدة وكذلك إلى الأنبوب بلازميد الحمض النووي. كوترانسفيكشن لك RCaMP2 و OER-GCaMP6f، تختلط 0.5 ميكروغرام لكل بلازميد وميليلتر 1 من الملحق في 50 ميليلتر من المصل انخفاض متوسط كل بئر.
4. أضف 1 ميليلتر من تعداء كاشف (انظر الجدول للمواد) كل بئر في الأنبوب كاشف تعداء. يتم استخدام نفس الكمية من تعداء كاشف كوترانسفيكتيون.
5. دوامة كل أنابيب ل s 1 – 2.
6. إضافة خليط كاشف تعداء (من الخطوة 2.2.4) إلى خليط الحمض النووي (من الخطوة 2.2.3). مزيج من بيبيتينج برفق واحتضان الخليط (100 ميليلتر كل ساترة) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. تحميل هذا الخليط على الخلايا بطريقة دروبويسي.
8. احتضان الخلايا في حاضنة₂ CO 2-3 أيام حتى يتم التعبير عن البروتينات ماركر.
9. لعدوى إف، إضافة 3 ميليلتر من إف كل بئر لثقافة astrocyte العصبية مختلطة. المزيج بلطف هزاز الطبق. للعدوى المزدوجة لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f، هو عرض 3 ميليلتر من كل إف كل بئر. في حالة إعداد الخلايا معربا عن جيسيس غير كافية، ينبغي أن تحدد مقدار إف الأمثل للعدوى.
10. الحفاظ على الثقافة لمدة 1 – 2 أسابيع حتى يتم التعبير عنها جيسيس.

3-Ca^{2 +} تصوير

التصوير المتزامن للخلايا معربا عن RCaMP2 لك و OER-GCaMP6f
ملاحظة: إلى السجل في نفس الوقت إشارات لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f، تقسيم الصورة البصريات مطلوبة. البصريات تمكين الفصل بين RCaMP2 و GCaMP6f وعلى الإسقاط على نفس الإطار الصور الفوتوغرافية من الكاميرا (الشكل 3A). التصوير متزامنة أيضا يتطلب مصادر (1) الخفيفة التي يمكن أن تنبعث في نفس الوقت الإثارة الخفيفة باللون الأزرق (450-490 نانومتر) ويعين أطياف الأخضر (500 – 560 نانومتر)، وتصفية (2) مزدوجة النطاق مرآة مزدوج اللون في المجهر، والانبعاثات (3) مرشحات ل RCaMP2 و GCaMP6f. لمزيد من التفاصيل، أرجع إلى الجدول للمواد.
1. قم بتشغيل أجهزة التصوير وأجهزة الكمبيوتر على الأقل 30 دقيقة قبل التسجيل. بريوارم المجهر تدفئة الغرفة إلى 37 درجة مئوية. قم بإعداد الجهاز تقسيم الصورة، عوامل التصفية، ومصدر الضوء. قم بمحاذاة البصريات تقسيم الصورة بحيث يظهر نفس الحقل للعرض على الكاميرا. اختر عدسة الهدف المناسب (انظر الجدول للمواد).
2. جبل ساترة تحتوي على الخلايا transfected مع RCaMP2 لك و OER-GCaMP6f في دائرة التسجيل، أضف المتوسطة التصوير المناسبة أو المخزن المؤقت (400 ميليلتر كوفيرسليبس 18 ملم) في الدائرة، ووضعه على المسرح المجهر. ضع غطاء على غرفة تسجيل لتجنب تبخر المتوسط.
3. تحديد موقع الخلايا معربا عن RCaMP2 لك و OER-GCaMP6f بالتصوير الفلورسنت. التقليل من حدة الإثارة الخفيفة لمنع فوتوبليتشينج والضيائيه.
4. إزالة الغطاء وبدء تسجيل الوقت الفاصل بين الساعة 10 هرتز. خلال هذا التسجيل، إضافة مؤثر إلى الدائرة لاستحضار Ca^{2 +} ردود (مثلاً، الهيستامين لخلايا هيلا، ATP للخلايا كوس-7).
5. حفظ بيانات الوقت الفاصل في محرك الأقراص الثابتة (HDD).
6. تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل الصور.
تسجيل أنشطة تلقائية astrocytes الإعراب عن RCaMP2 لك و OER-GCaMP6f
ملاحظة: دون تقسيم الصورة البصريات، يمكن رصد Ca^{2 +} الإشارات في غشاء البلازما والمحيطين لائحة في نفس الخلية. ويرد هنا، تسجيل متسلسل لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في أستروسيتيس نفس. هدف نفط-غمر مع فتحه عددية أكبر من 1.3 ينصح بشدة لعفوية Ca^{2 +} النشاط.
1. قم بتشغيل المجهر، الكاميرا، ومصدر الضوء، والتدفئة مجهر الدائرة على الأقل 30 دقيقة قبل أن يسجل.
2. جبل ساترة تحتوي على خلايا transfected مع RCaMP2 لك و OER-GCaMP6f في قاعة تسجيل وإضافة 400 ميليلتر للتصوير المتوسط. ضع غطاء على رأس الدائرة.
3. اختر عامل التصفية بتعيين GCaMP6f ومصدر الضوء (الضوء الإثارة، مثل 470– 490 الأزرق نانومتر؛ انظر الجدول للمواد). حدد موقع أستروسيتيس الإعراب عن OER-GCaMP6f.
4. اختر مجموعة تصفية ومصدر الضوء ل RCaMP2 (أخضر الإثارة الخفيفة، مثلاً، 510 – 560 نانومتر؛ انظر الجدول للمواد) وتأكيد ما إذا كان يتم التعبير عن RCaMP2 لك في astrocytes نفس. تجنب التعرض الطويل لمصدر الضوء لمنع فوتوبليتشينج.
5. حفظ سجل الوقت الفاصل بين صور لك-RCaMP2 في 2 هرتز للحد الأدنى 2 بيانات التصوير على القرص الصلب.
6. قم بتغيير عامل التصفية المحددة لذلك ل GCaMP6f. سجل الوقت الفاصل بين صور OER-GCaMP6f في مجال الرؤية نفسها، في 2 هرتز لمدة دقيقة 2 حفظ البيانات على القرص الصلب.
7. تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل الصورة.
تسجيل نشاط الخلايا العصبية عفوية والمستحثه Ca^{2 +} ارتفاع في الخلايا العصبية
ملاحظة: مجهر الإعداد لتصوير الخلايا العصبية هو نفسه الذي هو موضح في القسم 3.2. ويرد هنا، تصوير Ca^{2 +} الارتفاع الناجم عن تفعيل مجلور بسبب OER GCaMP6f وعفوية Ca^{2 +} الارتفاع بسبب GCaMP6f لك.
1. لتسجيل نشاط الخلايا العصبية عفوية، جبل ساترة تحتوي على خلايا معربا عن GCaMP6f لك في قاعة التسجيل وإضافة 400 ميليلتر للتصوير المتوسطة. ضع غطاء على رأس الدائرة.
2. تعيين عامل التصفية ومصدر الضوء (الأزرق الإثارة، مثلاً 470 – 790 نانومتر؛ انظر الجدول للمواد) إلى تلك المتعلقة GCaMP6f. البحث عن الخلايا العصبية معربا عن GCaMP6f لك وعرض النشاط العفوي.
3. الحصول على الصور في 2 هرتز أو أسرع. حفظ البيانات على القرص الصلب.
4. تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل الصورة.
5. لتسجيل Ca^{2 +} الارتفاع المستحث، جبل كوفيرسليبس تحتوي على خلايا معربا عن OER-GCaMP6f مع 400 ميليلتر التصوير المتوسطة. ضع غطاء على رأس الدائرة.
6. استخدام عامل تصفية مجموعة ل GCaMP6f، العثور على الخلايا العصبية في التعبير عن OER-GCaMP6f.
7. قم بإزالة الغطاء. بدء تسجيل الوقت الفاصل بين الساعة 2 هرتز أو أسرع. أثناء التسجيل، أضف يضع لمستقبل إلى جانب البروتين Gq (مثلاً، mGluR5 مؤثر [RS]--3، 5-ديهيدروكسيفينيلجليسيني [دهبج]) لاستحضار Ca^{2 +} إطلاق سراح لائحة.
8. حفظ الوقت الفاصل بين الصور على القرص الصلب، وتحليل البيانات.

النتائج

وأبديت لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في خلايا هيلا، وسجلت كل الإشارات في وقت واحد باستخدام تقسيم الصورة البصريات، 24 ساعة بعد تعداء (الشكل 3 ألف و 1 فيديو). الصور تم الحصول عليها في 10 هرتز-الهيستامين (له 1 ميكرومتر)، الذي يستحث Ca^{2 +} الإصدار لائحة، أضيفت أثناء التسجيل. عند تطبيق له، زيادة كثافة إشارة لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f، كما يتضح من عرض بسيودوكولور ΔF/F0، الذي يمثل التغيير من شدة الأسفار الأولى (الشكل 3B). وقورنت الدورات وقت Ca^{2 +} الارتفاع (ΔF/F0) ذكرت لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في المنطقة نفسها من الاهتمام (ROI) (الشكل 3). تم تطبيع القيم ΔF/F0 إلى قيمها الذروة لتمكين المقارنة بالطبع الوقت بين جيسيس مختلفة اثنين، التي لديها مستويات مختلفة من التعبير والتوزيعات. وأفادت كل من أجهزة الاستشعار التذبذب مثل Ca^{2 +} ارتفاع. فحص لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f أظهرت نفس مسار الوقت Ca^{2 +} ارتفاع في خلايا اثنين من بين أنواع الخلايا الخمس (الشكل 3، ROI 1 و 3). بيد أن Ca^{2 +} المرتفعات تبديه لك-RCaMP2 ظلت في مستوى أعلى مقارنة بما تبديه OER-GCaMP6f (الشكل 3 جيم، دوروا 2 و 4 و 5). وتبين النتائج أن أمده Ca^{2 +} الارتفاع محيط غشاء البلازما، في حين أنه يتم إنهاؤها في وقت سابق حول لائحة، الذي هو مصدر هذا Ca^{2 +} إشارة الناجمين عن طريق تحفيز له.

Ca عفوية^{2 +} إشارات من أستروسيتيس في الخلايا العصبية-astrocyte مختلطة الثقافة من الفئران هيبوكامبي (الشكل 4A) وكورتيكسيس (الشكل 4) عرضت لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f (الشكل 4، فيديو 2، 3 فيديو ، و الفيديو 4و الفيديو 5). تم أحياء الثقافات القشرية من الأسهم المجمدة التي تم إعدادها كما هو مبين في هذا البروتوكول. وسجلت إشارات لك--RCaMP2 و OER GCaMP6f تسلسلياً في 2 هرتز من نفس الخلايا. واختيرت رويس ثلاثة في المنطقة التي أظهر Ca^{2 +} ارتفاع بكل جيتشي، وغيرت مجرى الزمن ΔF/و_قاعدة (أي، شدة الأسفار) من الأسفار متوسط الكثافة أثناء فترة تسجيل كامل (و_قاعدة). عندما fluorescence الأساس مستقر و Ca^{2 +} المرتفعات أقل تواترا، و_قاعدة يصبح أساس مفيدة للكشف عن أحداث Ca^{2 +} الارتفاع. عفوية Ca^{2 +} المرتفعات كانت مرئية فقط في عملية أستروسيتيك، وليس في نص الخلية. هذه النتيجة غير متسقة مع التقارير السابقة بشأن أستروسيتيك Ca^{2 +} إشارات عفوية جيسيس في المختبر تصور¹³ و المجراة في¹⁴أخرى. في astrocytes هيبوكامبال والقشرية على حد سواء، Ca^{2 +} المرتفعات تبديه لك-RCaMP2 (أعلى) كانت أكثر تواترا مما أبداه OER-GCaMP6f. هذه النتيجة تتسق مع المظاهرة السابقة لدينا أن Ca^{2 +} المرتفعات في أستروسيتيس بسبب GCaMP6f لك تم الكشف عن أكثر من تلك التي تعزى إلى OER-GCaMP6f⁷ ويوحي بأن هذا المفهوم ينطبق أيضا على مستوى خلية واحدة.

شوهدت عفوية Ca^{2 +} المرتفعات التي GCaMP6f لك في الفئران غير ناضجة هيبوكامبال الخلايا العصبية (الدرجة 10) في 2 هرتز (الشكل 5 ألف و 6 فيديو). دورات الزمن ΔF/F0 في خمسة رويس مختلفة تشير إلى أن هذه Ca^{2 +} المرتفعات تنحصر محلياً في المجالات سوبسيلولار. الشكل 5B ويبين (7 فيديو) Ca^{2 +} الردود في الخلايا العصبية هيبوكامبال الماوس ناضجة (30 DIV) مصاب بناقلات إف OER-GCaMP6f-التعبير. وقد حفز الخلايا العصبية مع 100 ميكرومتر دهبج، وهو مؤثر على مستقبلات الغلوتامات ميتابوتروبيك، الذي يحفز Ca^{2 +} الإصدار. تم الكشف عن دهبج الناجمة عن Ca^{2 +} الإصدار سبب OER-GCaMP6f.

figure-results-1
رقم 1: رسم تخطيطي يوضح جيسيس المستهدفة للغشاء. الرسم التخطيطي جيسيس المستهدفة لغشاء البلازما (GCaMP6f لك ولك-RCaMP2) والخارجي ER غشاء المستهدفة GCaMP6f (OER-GCaMP6f).

figure-results-2
رقم 2: مخطط انسيابي لإعداد الخلية هيبوكامبال والقشرية وتعداء بلازميد العدوى إف. الصور المجهرية الممثل، طازجة مطلي DIV-6 القشرية الخلايا (يسار) وإحياء الخلايا من الأوراق المالية المجمدة (يمين). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-3
الشكل 3: مثال على تصوير المتزامنة لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في خلايا هيلا. (أ) التمثيل التخطيطي لفصل الإشارات مع البصريات تقسيم الصورة. ومن المتوقع في نفس الوقت نفس الحقل من عرض لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f على الكاميرا. تسجيل ممثل المكتسبة في 10 هرتز بكاميرا CMOS يتم توفيرها في الفيديو 1، ويظهر إطار واحد لهذا التسجيل في الفريق A (يمين). (ب) الصور الملونة الزائفة من ΔF/F0 لك-GCaMP2 (أعلى) و OER-GCaMP6f (أسفل). الهيستامين (له, 1 ميكرومتر) أضيف في الممثل (ج) س. 0 مسار تطبيع ΔF/F0 الوقت لك-GCaMP2 (أرجواني) و OER-GCaMP6f (أخضر). تم تطبيع البيانات إلى الحد الأقصى للقيمة ΔF/F0 لكل قطعة. وتشير الأشرطة الرمادية إلى توقيت طلبه. تم تحليل البيانات مع برامج مصنوعة خصيصا منضدة تي¹⁵. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (صورة مجهرية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-4
الشكل 4: عفوية Ca^{2 +} الارتفاع في أستروسيتيس رصد للتعبير لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f- (أ) ممثل هيبوكامبال و astrocytes القشرية (ب) transfected مع لك-RCaMP2 (أعلى) و OER-GCaMP6f (أسفل). تم أحياء الخلايا القشرية من الثقافات الأرصدة المجمدة. RCaMP2 لك والصور OER GCaMP6f اقتنى تسلسلياً في نفس الخلية، في 2 هرتز، مع كاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر. المؤامرات على إظهار الأيسر دورات الزمن ΔF/فباسي تقاس رويس المشار إليه في الصورة المجهرية. تم تحليل البيانات مع منضدة منظمة الشفافية الدولية. وترد في فيديو 2، فيديو 3، فيديو 4، و 5 فيديوأفلام الفعلية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (صورة مجهرية). وتقترح الانجراف الأساس التغيرات في Ca^{2 +} المستوى العالمي في الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-5
الشكل 5: أمثلة من Ca^{2 +} تصوير في الخلايا العصبية مع GCaMP6f لك و OER-GCaMP6f- (أ) الممثل الفئران العصبية هيبوكامبال معربا عن GCaMP6f لك في 10 DIV (يسار) وقطع عرض الوقت دورات ΔF/F0 تقاس في رويس (الدوائر الصفراء) قد ذكرت في الصورة (على اليمين). الأرقام في مجرى الوقت تناظر الأرقام عائدات الاستثمار في الصورة. ملاحظة أن النمط الزمني Ca^{2 +} الارتفاع يختلف بين مناطق مختلفة من الاهتمام. وتقترح الانجراف الأساس الزيادة في Ca^{2 +} المستوى العالمي في هذه الخلايا العصبية. (ب) مثال على الماوس ناضجة هيبوكامبال الخلايا العصبية (DIV 30) مصاب بالتعبير OER-GCaMP6f إف ناقلات (يسار). الوقت يظهر المؤامرة بالطبع من ΔF/F0 يقاس Ca^{2 +} الاستجابة إلى 100 ميكرومتر (RS)--3، 5-ديهيدروكسيفينيلجليسيني (دهبج) المطبقة في توقيت تظهر بشريط رمادي. الدوائر الصفراء تظهر موقف رويس حيث تم الحصول على مسار الزمن. حصلت على 2 هرتز مع كاميرا CCD تبريد (لوحة أ) أو كاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر (فريق ب) الصور وتحليلها مع منضدة منظمة الشفافية الدولية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (صورة مجهرية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-6
الفيديو 1: مثال لتصوير المتزامنة لك-RCaMP2 و OER-GCaMP6f في خلايا هيلا. تسجيل الممثل المكتسبة في 10 هرتز، وعرضت في الشكل 3. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

figure-results-7
فيديو 2: عفوية Ca^{2 +} عابرة لوحظت في RCaMP2 لك astrocyte هيبوكامبال- تسجيل الممثل المكتسبة في 2 هرتز (الشكل 4A)، سجلت في نفس الحقل للعرض فيديو 3. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

figure-results-8
الفيديو 3: عفوية Ca^{2 +} عابرة لوحظت في OER GCaMP6f astrocyte هيبوكامبال. تسجيل الممثل المكتسبة في 2 هرتز (الشكل 4 أ)، في نفس الحقل للعرض الفيديو 2. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

figure-results-9
الفيديو 4: عفوية Ca^{2 +} عابرة لوحظ في RCaMP2 لك في أستروسيتي القشرية تسجيل الممثل المكتسبة في 2 هرتز (الشكل 4 باء)، سجلت في نفس الحقل من عرض الفيديو5. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

figure-results-10
الفيديو 5: عفوية Ca^{2 +} عابرة لوحظت في OER-GCaMP6f أستروسيتي القشرية. تسجيل الممثل المكتسبة في 2 هرتز (الشكل 4 باء)، في نفس الحقل من عرض الفيديو4. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

figure-results-11
فيديو 6: مثال Ca^{2 +} التصوير في الفئران هيبوكامبال خلية (الدرجة 10) التي GCaMP6f لك. مثال لكاليفورنيا العصبية^{2 +} إشارات سجلت في 2 هرتز (الشكل 5A). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

figure-results-12
فيديو 7: Ca^{2 +} الإصدار في العصبية هيبوكامبال ماوس (DIV 30) معربا عن OER-GCaMP6f- المثال العصبية Ca^{2 +} الإشارات المسجلة في خلية هيبوكامبال ماوس المصابين OER-GCaMP6f التعبير إف ناقلات (الشكل 5 (ب)). العصبية وحفز مع 100 ميكرومتر ديهيدروكسيفينيلجليسيني (دهبج) يطبق في 30 ثانية لاستحضار Ca^{2 +} الإصدار لائحة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

المناقشة

النواتج بيولوجية متنوعة تبدأ بإشارات Ca^{2 +} . Ca^{2 +} رسول تنوعاً مما يشير إلى داخل الخلايا. تم فك التشفير Ca^{2 +} إشارات نواتج محددة تثير سؤالاً بيولوجية أساسية، ومطلوبة من Ca^{2 +} تقنيات التصوير لوصف تنوع Ca^{2 +} إشارات. البروتوكول مفصلاً حاليا يتيح الكشف عن Ca^{2 +}إشارات مميزة في غشاء البلازما و ER (رقم 3 و رقم 4) والمحلية Ca^{2 +} ميكرودومينس داخل خلية (الشكل 4 و الشكل 5). وهذا يسهم في وصف تنوع Ca^{2 +} الإشارات داخل الخلايا. يشير القرار الزماني من Ca^{2 +} تحسنت أيضا باستهداف جيسيس في غشاء البلازما و ER نظراً لأنه يمكن تجنب تأثير انتشار ثلاثي الأبعاد من Ca^{2 +} وجيسيس أنفسهم، وأن من الممكن للكشف عن اللحظة بالذات من Ca^{2 +} تدفق أو Ca^{2 +} الإصدار، الذي يحدث في الغشاء.

البروتوكول على بعض القيود. المستخدمين يجب أن نضع في اعتبارنا أن الإشارات التي تم الكشف عنها هي مجموع "في الوقت الراهن من Ca^{2 +} تدفق أو الإفراج عنه" و "Ca^{2 +} موزع خارجاً من Ca^{2 +} المصدر الأصلي"، خاصة بالنسبة لكاليفورنيا^{2 +} إشارات كبيرة. على سبيل المثال، على الرغم من أن يستحضر له التحفيز في خلايا هيلا Ca^{2 +} الإفراج عن لائحة، Ca الناتجة عن اكتشاف^{2 +} إشارات ليس فقط باستهداف ER OER-GCaMP6f ولكن أيضا بغشاء البلازما-تستهدف لك-RCaMP2 (الشكل 3). قيد آخر أن نمط الزمانية المكانية من Ca^{2 +} إشارات قد لا تكون العامل المحدد الوحيد لإخراج Ca^{2 +} إشارات. توزيع البروتينات المستجيب المتلقين للمعلومات (مثل Ca^{2 +}-تعتمد مؤنزم و phosphatases) قد يكون أيضا تحديد عامل². تماما فك Ca^{2 +} الإشارات داخل الخلايا، تحليل سلوك إنزيم المصب، التي لم يتم تغطيتها في هذا البروتوكول، ضروري على الإطلاق.

أحد الجوانب الأكثر أهمية لنجاح Ca^{2 +} تصوير هو اقتناء الإعداد والصورة تصوير الأوضاع، وكذلك فيما يتعلق بدراسات أخرى تعيش-التصوير. أظهرنا سابقا أن Ca^{2 +} الردود في الخلية تعتمد اعتماداً كبيرا على مدة وشدة الإثارة وعلى شروط اكتساب صورة، بما في ذلك التعرض الوقت واكتساب التردد¹⁶. قوة الإضاءة الإثارة هو العامل الأهم، كما أنها يمكن أن تسبب السمية الخفيفة وفوتوبليتشينج من جيسيس. ينبغي أن يكون الأمثل شروط تسجيل وقت التعرض، تسجيل تواتر وكثافة الضوء الإثارة ومدة التسجيل وفقا للغرض من هذه التجربة. نحن نوصي بتقليل زمن التعرض وشدة الضوء الإثارة قدر الإمكان لتجنب فوتوبليتشينج والضيائيه للخلية. تكرار التسجيل ومدة التسجيل ينبغي أن يكون كافياً تغطية أحداث Ca^{2 +} ارتفاع الاهتمام ولكن ينبغي أن تظل منخفضة قدر الإمكان لتجنب فوتوبليتشينج والضيائيه أيضا. نوصي بتحديد المدة وتواتر تسجيل أولاً والاستفادة المثلى من شدة الضوء وزمن التعرض حيث أن فوتوبليتشينج من جيسيس مصغراً. هناك عامل هام آخر هو مستوى جيسيس التعبير. لقد جيسيس Ca^{2 +}-التخزين المؤقت التأثير كما هي Ca^{2 +}-ملزم البروتينات. ولذلك، يؤدي overexpression جيسيس التخزين المؤقت من Ca^{2 +}، الذي من الناحية الفسيولوجية اللازمة للخلايا. وينبغي تقليل مقدار التعبير جيتشي لتجنب تصوير الخلايا معربا عن كميات عالية من جيسيس.

وفي الختام، تشريح Ca^{2 +} الإشارات بدقة سوبسيلولار هي واحدة من أهم الخطوات لفك التشفير Ca^{2 +} الإشارات داخل الخلايا التي تحدد ظاهرة الإنتاج البيولوجي. هذا البروتوكول يوفر طريقة جديدة لتشريح Ca^{2 +} إشارات لوصف التنوع فيما بين هذه الإشارات. في الوقت الحاضر، هذا الأسلوب محدود للتجارب في المختبر. بيد أن يتم بالفعل استخدام GCaMP6f لك لالمجراه في Ca^{2 +} التصوير في الفئران¹⁷وأكدت OER-GCaMP6f لرصد Ca^{2 +} إشارات في المجراة في الخلايا العصبية الحركية مرض جنسي في ايليجانس جيم-7. ولذلك، تستهدف جيسيس في حجرة سوبسيلولار لديه القدرة على توسيع المجراة في التصوير في المستقبل، وبالتالي تمكين Ca^{2 +} تشريح المجراة.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

يتم دعم هذا العمل بالمنح التالية: "اليابانية للعلوم" والتكنولوجيا وكالة (JST) بريكورسوري للبحوث "الجنينية العلوم" والتكنولوجيا (المعزوفة) (JPMJPR15F8، اليابان)؛ الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS)/منح مساعدات للبحث العلمي (كاكينهي) (JP18H05414، JP17H05710، JP16K07316)، مؤسسة تأكيدا. يشكر المؤلفون هاروهيكو بيتو (جامعة طوكيو) لتوفير RCaMP2 وآرثر ج. ي هوانغ وتوماس ماك هيو (CBS بتبريد) لتوفير ناقلات إف وتعليمات بشأن إعداد إف. الكتاب أيضا يود أن يشكر المحررين في "مجلة تجارب تصور" لمساعدتهم بتصوير الفيديو وتحريرها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
(RS) -3،5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)	Tocris	# 0342
0.5٪ DNase I محلول مخزون	Sigma-Aldrich	# 11284932001	تحضير 0.5٪ DNase I (w / v) في محلول الملح المتوازن من Hanks ؛ مكمل ب 120 ملي مولار MgSO_{4< / sub>. تحضير 160 & ميكرو ؛ L aliquots وتخزينها في -30 درجة مئوية.}
0.5٪ محلول التربسين-EDTA	ثيرمو فيشر العلمي	# 25300054
100 ملي مولار L-glutamine (& مرات ؛ 100 مخزون)	ثيرمو فيشر العلمي	# 25030081	تحضير كميات صغيرة من 250-750 & L وتخزينها في -30 درجة مئوية.
100 ملي مولار بيروفات الصوديوم (& مرات ؛ 100 مخزون)	يمكن تخزين Thermo Fisher Scientific	# 11360070	Aliquots (10 مل) عند -20 درجة مئوية. بعد الذوبان ، يمكن الحفاظ على المحلول عند 4 درجات ؛ ج لمدة 2 أشهر.
12-Well ألواح استزراع متعددة الآبار بغطاء منخفض التبخر	Falcon	# 353043	الغطاء منخفض التبخر أمرا بالغ الأهمية لزراعة الثقافة المختلطة للخلايا العصبية الدبقية. بالنسبة لخلايا خط الخلية ، يمكن استخدام أطباق الثقافة البديلة.
أغطية دائرية قطرها 18 مم Karl	Hecht "Assistent"	# 41001118	سمك 1 ، أغطية دائرية قطرها 18 مم ؛ يمكن استخدام أغطية بديلة.
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	# 15630080	درجة الحموضة 7.2-7.6
2.5٪ محلول مخزون التربسين (& مرات ؛ 20 مخزون)	سيجما ألدريتش	#T4674	تحضير 150 & مايكرو ؛ L aliquot وتخزينها في -30 درجة مئوية.
50٪ بولي (إيثيلينيمين) (PEI) الحل	Sigma-Aldrich	#P3143	قم بإعداد محلول مخزون PEI بنسبة 2٪ (V / V) (& مرات ؛ 50) بالماء المقطر المعقم بالترشيح. تخزين محلول المخزون عند -30 درجة ؛ C بعد تحضير كميات صغيرة من 250-750 ميكرو لتر. قم بإعداد محلول 0.04٪ PEI بالماء المقطر في يوم طلاء الغطاء.
70٪ إيثانول			محفوظ في زجاجة رذاذ لاستخدامها في تطهير السطح.
يمكن تحضير الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) لتعبير Lck-GCaMP6f و Lck-RCaMP2 و OER-RCaMP2 تحت إشراف محفز			AAV باستخدام نظام AAV Helper Free System (Agilent Technologies) وخلايا HEK293 ، أو طرق بديلة. تتوفر pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f و pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 و pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f عند الطلب.
ملحق B-27 (& مرات ؛ 50 مخزون)	Thermo Fisher Scientific	# 17504044	يمكن استبدال هذا بمكمل B-27 plus (Thermo Fisher Scientific ؛ #A3582801) أو MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec ، Bergisch Gladbach ، ألمانيا ؛ # 130-093-566).
B57BL / 6	اليابان SLC، Inc.
كاميرا لتسجيل			كانت الكاميرات التالية متاحة للاستخدام: كاميرا CCD المبردة (على سبيل المثال ، Hamamatsu Photonics ، OECA-ER) ، EM-CCD CAMERA (على سبيل المثال ، Hamamatsu Photonics ، & nbsp ؛ إيماجيم. Andor, iXon) أو كاميرا CMOS (على سبيل المثال ، Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
حاوية تجميد الخلايا	Sarstedt KK.	# 95.64.253	يمكن استخدام حاوية تجميد الخلايا البديلة.
مصفاة الخلية	Falcon	# 352350
CO_{2< / sub> حاضنة}			الحفاظ على 37 درجة ؛ C ، 5٪ CO_{2< / sub>.}
يمكن استخدام الأنبوب المبرد	Corning	# 430661	الأنابيب المبردة البديلة.
وسط الحفظ بالتبريد	Zenoaq		"CELLBANKER1"
وسط الاستزراع (لخلايا HeLa)			وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مكمل بمصل بقري جنيني معطل للحرارة بنسبة 10٪ ، ومحلول البنسلين والستربتومايسين (التركيز النهائي: البنسلين 100 وحدة / مل والستربتومايسين 100 & micro ؛ جم / مل)
وسيط التشريح ؛			مليلتر واحد من 1 M HEPES (التركيز النهائي 20 مل) إلى 49 مل DMEM
يمكن استخدام DMEM	Nacalai	# 08456-65	DMEM البديل.
DMEM	Nacalai	# 08456-65
كاشف تعداء الحمض النووي	Sigma-Aldrich	# 6366244001	"X-tremegene HP DNA transfection reagent" يمكن استخدام كواشف التعداء البديلة.
جرة زجاجية بغطاء			جرة 500 مل (للماوس) أو جرة 1,500 مل (للفئران) لتخدير ؛
HBSS	Thermo Fisher Scientific	# 14170161	HBSS خالي من الكالسيوم والمغنيسيوم
مصل الأبقار المعطل	بالحرارة Thermo Fisher Scientific	# 10100147
خلايا HeLa	RIKEN BioResource	Center #RCB0007
Histamine	Sigma-Aldrich	#H7125
برنامج			تحليل الصورمثل Metamorph (الأجهزة الجزيئية) و ImageJ (NIH) و TI Workbench14 (حسب الطلب) ؛
بصريات تقسيم الصور	Hamamatsu	Photonics#A12801-01	W-view الجوزاء
صورة تقسيم البصريات مرآة ثنائية اللون	Semrock	#FF560-FDi01-25 & 36	لفصل بروتين الفلورسنت الأخضر / بروتين الفلورسنت الأحمر ؛ (GFP / RFP) إشارة
انقسام البصريات تصفية انبعاث	الصور Semrock	#FF01-512 / 25-25 ، #FF01-630 / 92-25	لإصدار إشارة GFP / RFP ، على التوالي
وسيط التصوير والمخزن المؤقت			استخدم الوسيط الأمثل أو المخزن المؤقت للتجربة. عند استخدام الوسيط ، من المستحسن أن يكون الوسط بدون الفينول الأحمر لتقليل مضان الخلفية. أضف 20 ملي مولار HEPES للحفاظ على درجة الحموضة خارج حاضنة CO_{2< / sub>.}
حضانة الملحية			أضف 1 مل من 1 M HEPES (20 مل) إلى 49 مل HBSS
		الفلوري المقلوب	مثل IX73 (أوليمبوس) أو ؛ Eclipse TI (نيكون Instech)
Isoflurane	Pfizer		يستخدم للتخدير
وسط الصيانة (لمدة 4 مرات ؛ 12 طبقا جيدا)			48.5 مل Neurobasal-A متوسط مكمل ب 1 مل B-27 ، 500 & micro ؛ L من مخزون L-glutamine و 25 & micro ؛ L محلول البنسلين الستربتومايسين.
وسط صيانة للخلايا القشرية المجمدة (1 & 12 طبق بئر)			12.2 مل Neurobasal plus medium مكمل ب 250 & micro; L B-27 ، 125 & micro ؛ L من مخزون L-glutamine و 6.2 & micro ؛ L محلول البنسلين الستربتومايسين.
MEM (الحد الأدنى من الوسط الأساسي)	Thermo Fisher Scientific	# 11090-081
لتصوير			مرشح مناسب ل GFP (الإثارة ، 480 & plusmn ؛ 10 نانومتر ؛ انبعاث ، 530 & plusmn ؛ 20 نانومتر)
مجموعة مرشح المجهر لتصوير			مرشح مناسب لطلب تقديم العروض (الإثارة ، 535 & plusmn ؛ 50 نانومتر ؛ انبعاث ، تمرير 590 نانومتر)
مجموعات مرشح المجهر للتصوير المزدوج ل RCaMP2 و GCaMP6f	Semrock	#FF01-468 / 553-25 ، #FF493 / 574-FDi01-25 & times ؛ 36 ، #FF01-512 / 630-25	مرشح إثارة مزدوج ، مرآة مزدوجة اللون ، ومرشح انبعاث لتصوير GFP / RFP.
		تسخين المجهر	نظام تسخين للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة ؛ ج أثناء التصوير. لتجنب الانجراف الناجم عن التمدد الحراري ، يوصى باستخدام أنظمة التدفئة التي تغطي المجهر نفسه بالكامل (على سبيل المثال ، Tokai Hit و Thermobox).
مصدر ضوء المجهر للإثارة			مصباح الزئبق (100 واط) ، مصباح زينون (75 واط) ، نظام إضاءة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) (على سبيل المثال ، CoolLED Ltd. ، precisExcite ؛ شركة Thorlabs Inc. ، مصدر LED ذو 4 أطوال موجية ؛ Lumencor ، محرك خفيف SPECTRA X). في حالة وجود كتلة زئبقية ومصباح زينون ، استخدم مرشح الكثافة المحايدة لتقليل شدة الإثارة.
باستخدام هدف غمر الزيت بالمخطط			Apochromat مع فتحة عددية أعلى من 1.3 لتسجيل نشاط Ca^{2 + < / sup> التلقائي في الخلايا العصبية والخلايا النجمية.}
استخدام Neurobasal plus medium	Thermo Fisher العلمي	#A3582901
Neurobasal-A متوسط	Thermo Fisher Scientific	# 10888022	Neurobasal plus medium (Thermo Fisher ، A3582901) بدلا من وسيط Neurobasal-A.
PBS (-): محلول ملحي مخزن بالفوسفات خال من Ca^{2 + < / sup> و Mg^{2 + < / sup> ؛}}	Fujifilm Wako Pure Chemical Collaboration	# 164-23551	يعد غياب Ca^{2 + < / sup> و Mg^{2 + < / sup> أمرا بالغ الأهمية لعدم تثبيط نشاط التربسين. يمكن استخدام بديل ل PBS (-).}}
برامج الحصول			والصور مثل Metamorph (الأجهزة الجزيئية) ؛ المدير الجزئي. TI Workbench < sup> 14 < / sup>.
محلول البنسلين والستربتومايسين	ثيرمو فيشر العلمي	# 15140122	البنسلين 10,000 وحدة / مل والستربتومايسين 10,000 ميكرو ؛ ز / مل
البلازميد لتعبير Lck-GCaMP6f و Lck-RCaMP2 و OER-RCaMP2 تحت محفز الفيروس المضخم للخلايا ^{7-9< / sup>}			متوفر عند الطلب
وسط الطلاء (ل 4 مرات ؛ 12 طبق بئر)			48 مل MEM مكمل بملحق 1 مل B-27 ، 500 & micro ؛ مخزون L-glutamine (التركيز النهائي: 2 ملم) ، 500 & ميكرو ؛ L من مخزون بيروفات الصوديوم (1 مل) و 25 & ميكرو ؛ L محلول البنسلين والستربتومايسين (البنسلين 5 وحدة / مل ، ستربتومايسين 5 وميكرو ؛ جم / مل). هذا التركيز من البنسلين الستربتومايسين ، وهو 1/20 من ؛ التركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة ، أمر بالغ الأهمية لبقاء الخلايا العصبية.
غرفة التسجيل	Elveflow	Ludin Chamber	غرفة التسجيل هذه مخصصة لأغطية مستديرة قطرها 18 مم.
وسائط مصل مخفضة	Thermo Fisher	# 11058021
		مجسم	يستخدم لتشريح الحصين. تتوفر Olympus SZ60 أو المجاهر المجسمة المكافئة.
		الجراحية	مقص تشريح قياسي لقطع بطن الفأر أو الجرذ ، ملاقط لقرص الرحم ، مقص تشريح دقيق لقطع الرحم ورأس الجنين ، ملقط حلقي لقرص الأجنة ، ملقط Semken منحني 13 سم (أدوات العلوم الدقيقة # 11009-13) لاستخراج الأدمغة ، ؛ 3 ملقط بأطراف دقيقة ؛ (دومون إينوكس # 5)
كاشف الإرسال للخلايا العصبية	Thermo Fisher Scientific	#L3000008	"Lipofectamine 3000" reagent. يتكون من "الملحق (P3000)" الذي يجب خلطه مع الحمض النووي البلازميد في الخطوة 2.2.3 ، و "كاشف التعدي (lipofectamine 3000)" المستخدم في الخطوة 2.2.4.
تريبان الأزرق (0.4٪) Thermo	Fisher Scientific	# 15250061
وسط غسيل للخلايا القشرية المجمدة ;			25 مل DMEM ، مكمل ب 250 & micro ؛ L مصل الأبقار الجنينية المعطل حراريا + 12.5 & micro; L البنسلين ستربتومايسين.
فئران ويستار	اليابان SLC، Inc		الفئران الحامل (E18)

يعد EF1a الصور المجهرية منخفض الجلوكوز المجهر مجموعة مرشح المجهر GCaMP6f RCaMP2 نظام يوصى بشدة - يمكن على الكمبيوتر الشخصي مجهر Opti-MEM الأدوات

المراجع

Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
Bagur, R., Hajnoczky, G. Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling. Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).
Bannai, H., et al. Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium. Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).
Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering. Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).
Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).
Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
Niwa, F., et al. Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).
Vervliet, T., et al. Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux. Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).
Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).
Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).
Quasthoff, K., et al. Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures. Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).
Boehringer, R., et al. Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability. Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).
Arizono, M., et al. Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation. Science Signaling. 5 (218), ra27(2012).
Kanemaru, K., et al. In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator. Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).
Inoue, T. TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging. Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).
Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).
Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

OER GCaMP6f Lck RCaMP2