يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج الإدارة عن طريق الفم Galleria mellonella للاستجابات المناعية الفطرية Study Commensal-Induced

8.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59270

⸱

مارس 21, 2019

 ,  , 
1Department for Medical Microbiology, Hygiene, Interfacultary Institute for Microbiology, Infection Medicine, University of Tübingen

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لنموذج إدارة عن طريق الفم استخدام اليرقات Galleria mellonella وكيفية توصيف فعل الاستجابات المناعية الفطرية. باستخدام هذا البروتوكول، سوف تكون قادرة على استخدام ميلونيلا G. التسمين أسلوب الباحثين دون خبرة عملية.

الملخص

التحقيق في احتمال مكسبه للبكتيريا commensal على المضيف المناعي هو واحد من المكونات الأساسية عند دراسة التفاعلات بين الميكروبات المعوية والمضيف. ومن الثابت أن كومينسالس مختلف يحمل إمكانات مختلفة تنشيط الجهاز المناعي المعوي المضيف. هذه التحقيقات تشمل الحيوانات الفقارية، لا سيما من القوارض. نظراً لتزايد مخاوف أخلاقية ترتبط بالتجارب التي تنطوي على الفقريات، هناك ارتفاع طلب على نماذج الاستبدال اللافقارية.

هنا، نحن نقدم نموذج إدارة عن طريق الفم Galleria mellonella استخدام البكتيريا غير ممرضة commensal وتقييم إمكانات مكسبه commensals ممكن على نظام المناعة ميلونيلا G. . ونحن تبين أن ميلونيلا G. نموذج استبدال اللافقارية بديلة مفيدة تتيح تحليل commensals مع إمكانات مكسبه مختلفة مثل الأنواع فولجاتوس والاشريكيه القولونية. من المثير للاهتمام، عرضت البكتيريا أي أثر مقتل على اليرقات، ومماثلة للثدييات. الاستجابات المناعية ل G. mellonella قابلة للمقارنة مع الاستجابات المناعية الفطرية الفقاريات وتشمل الاعتراف بالبكتيريا وإنتاج الجزيئات المضادة للميكروبات. ونحن نقترح أن G. ميلونيلا كان قادراً على استعادة التوازن الحجمية السابقة، ومعروف جيدا من الأصحاء الثدييات. على الرغم من أن توفير الاستجابات المناعية الفطرية قابلة للمقارنة في ميلونيلا G. والفقريات، عدم إيواء G. ميلونيلا الجهاز المناعي التكيفي. منذ التحقيق مكونات نظام المناعة الفطرية تطورية المصانة، النموذج يسمح بتحليل الغربلة والأولى لخصائص مكسبه البكتيرية.

المقدمة

ميكروبيومي المعوية هو عنصر أساسي للحفاظ على التوازن، ويشمل كلا من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيف21،. يتسم المجتمع الحجمية commensal بمختلف مكونات commensal الرئيسي: سيمبيونتس التي تمنح الآثار المفيدة بوظائف هامة إيمونومودولاتوري، باثوبيونتس التي يمكن أن تكون لها آثار ضارة استعداد وراثيا يستضيف والترويج وتؤدي إلى التهاب الأمعاء3،4. قد تم نشر العديد من الدراسات على سيمبيونتس وباثوبيونتس وتأثيرها على النظام المناعي المضيف أساسا دراسة الاستجابات المناعية التكيفية.

أن هذه الدراسات تشمل العديد من الحيوانات للتحقيقات، والحماية، واستبدال الحيوانات المستخدمة للتجريب زيادة اهتمام الجمهور، ونحن نسعى إلى إيجاد نموذج بديل للسماح لفحص البكتيريا المختلفة مكسبه خصائص. الحشرات، لا سيما Galleria mellonella، نموذج استبدال مستخدمة على نطاق واسع في البحوث العدوى. زاي-ميلونيلا يجمع بين مزايا مختلفة مثل تكاليف منخفضة وعالية الإنتاجية؛ أنه يسمح للفم من البكتيريا، وهو مسار التعرض الطبيعي، وأنه يسمح للعدوى المجموعية5،6. ميلونيلا G. كذلك تمكن الحضانة عند 37 درجة مئوية، وهي درجة حرارة الجسم الفسيولوجية للثدييات والأمثل ل التعبير عامل الفوعة الجرثومية5. والميزة الرئيسية ل G. mellonella هو نظام المناعة الفطرية المصانة تمكن التمييز الذاتي من غير المتمتعة بالحكم الذاتي وترميز مجموعة متنوعة من نمط الاعتراف المستقبلات مثل أبوليبوفورين أو طاهية هيمولين6، 7-عند الاعتراف بميكروب، يمكن أن تؤدي ميلونيلا G. مختلف الاستجابات المناعية خلطيه المتلقين للمعلومات. ويمكن حمل ردود الأكسدة وتفرز أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) الذي ينطوي على نشاط NOS (أوكسيديز النيتريك synthase) وأكاسيد النيتروجين (نادف أوكسيديز)6،8. وباﻹضافة إلى ذلك، ينشط ميلونيلا G. استجابة قوية ببتيد مضادات الميكروبات (أمبير)، مما يؤدي إلى إفراز خليط أمبير مختلفة مثل جلوفيرين ومرسين، سيكروبين أو جاليريميسين مثل ديفينسين6، 89،،10. وبصفة عامة، الامبير خصوصية المضيف واسع النطاق ضد الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام والفطريات ويكون لتوفير استجابة فعالة نظراً للحشرات ولا توجد أي استجابة تكيفية10. جلوفيرين أمبير نشط ضد البكتيريا والفطريات ويحول دون تشكيل الغشاء الخارجي6،11. معرض موريسنس وظيفتها الميكروبات ضد الجراثيم إيجابية وسلبية الغرام باختراق الغشاء وتشكيل9،مسام11. سيكروبينس تقديم نشاط ضد البكتيريا والفطريات والغشاء وبالمثل مثل موريسينس9،10بيرميبيليزي. جاليريميسين ببتيد مثل ديفينسين مع الخصائص المضادة للفطريات9. من المثير للاهتمام، أنه وجد أن الجمع بين سيكروبين وجاليريميسين بنشاط تعاوني ضد كولاي10.

بسبب طابعها سهلة الاستخدام ميلونيلا G. يرقات نموذج عدوى غالباً ما تستخدم لتقييم القدرة الإمراضية البكتيرية. على وجه الخصوص، دراسات في البيانات التي تم الحصول عليها من ميلونيلا G. ترتبط بالبيانات المتحصل عليها من الفئران دعم قوة هذا النموذج مضيفة بديلة. ووجد أن اللقاح المسببة للمرض أكثر من الليستريه المستوحدة في نموذج عدوى ماوس يؤدي أيضا إلى ارتفاع معدلات الوفيات في ميلونيلا G. بعد الإصابة الجهازية. علاوة على ذلك، أقل ضراوة اللقاح تبين أنها أيضا أقل ضراوة في نموذج ميلونيلا زاي- 12. ملاحظات مماثلة بذلت مع الفطريات المسببة للأمراض البشرية المبيضات البيض. فوعة مختلفة المبيضة وقسمت سلالات العدوى المجموعية والمراقبة اللاحقة لبقاء اليرقات. كانت سلالات avirulent الماوس أيضا أفيرولينت أو المشاركة انخفاض ضراوة في G. ميلونيلا، بينما سلالات ضراوة الماوس يؤدي أيضا إلى ارتفاع معدل وفيات اليرقات13. الطراز ميلونيلا G. يمكن استخدامها كذلك تحديد نوع 3 إفراز منظومة العوامل الإمراضية الزائفة الزّنجاريّة14.

حيث تركزت معظم التحقيقات التي تشمل ميلونيلا G. على عوامل الفوعة استخدام النهج العدوى المجموعية كنا مهتمة بصفة خاصة في توفير وسيلة مناسبة لتحليل كومينسالس المعوية في التسمين الفم النموذج الذي نحن تطبيق جرعة مميزة من البكتيريا الواحدة واليرقات ولكن ليس فقط مراقبة معدل الوفيات اليرقات تحليل بصمات مختلفة من الاستجابات المناعية الفطرية للحفاظ على التوازن المعوية.

لدينا أسلوب يساعد على زيادة استخدام mellonella زاي- كنموذج بديل منذ أن نجمع بين تطبيق البكتيريا وتحليل الحمض النووي الريبي التعبير. أنها ليست فقط مفيدة لتعزيز معنى الدراسات المرضية البكتيرية عندما بما في ذلك تحليل الاستجابات المناعية بعد الإدارة عن طريق الفم، وليس فقط مراقبة معدلات الوفيات بعد الإصابة الجهازية. أساليب عملنا ويسمح لتحليل خصائص مكسبه للبكتريا غير ممرضة commensals نظراً لأنها توفر ظروف أكثر تعقيداً من خلية ثقافة بتوفير حاجز الأمعاء في حي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1- ميلونيلا زاي- تربية وإعداد اليرقات للتجارب

ملاحظة: يأخذ الدورة من البيض آخر instar اليرقة حوالي 5-6 أسابيع.

  1. نقل البيض زرعتها العث الكبار للأم 2 صناديق تحتوي على الركازة العثة الشمع (الحصى الذرة 22%، وجبة القمح 22%، شمع العسل 17.5%، ومسحوق الحليب المقشود 11%، العسل 11%، والغليسيرول 11%، الخميرة المجففة 5.5 في المائة). أداء كامل تربية عند 30 درجة مئوية في الظلام.
  2. نقل 25 جرام الركازة يحتوي على اليرقات في الركازة جديدة بعد ما يقرب من 1-2 أسابيع عندما كانت تظهر يرقات صغيرة وصغيرة. مزامنة اليرقات بعد أسبوعين وفقا لحجمها وتبقى مجموعات من 30-40 اليرقات في حاويات ل 2 على الركازة العثة الشمع لمدة 2 أسابيع إضافية.
  3. حدد اليرقات للتجارب حسب الوزن. استخدام اليرقات تتحرك فقط باهتة وسريعة مع كتلة من 180-200 ملغ.

2-زراعة وإعداد الأنواع فولجاتوس و الإشريكيّة القولونية للإدارة عن طريق الفم

  1. تنمو mpk فولجاتوس الأنواع البكتيريا اللاهوائية تلزم عند 37 درجة مئوية لاهوائيا باستخدام الجرار وكيس لخلق بيئة لا هوائية (انظر الجدول للمواد)15،16. زراعة فولجاتوس باء لمدة يومين وتنمو ثقافة فرعية بين عشية وضحاها في الدماغ القلب ضخ (بهي) مرق.
  2. تنمو mpk الإشريكيّة القولونية بكتيريا اللاهوائية الاختيارية الظروف الهوائية في مرق لوريا بيرتاني (رطل) عند 37 درجة مئوية. زراعة كولاي بين عشية وضحاها في مرق رطل وتنمو ثقافة فرعية ح 2 في 37 درجة مئوية في يوم التجربة.
  3. حصاد الثقافات بالطرد المركزي في س 1,700 ز لأدنى 5 ريسوسبيند الكريات البكتريا في دببس (فوسفاتيبوفيريد 's دولبيكو المالحة). تحديد الكثافة البصرية (OD) الثقافات البكتيرية في التطوير التنظيمي 600 نانومتر وحساب تركيزات بكتيرية. تم تعديل تركيزات بكتيرية إلى 109/mL.

3-التسمين من اليرقات mellonella زاي- مع تعليق البكتيرية

  1. فورسيفيد كل يرقة مع 10 ميليلتر من تعليق البكتيرية المعدلة التي تحتوي على 107 البكتيريا للجرعة. استخدام حقنه الأنسولين بإبرة حادة انتهت للتطبيق عن طريق الفم لتعليق البكتيرية.
    1. إصلاح المحاقن في مضخة ميكروسيرينجي (الشكل 1) ضمان دقة حجم تعليق تطبيقها على كل يرقة (انظر الجدول للمواد). إدراج المحاقن بعناية بين هذه mandibles. لا تستخدم القوة للمحاقن بين mandibles. انتظر اليرقات فتحه فمها وإدراج ثم المحاقن.
  2. احتضان اليرقات الموريتانيات في الظلام في 37 درجة مئوية بين حاء – 1-24 التي تديرها "دببس استخدام" اليرقات كعناصر تحكم خلفية صورية لاستبعاد الاستجابات المحتملة الإجهاد الناجم عن سبب تناول اليرقات أثناء التسمين.

4-تجهيز اليرقات تدار شفويا وعزل الحمض النووي الريبي

  1. تعمل تحت غطاء محرك السيارة، وارتداء نظارات الأمان. تنظيف الكاشف هود والرش لمنع تلوث رناسي.
    1. الأداة الإضافية-تجميد اليرقات الحية بعد حضانة في النتروجين السائل ومجانسة لها. استخدام قذائف الهاون والمدقة للتجانس. إضافة النيتروجين السائل لقذائف الهاون والشبكة كل فرد اليرقات حتى يتم إنتاج مسحوق هوموجيناتيس.
    2. من أجل هوموجيناتي للمتاح وزنها القارب والانتظار للنتروجين السائل تتبخر.
  2. المزيج السائل خالية من النيتروجين المجمد المجفف هوموجيناتيس مع 1 مل تريزول في أنبوب 2 مل واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة ح 1.
  3. الطرد المركزي الخليط في 8,000 س ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ونقل المادة طافية في أنبوب جديد وتجاهل بيليه. مزيج من المادة طافية مع 200 ميليلتر من 1-برومو-3-تشلوروبروباني (BCP). دوامة واحتضان المخلوط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة و لمدة 10 دقائق على الجليد.
  4. الطرد المركزي ردود الفعل أضيف BCP في س 18,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل الطبقة العليا الشفافة في أنبوب 2 مل جديدة وتجاهل الباقي. يعجل بالجيش الملكي النيبالي لنقل الطبقة العليا مع 500 ميليلتر الايزوبروبانول بالاختلاط وعكس أنبوب لمدة 5 دقائق.
  5. الطرد المركزي الأنبوب في س 18,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. أغسل بيليه سرع الجيش الملكي النيبالي مع 500 ميليلتر من الإيثانول 75%.
  6. الجاف لبيليه الحمض النووي الريبي لمدة 5-10 دقيقة في الرايت العناية ليست أكثر من الجافة فإنه سيكون من الصعب حل في وقت لاحق.
  7. تمييع ribonuclease المانع (1: 100) في المياه خالية من نوكلاس واستخدام 100 ميليلتر من الحل إلى ريسوسبيند بيليه الحمض النووي الريبي المجففة. دوامة الأنبوب بعناية حتى يذوب بيليه تماما.
  8. قياس الحمض النووي الريبي النوعية والكمية. تأكد من أن نسبة 260/280 تقريبا نسبة 2.0 و 260/230 في النطاق (انظر الجدول للمواد) 2.0-2-2.
  9. استخدام 5 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي معزولة الهضم الدناز. مزيج 5 ميليلتر من 10 × المخزن المؤقت، 1 ميليلتر ribonuclease مثبط إنزيم، ميليلتر 2 إنزيم الدناز، 5 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي، وملء مع خالية نوكلاس المياه تصل إلى 50 ميليلتر. إينكوباتي لمدة 30 دقيقة في الرايت
    1. إضافة 6 ميليلتر من كاشف المنظمة واحتضان لمدة 2 دقيقة في رد فعل RT ودوامه أحياناً. الطرد المركزي رد الفعل في 10,000 س ز 1 دقيقة نقل المادة طافية في أنبوب جديد 1.5 مل.
      ملاحظة: يحتوي الجيش الملكي النيبالي على الجيش الملكي النيبالي اليرقات فضلا عن الجيش الملكي النيبالي البكتيرية من سلالة كل منهما يستخدم للفم.

5-التقدير الكمي لإعداد نسخة البكتيريا 16S بعد التسمين

ملاحظة: عدد نسخ 16S البكتيرية أعرب مصممة استخدام كدنا توليفها من الحمض النووي الريبي المستخرج من الباب 4. يحسب التقدير الكمي النهائي مع المساعدة من المنحنى القياسي من بلازميد الذي تم استنساخ جزء بكر 16S فولجاتوس باء أو كولاي .

  1. إعداد معايير بلازميد
    1. تضخيم الشظايا 16S من mpk كولاي أو mpk فولجاتوس باء المجينية الحمض النووي ببكر. ميكس 10 ميليلتر من 5 × المخزن المؤقت، 1 ميليلتر الحل دنتب 10 ملم وميليلتر 2.5 من التمهيدي إلى الأمام 10 ميكرون 2.5 ميليلتر من 10 ميكرون التمهيدي عكس تمييع، 1 ميليلتر [دمس]، 1 ميليلتر المجينية الحمض النووي قالب، 31.5 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي و 0.5 ميليلتر من إنزيم المطبعية.
    2. تشغيل بكر (تمسخ الأولية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ق، تمسخ: 98 درجة مئوية لمدة 10 s، الصلب: 60 درجة مئوية ل 30s، ملحق: 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، التمديد النهائي: 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتمسخ تكرار، والصلب والإرشاد لدورات 30).
      1. استخدام 16S كولاي الإشعال (p_forward: جتاتاككتتجكتكاتجا، p_reverse: أككاججتاتكتاتككتجت17، 320 bp) أو كبسولة تفجير فولجاتوس باء- 16S (p_forward: آككتجككجتكتاكتكت، p_reverse: كاكتجاكتااكاتككات18، 400 شركة بريتيش بتروليوم) ل التضخيم.
    3. استخدام الشظايا بكر 16S كولاي و فولجاتوس لنهاية بلانت الاستنساخ إلى ناقل استنساخ. إعداد عملية ربط وخلط 10 ميليلتر من 2 × المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من غير تنقية المنتج بكر، 1 ميليلتر من نهاية بلانت بلازميد الاستنساخ، ميليلتر 7 من المياه خالية من نوكلياسي و 1 ميليلتر من ليجاسى الحمض النووي T4. تبني عملية ربط لمدة 10 دقائق في الرايت
    4. إعداد الخلايا المختصة DH5α كولاي .
      1. تلقيح 100 مل متوسطة رطل في قارورة Erlenmeyer مع 1 مل ثقافة بين عشية وضحاها. تنمو الثقافة حتى OD 600 نيوتن متر ما بين 0.4-0.6. تقسيم الثقافة الناتجة إلى أنبوبين 50 مل واحتضانها الثقافات على الجليد لمدة 10 دقائق.
      2. الطرد المركزي في الثقافات في س 1,700 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند كل بيليه بعناية مع 5 مل من محلول RFI (30 ملم CH3كوك، 100 ملم بوكل، 10 مم كاكل، 50 مم2من الحركة، ضبط الأس الهيدروجيني 5.8 مع حمض الجليدية، والعقيمة التي تمت تصفيتها). ملء كل أنبوبة مع إضافية 45 مل آر إف أي حل.
      3. الطرد المركزي في الثقافات في س 1,700 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند كل بيليه بعناية مع 6 مل رفيي (والمماسح 10 مم، 15 ملم كاكل2، 10 مم بوكل، والغليسيرول 15 ٪، يعقم) الحل. تجمع كل الكسور واحتضان تعليق 12 مل على الجليد ل 15 دقيقة تحضير خلية تعليق مختبرين (200 ميليلتر). تخزين مختبرين في-80 درجة مئوية.
    5. نقل رد فعل ربط إلى قاسمة واحد المختصة كولاي الخلايا DH5α وإجازة رد فعل على الجليد للحرارة 15 دقيقة صدمة الخلايا ل 45 s في 42 درجة مئوية وإضافة 1 مل متوسطة رطل.
      1. احتضان التحول لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة 100 ميليلتر من التحول إلى لوحة أجار رطل تتضمن الأمبيسلّين واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    6. أداء مستعمرة بكر من 8 ترانسفورمانتس الناتجة من لوحة أجار رطل من الخطوة 5.1.5. اختيار كل مستعمرة مع مسواك وتراجع على صفيحة رطل جديدة تتضمن الأمبيسلّين (اللوحة الرئيسية) ثم تراجع مسواك نفسه في ميليلتر 5.5 تحتوي أيضا على المياه خالية من نوكلاس في مجموعة شريطية PCR.
      1. إضافة ميليلتر 7.5 من 2 x PCR ميكس، 0.5 ميليلتر من 10 ميكرون التمهيدي إلى الأمام و 0.5 ميليلتر من 10 إضعاف التمهيدي عكس ميكرومتر. باستخدام أزواج التمهيدي نفسها المذكورة في المقطع 5.1.1.
      2. تشغيل بكر (تمسخ الأولى: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تمسخ: 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، الصلب: 60 درجة مئوية ل 30s، ملحق: 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، التمديد النهائي: 72 درجة مئوية لدقيقة 7، كرر تمسخ والصلب وملحق لدورات 35).
    7. تحقق من حجم الشظايا 16S في 1% [اغروس] هلام. استخدام مخزن تريس-بورات-يدتا (TBE) x 0.5 حل ز 1 من [اغروس] ويغلي في فرن ميكروويف. إضافة صبغة مقياس جل ومن أجل ذلك. إضافة ردود فعل PCR مستعمرة وسلم الحمض النووي bp 100 إلى الهلام، وتشغيل هلام لمدة 45 دقيقة في 110 V.
    8. تطعيم ثقافة بين عشية وضحاها رطل 5 مل تحتوي على الأمبيسلّين مع استنساخ واحد من اللوحة الرئيسية (قسم 5.1.6) لكل بلازميد 16S كولاي و فولجاتوس (ب) يحتوي على حجم إدراج الحق.
      1. الطرد المركزي الثقافات بين عشية وضحاها البكتيرية في أنبوب 2 مل في س 1,700 ز. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 600 ميليلتر الماء المعقم.
      2. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل والمزيج بعكس الأنبوب 6 مرات. إضافة 350 ميليلتر من الباردة (4 درجة مئوية) تحييد الحل ومزيج دقيق بعكس الأنبوب.
      3. أجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة في أجهزة الطرد مركزي للحد الأدنى 3 نقل المادة طافية (~ 900 ميليلتر) إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة في أجهزة الطرد مركزي لمدة 15 ثانية.
      4. تجاهل في فلووثرو وإضافة 200 ميليلتر من الذيفان إزالة المياه والصرف الصحي، وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة في أجهزة الطرد مركزي لمدة 15 ثانية.
      5. إضافة 400 ميليلتر من الحل أغسل للعمود والطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة في أجهزة الطرد مركزي لنقل س. 30 من العمود إلى أنبوب نظيفة 1.5 مل، إضافة 30 ميليلتر شطف المخزن المؤقت للعمود لاحتضان عليه لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      6. أجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة في أجهزة الطرد مركزي لمدة 30 ثانية (انظر الجدول للمواد).
    9. تحديد تركيز الحمض النووي بلازميد بخلط 1 ميليلتر من بلازميد الحمض النووي مع 199 ميليلتر لحل عملي (1 ميليلتر من صبغة الفلورسنت كل ميليلتر 199 من المخزن المؤقت لكل رد فعل). إعداد معايير لاثنين من مخالطة 10 ميليلتر من ميليلتر 1 أو 10 معيار قياسي 2 ميليلتر 190. دوامة العينة وأنابيب القياسية واحتضان رد فعل للحد الأدنى 2 قياس التركيز (انظر الجدول للمواد).
    10. إعداد تركيزات القياسية في تخفيف المسلسل إذ في مجموعة من نسخ 10-100,000: حساب كتلة بلازميد واحد (m = n (n) x (1.096x10-21 g/bp)، = حجم بلازميد، m = الكتلة). حساب كتلة بلازميد الحمض النووي اللازمة لتحتوي على أرقام النسخ المطلوبة للفائدة (نسخ عدد من الفوائد × كتلة واحدة بلازميد = كتلة من بلازميد الحمض النووي اللازمة).
  2. إعداد العينات للقياس الكمي
    1. توليف كدنا. خلط 2 ميليلتر من المخزن المؤقت 7 x, 1 ميليلتر من الجيش النيبالي الملكي يهضم الدناز من القسم 4 و 11 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس. احتضان لمدة 2 دقيقة في 42 درجة مئوية.
      1. وضع الرد فورا على الجليد. 4 مزيج ميليلتر من 5 × RT المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من ميكس التمهيدي RT (المنتسخة العكسية)، 1 ميليلتر من إنزيم RT ورد فعل الخطوة 5.2.1. احتضان لمدة 15 دقيقة في 42 درجة مئوية. احتضان لمدة 3 دقائق عند 95 درجة مئوية لإلغاء تنشيط إنزيم RT.
    2. تحديد حجم كدنا تركيزات فلوروميتريكالي مثل الموضحة في الخطوة 5.1.9.
  3. قياس الحمولة البكتيرية
    1. ضبط تركيزات كدنا أن 5 نانوغرام كل 12 رد فعل ميليلتر ل PCR الكمي. مزيج مزيج RT-PCR x 2، 0.25 ميليلتر من 100 ميكرومتر إلى الأمام التمهيدي، 0.25 ميليلتر من 100 ميكرومتر عكس التمهيدي (5.1.1) و 12 ميليلتر من كدنا المعدلة. تشغيل قبكر (تمسخ الأولى: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تمسخ: 95 درجة مئوية لمدة 10 ق، الصلب: 60 درجة مئوية لمدة 30 s وتمسخ تكرار والصلب لدورات 35، ذوبان: 95 درجة مئوية، باردة وصولاً إلى 4 درجات مئوية).
    2. ارسم سجل10 تجمعات من بلازميد المنحنى المعياري (10-100,000 نسخ)، أي 1-5 (س)، ضد القيم المناظرة في الأشعة المقطعية-المحور (ص). إجراء الانحدار الخطي للحصول على معادلة الانحدار. حل المعادلة x (تركيز). استخدام الصيغة لحساب سجل10 من إعداد نسخة عن طريق إدراج قيمة الأشعة المقطعية في الصيغة. حساب أنتيلوجاريثم للحصول على أرقام نسخة.

6-تحديد الجينات ماركر المناعة الفطرية باستخدام الكمية RT-PCR

  1. فحص كبسولة تفجير للجينات-خصوصية بكر واللاحقة [اغروس] هلام التفريد للتحقق من حجم الجزء الصحيح. إجراء PCR مثل الموصوفة في المقطع 5.1.5.
    Bp 130 أوبيكويتين: إلى الأمام تكاتجكاجتاجتككجتك، وعكس ككاجتكتجكتجكتجاتااكك19 (التدبير المنزلي)
    Bp 159 من أكاسيد النيتروجين--4 : إلى الأمام تجكاكجكاتكاجتاتكا، عكس أكاجكجاكتجتكاتجتجا8
    Bp nos 76: إلى الأمام أتجاجتجكتجاجتكاكا، عكس جككاتتتاكاتكجككاكا8
    Bp Gst 156: إلى الأمام جاكاجاجتككتككجتكاج، عكس تككجتكتكاجكااجكا8
    بي أبوييي 265: إلى الأمام أجاكتجكاكجككاتكاجا، عكس تجكاتجكتجتتجتكاكتجك8
    هيمولين 267 bp: إلى الأمام كتكككتكاكجاجاكااك، عكس جككاكجكاكاتجتاتكاكك8
    بي جاليريميسين 161: إلى الأمام جاجتكتاكاجاتكاكاكجا، عكس أتكجاجاكاتجاكاتككا8
    بي سيكروبين 158: إلى الأمام كتجتكجتجتكجكتجتجت، عكس جتاجكتجكتكجككتاككاك8
    بي جلوفيرين 101: إلى الأمام جتجتجاجكككجتاتججا، عكس ككجتجكاتكتجكتجكتاك8
    bp مرسين 124: إلى الأمام جكتجتاكتكجكتجكاكتجات، عكس تجكجاتكاتجكككتكتت8)
  2. تقييم كفاءة التمهيدي يكون E = 2.
    1. بلياردو 2 ميليلتر من 5-10 عينات إيجابية مختلفة (أي، العينات التي هي التعبير عن الجينات التي يحتاج زوج التمهيدي التحقيق).
    2. إعداد سلسلة 1:5 إضعاف تجمع العينة: 1 القياسية (S1): مخفف تجمع؛ S2: 2 ميليلتر من S1 + 8 ميليلتر خالية من نوكلياسي المياه؛ S3: 2 ميليلتر من S2 + 8 ميليلتر خالية نوكلاس المياه؛ S4: 2 ميليلتر من S3 + 8 المياه خالية من nuclease ميليلتر.
    3. تطبيق 1 ميليلتر من S1-S4 وعنصر تحكم غير القالب (المياه خالية من nuclease) على لوحة قبكر 96-جيدا. إضافة 5 ميليلتر من مزيج الرئيسي الرايت ميليلتر 0.1 من كل 100 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيدي وميليلتر 3.7 من المياه خالية من نوكلاس وميليلتر 0.1 من مزيج RT كل بئر.
    4. تشغيل RT-PCR الكمي (عكس النسخ: 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تمسخ الأولى: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تمسخ: 95 درجة مئوية لمدة 10 ق، الصلب: 60 درجة مئوية لمدة 30 s وتمسخ تكرار والصلب لدورات 40، ذوبان: 95 درجة مئوية، باردة وصولاً إلى 4 درجات مئوية).
    5. تسجيل الأرض10 وحدات النسبي ل S1-S4 (1، 0.2، 0.04، 0، 008) (س) ضد القيم المناظرة في الأشعة المقطعية-المحور (ص). إجراء الانحدار الخطي وتحديد منحدر المنحنى المعياري. حساب كفاءة e: E = 10-(1/slope). 20
      ملاحظة: يشير إلى منحدر-3.32 ظروف مثالية رد الفعل وكفاءة التمهيدي ه = 2.00. وهذا يعني: كمية المنتج بكر الزوجي خلال كل دورة.
  3. استخدام 100 نانوغرام من هضم الحمض النووي الريبي (100 نانوغرام/ميليلتر) كقالب ل RT-PCR. ميكس RT-PCR الكواشف وتشغيل RT-PCR مثل المذكورة في القسم 6-2. قياس جميع العينات التي تديرها البكتيريا ودببس مع التدبير المنزلي التمهيدي زوج وأزواج التمهيدي المستهدفة. دائماً تشغيل تخفيف S1-S4 مع زوج التمهيدي التدبير المنزلي و S1-S4 مع زوج التمهيدي المستهدف على نفس اللوحة لتحديد الكفاءة.
  4. حساب نسبة (R) من الحمض النووي الريبي التعبير الجيني وفقا للصيغة التالية استخدام كفاءة التمهيدي تصميماً تجريبيا في التدبير المنزلي وزوج التمهيدي المستهدفة. تطبيع البكتيريا تحفز عينات وهمية20من عناصر التحكم.
    figure-protocol-1
    R: نسبة
    هالهدف: قياس كفاءة S1-4 مع زوج التمهيدي الهدف
    هالتدبير المنزلي: قياس كفاءة S1-4 مع زوج التمهيدي التدبير المنزلي
    Δctالهدف(نموذج عنصر تحكم): Δct (الأشعة المقطعية لتغذية دببس عينة)-(ct من البكتيريا التي تتغذى عينة) تقاس مع زوج التمهيدي الهدف
    Δctالتدبير المنزلي(نموذج عنصر تحكم): Δct (الأشعة المقطعية لتغذية دببس عينة)-(ct من البكتيريا التي تتغذى عينة) تقاس بالتدبير المنزلي التمهيدي زوج

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نموذج العدوى هيموليمف ميلونيلا G. في تستخدم على نطاق واسع لتحليل عوامل الفوعة من مجموعة كبيرة من العوامل الممرضة. وتشمل معظم القياسات تحليل الوفيات اليرقات، وطريقة سهلة جداً. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا تسمح الاستنتاجات حول الاستجابات المناعية بصورة عامة وربط نتائج الاستجابات المناعية ميلونيلا G. مع الآليات المناعية الفقاريات. من ناحية أخرى نموذج الإدارة عن طريق الفم ميلونيلا G. إلا نادراً ما يستخدم للعدوى عن طريق الفم أو استعمار اليرقات بسبب الصعوبات الحصول على الج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعتبر هذا النموذج ميلونيلا G. نموذج المستخدمة بشكل متكرر لتقييم عوامل الفوعة الجرثومية في نهج عدوى المجموعية21. نظراً للعديد من العوامل الممرضة والبكتيريا أدخل المضيف عبر طريق الاستعمار أو العدوى عن طريق الفم، تحتاج إلى رؤى جديدة الاطلاع على تقييم ميلونيلا زاي- كنموذج للاستعمار عن طريق الفم والإصابة.

إمكانية الخلفية G. ميلونيلا بين 15-37 درجة مئوية ميزة كبيرة نظراً لنماذج أكثر الثدييات الحفاظ على درجة حرارة الجسم 37 درجة مئوية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل DFG (SPP1656) ومجموعة التدريب البحوث DFG 1708، أوند فيما für بونديسمينيستيريوم Forschung (الألمانية)، والمركز الألماني لبحوث الإصابة (دزيف).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب 1.5 ملEppendorf0030120086
سلم الحمض النووي 100 نقطة أساس ؛15628019ثيرمو فيشر العلمي
1-برومو-3-كلوروبروبان (BCP)سيجما-ألدريتشB9673
2 مل أنابيبإيبندورف0030120094
2x مانجوميكسبيولوينBIO-25033كولوني بي سي آر
50 مل أنابيبجرينر بيو وان210 261
أغاروزبيوزيم840004
شمع العسلMixed-Store.de -
مرق تسريب القلب في الدماغThermo Fisher ScientificCM1135
CloneJET PCR CloningKit Thermo Fisher ScientificK1232ناقلات الاستنساخ لشظايا 16S
فريك الذرةOstermü hle Naturkost GmbH306الزراعة العضوية
Difco LB Agar ، Miller (Luria-Bertani)Becton DickinsonBD
Difoco LB Broth ، Miller (Luria-Bertani)Becton Dickinson244610
مجموعة إزالة الحمض النووي الخالية من الحمض النووي   ؛ثيرمو فيشر العلمي244510  هضم Dnase
الخميرة المجففةRapunzel  ؛ -الزراعة العضوية
Dulbecco's Fossil-Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher Scientific14040
EthanolVWR20821.330
GlycerolSigma-AldrichW252506
HoneyOstermü hle Naturkost GmbH487
Isopropanol VWR20842.330
Lightcycler 480 Instrument IIRoche Molecular Systems5015278001
LightCycler 480 Multiwell Plate 96 ، أنظمةروش الجزيئيةالبيضاء 4729692001
مضخة الحقنة الدقيقة اليدوية مع شاشة رقميةأدوات الدقة العالميةDMP
Micro-Fine + U-100 حقنة الأنسولين 0.3 × 8 ممبيكتون ديكنسون324826الإعطاء عن طريق الفم
، VWR410-9327 غير
NanodropThermo Fisher Scientific13-400-518
مياه خالية من النوكلياز  أكياس Thermo Fisher Scientific10977035
Oxoid AnaeroGen sacets AN0025A Thermo Fisher Scientificجودة وكمية خطوط RNA
PCRBiozym 710970
مدقة ، سطح طحن غير مزججVWR410-9324   ؛
إنزيم القراءة اللغوية Phusion Thermo Fisher ScientificF553S
PrimersBiomers -
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1222
QuantiFast SYBR Green PCR kit Qiagen204056qPCR لقياس رقم النسخ البكتيرية
QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit  Qiagen204156qRT-PCR لقياسات التعبير الجيني
QuantiTect Reverse Transcription Kit  Qiagen205311توليف (كدنا
أنابيب فحص كيوبيتالحرارية فيشر العلميةQ32856
كيوبيت dsHS مجموعة الحمض النووي  Thermo Fisher ScientificQ32851القياس الكمي لعينات البلازميد والحمض النووي (cDNA
مقياس الفلور QubitThermo Fisher ScientificQ33226القياس الكمي لعينات البلازميد والحمض النووي
(cDNA) RNase-ExitusPlusAppliChemA7153
مثبط ريبونوكلاز RnasinPromegaN2511
مسحوق الحليب منزوع الدسمSucofin -
SYBR آمن الحمض النووي جل وصمة عارالحرارية فيشر العلميةS33102
TRI كاشف  Sigma-AldrichT9424
قارب الوزنVWR10803-148
وجبة القمحOstermü hle Naturkost GmbH6462زراعة عضوية
ملاط المزجج ؛) )

المراجع

  1. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
  2. Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310(2012).
  3. Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
  4. Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
  5. Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
  6. Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
  7. Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459(2014).
  8. Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
  9. Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
  10. Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
  11. Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
  12. Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
  13. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
  14. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  15. Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
  16. Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
  17. Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788(2013).
  18. Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
  19. Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
  20. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).
  21. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392(2012).
  22. Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بكتيريا متعايشةالاستجابة المناعية الفطريةاستخلاص الحمض النووي الريبي (RNA)تحليل التعبير الجينيالتخلص من البكتيرياتفعيل العلامات المناعيةالببتيدات المضادة للميكروباتأنواع الأكسجين التفاعلية
نموذج الإدارة عن طريق الفم Galleria mellonella للاستجابات المناعية الفطرية Study Commensal-Induced
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.