مقالة منهجية

عزل وإكثار بريون البروتين التعبير خلال تمايز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية البشرية لب الأسنان

DOI:

10.3791/59282

⸱

مارس 18, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا لعزل "الخلايا الجذعية لب الأسنان" البشرية والدعوة من أجل تقييم التعبير بريون البروتين أثناء عملية تمايز الخلايا العصبية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قضايا الأخلاقيات البيولوجية المتصلة بالتلاعب بالخلايا الجذعية الجنينية أعاقت التقدم في مجال البحوث الطبية. ولهذا السبب، من المهم جداً للحصول على الخلايا الجذعية البالغة من أنسجة مختلفة مثل الدهنية والحبل السري والنخاع العظمى والدم. بين المصادر الممكنة، لب الأسنان تتسم بأهمية خاصة لأنه من السهل الحصول عليها فيما يتعلق باعتبارات أخلاقيات علم الأحياء. والواقع أن الخلايا الجذعية لب الأسنان البشرية (هدبسكس) هي نوع من الخلايا الجذعية البالغة قادرة على التمييز في الخلايا العصبية مثل ويمكن الحصول عليها من المولى الثالث للمرضى الأصحاء (الفئة العمرية 13-19). على وجه الخصوص، لب الأسنان تم إزالتها مع حفارة مقطعة شرائح صغيرة وتعامل مع كولاجيناز الرابع ومثقف في قارورة. للحث على التفريق بين الخلايا العصبية، قد حفزت هدبسكس مع لو/بفجف لمدة أسبوعين. سابقا، قد أثبتنا أنه أثناء عملية التمايز محتوى الخلوية بريون البروتين (PrPج) في هدبسكس زيادة. وأظهر تحليل سيتوفلوريميتريك تعبير مبكر عن الحزب الثوريج التي ازدادت بعد عملية تمايز الخلايا العصبية. الاجتثاث من الحزب الثوريج قبل siRNA PrP حالت دون تمايز الخلايا العصبية الناجمة عن لو/بفجف. في هذه الورقة، توضح لنا أن علينا تعزيز العزل والفصل و في المختبر أساليب زراعة هدبسكس مع عدة إجراءات سهلة، كانت أكثر كفاءة الخلية استنساخ التوسع على نطاق واسع والتي تم الحصول عليها للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) وقد لوحظ. ونحن أيضا إظهار كيف هدبسكس، التي تم الحصول عليها بطرق مفصلة في البروتوكول، ونموذج تجريبي ممتازة لدراسة عملية تمايز الخلايا العصبية MSCs والعمليات الجزيئية والخلوية اللاحقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكانت الخلايا الجذعية الوسيطة معزولة من أنسجة عدة، بما فيها نخاع العظام ودم الحبل السري ولب الأسنان البشرية، والأنسجة الدهنية والدم1،2،3،،من45 , 6-كما أفاد العديد من المؤلفين، هدبسكس إظهار البلاستيك التقيد، مورفولوجيا تنتجها الخلايا الليفية مثل نموذجي. وهذه تمثل عدد سكان العالية غير متجانسة مع الحيوانات المستنسخة مميزة والاختلافات في القدرات التكاثري والتفريق7،8. هدبسكس التعبير عن علامات محددة للخلايا الجذعية الوسيطة (أي CD44، CD90، CD73، CD105، قامت-1)، وهي سلبية لبعض العلامات المكونة للدم (مثل CD14 و CD19) وهي قادرة على التمايز في المختبر مولتيلينيجي9، 10،11.

وقد أظهرت العديد من المؤلفين أن هذه الخلايا غير قادرة على التمييز في الخلايا العصبية مثل استخدام البروتوكولات المختلفة، التي تشمل إضافة ستموت، بفجف، لو في تركيبة مع محدد وسائط الإعلام والملاحق7،12. أيضا، تشارك العديد من البروتينات أثناء عملية تمايز الخلايا العصبية، ومن بين هذه، تظهر عدة ورقات دور ذات الصلة والتعبير كبيرة من بروتين بريون الخلوية (PrPج)، سواء في الخلايا الجذعية الجنينية والبالغة13، 14-يمثل الحزب الثوريج جزيء بليوتروبيك قادرة على أداء وظائف مختلفة داخل الخلايا كالنحاس الأيض، المبرمج، والتشديد على المقاومة للأكسدة15،،من1617 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

لدينا ورقة السابقة23، نحن التحقيق في دور الحزب الثوريج في عملية تمايز الخلايا العصبية هدبسكس. وفي الواقع، هدبسكس إكسبريس بريكوسيوسلي PrPج ، وبعد التفريق بين الخلايا العصبية، كان من الممكن نلاحظ زيادة إضافية. مؤلفين آخرين الافتراض بدور محتمل للحزب الثوريج في عمليات تمييز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية. وفي الواقع، محركات PrPج التفريق بين الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الخلايا العصبية، وأوليجوديندروسيتيس، وأستروسيتيس24. وكان الغرض من هذه الدراسة التأكيد على المنهجية للحصول على الخلايا الجذعية من لب الأسنان وعملية التمايز ودور الحزب الثوريج خلال تمايز الخلايا العصبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد اقتطعت الأضراس الثالثة المستخدمة في الدراسة من المرضى (13-19 سنة) مع لا تاريخ مسبق لاستهلاك الكحول أو المخدرات، والتدخين جميع وصحة الفم والأسنان المناسبة. اليوم من التفسير، في قسم علوم طب الأسنان والفكين في جامعة روما "سابينزا"، تم الحصول على الموافقة المستنيرة من المرضى أو الآباء والأمهات. تم الحصول على الموافقة المستنيرة على أساس الاعتبارات الأخلاقية وموافقة لجنة الأخلاقيات.

1-الأسنان واستخراج لب الأسنان

  1. إعداد الوسيلة المناسبة للحفظ أو النقل.
    1. إعداد "تعديل النسر" دولبيكو متوسط تركيز منخفض من الجلوكوز (دميم-L) مع لام الجلوتامين (494.5 مل).
    2. إضافة 5 مل من البنسلين/ستربتوميسين (1%) و 0.5 مل الامفوتريسين (0.1%).
  2. استخراج المولى الثالث من المريض، بسرعة شطفة مع برنامج تلفزيوني، ووضعت في أنبوب اختبار 15 مل مع المتوسط ونقلها إلى المختبر في أقل من 2 ح.
  3. تحت غطاء واقية، فتح الأسنان مع قاطع بتمرير قطع الاكليلية المماس سقف قاعة اللب ومتوازية.
  4. بلطف إزالة اللب مع حفارة صغيرة ووضعها في أنبوب اختبار.
  5. أغسل ثلاث مرات ببرنامج تلفزيوني والطرد المركزي في س 2,500 ز لمدة 10 دقائق في الرايت

2-معالجة لب الأسنان والإفراج عن الخلايا الجذعية

  1. إزالة المادة طافية، ريسوسبيند بيليه في الحل في هانك ووضعه في طبق بتري. احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
  2. اكتب الرابع كولاجيناز إعداد الحل.
    1. إعداد 0.8 مل من دميم-l.
    2. تذوب 1 مغ من النوع الرابع كولاجيناز مل 0.8 L دميم ودوامه لمدة عدة دقائق.
    3. إضافة دميم-L تصل إلى 1 مل أن يكون تركيز نهائي 1 ملغ/مل.
    4. تصفية الحل مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
  3. إزالة الحل هانك بواسطة الطرد المركزي في س 2,500 ز لمدة 10 دقائق في الرايت ويقسم اللب إلى شرائح صغيرة أبروكسيماتيفيلي 1 مم كل واحد مع مشرط المتاح.
  4. وضع شرائح اللب في طبق بتري واحتضان مع 1 مل من النوع الرابع كولاجيناز لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
  5. إعداد الثقافة المتوسطة (500 مل).
    1. إلى 445 مل من دميم-L مع لام الجلوتامين.
    2. إضافة 50 مل مصل البقري الجنين (FBS) (10%).
    3. إضافة 5 مل من البنسلين/ستربتوميسين (1%).
  6. الطرد المركزي العينة في س 2,500 ز لمدة 10 دقائق في الرايت، إزالة المادة طافية، ريسوسبيند بيليه في الأجل المتوسط (الخطوة 2، 5) والثقافة في قارورة T25 محددة للخلايا الجذعية في 37 درجة مئوية في شركة 5%2.

3-الخلايا الجذعية الثقافة والنشر

  1. كل يوم تحقق الثقافة، وبعد 3 أيام نمو، مراقبة مختلفة استنساخ الخلايا ملتصقة داخل قارورة.
  2. تغيير كل 3 أيام المتوسطة الثقافة.
  3. بين 7 و 12 يوما، بمجرد الوصول إلى التقاء الخلايا ملتصقة، فصل لهم بعلاج الخلايا مع 1 مل يدتا التربسين لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية أو برفق باستخدام مكشطة خلية.
  4. إضافة 4 مل (نسبة 1:5) للثقافة المتوسطة (الخطوة 2.5) لوقف عمل التربسين.
  5. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 6 دقائق في 259 x زوإزالة المادة طافية ووضع الخلايا في قارورة T25 للنشر.
    ملاحظة: كل 3 أيام تصل الخلايا إلى التقاء.
  6. تنتشر الخلايا تصل إلى 21 أو 28 يوما (حوالي 6-8 فقرات) لتجنب الوجود غير الجذعية مثل الخلايا في الثقافة.
  7. فصل الخلايا مع 1 مل يدتا التربسين لمدة 3 دقيقة في 37 درجة مئوية أو إلغاء بلطف. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 6 دقائق في 259 x ز.
  8. إزالة المادة طافية واختبار الخلايا لتحليل سيتوفلوريميتريك (الخطوة 6).

4-عابر PrPج سيلينسينج ب siRNA

  1. الثقافة هدبسكسين 6-جيدا لوحات (2 × 105 خلية/مل) مع 2 مل من الثقافة المتوسطة (الخطوة 2.5) ح 24.
  2. اليوم التالي، إعداد siRNA PrP المتوسطة (400 ميليلتر).
    1. إضافة إلى أنبوب اختبار عقيمة، 384 ميليلتر دميم-l.
    2. إضافة 1 ميليلتر لكل نوع من siRNA الحزب الثوري إلى دميم-L يكون تركيز نهائي من 5 نانومتر (siRNA 4 تستخدم الحزب الثوري والتحقق من قبل المورد لضمان نسبة % إيه سيفن زيرو كفاءة ضربة قاضية).
    3. إضافة 12 ميليلتر من ترانسفيكتيونريجينت إلى دميم-l.
    4. دوامة الخليط واحتضان لمدة 10 دقيقة على RT للسماح بتشكيل مجمعات تعداء.
  3. إضافة 400 ميكروليتر siRNA PrP متوسطة لكل عينة واحتضانها ح 6 عند 37 درجة مئوية.
  4. دون تجاهل siRNA PrP المتوسطة، إضافة 1.6 مل (نسبة 1 إلى 5) من الثقافة المتوسطة (الخطوة 2، 5).
  5. ترك الخلايا ح 72 في 37 درجة مئوية.
  6. إزالة المادة طافية ويغسل 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني في الرايت
  7. إضافة 2 مل من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة لمدة 7 أو 14 يوما (الخطوة 5، 1).
  8. تغيير المتوسطة ثقافة العصبية كل 3 أيام.
    ملاحظة: استبدال siRNA حل الحزب الثوري كل وقت استبدال المتوسطة ثقافة العصبية.
  9. في نهاية الوقت، يغسل 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني في الرايت واختبار الخلايا العصبية المستضدات السطحية بتحليل "لطخة الغربية".

5-الخلايا العصبية عملية الاستقراء من هدبسكس

  1. إعداد الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة (500 مل).
    1. إعداد مل 444.7 وسائط القاعدية للخلايا العصبية.
    2. للمتوسط إضافة 50 مل ملحق خالية من المصل يستخدم لدعم استمرارية على المدى الطويل للخلايا الجذعية العصبية الجنينية والكبار (10%).
    3. إضافة 200 ميليلتر من أساسية "تنتجها الخلايا الليفية عامل النمو" (بفجف) (تركيز النهائي 40 نانوغرام/ملليلتر) و 100 ميليلتر من عامل نمو البشرة (لو) إلى المتوسطة (التركيز النهائي 20 نانوغرام/ملليلتر).
    4. إضافة 5 مل من البنسلين/ستربتوميسين (1%) إلى المتوسط.
  2. هدبسكس الثقافة في لوحات 6-جيدا (2 × 105 خلية/مل) تصل إلى 28 يوما من فصل اللب وتحفيز لهم مع 2 مل من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة.
  3. كل 3 أيام تجاهل المادة طافية ويغسل 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني في الرايت واستبدال 2 مل المتوسطة ثقافة العصبية.
  4. وبعد أيام 7 و/أو 14، فصل الخلايا مع 1 مل يدتا التربسين لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية أو بلطف مكشطة.
  5. إضافة 4 مل (نسبة 1:5) للثقافة المتوسطة (الخطوة 2.5) لوقف عمل التربسين.
  6. اختبار وجود المستضدات السطحية العصبية (الخطوة 6) أو تعبير بروتين بريون (الخطوة 7) عن طريق تحليل التدفق الخلوي.

6-وصف هدبسكس "التدفق الخلوي"

  1. تحديد الوسيطة stromal (MSC)-المستضدات السطحية محددة أو الخلايا العصبية.
  2. الثقافة هدبسكس في لوحات 6-جيدا (2 × 105 خلية/مل) مع 2 مل من الثقافة المتوسطة (الخطوة 2، 5).
  3. فصل هدبسكس في 28 يوما من فصل لب الأسنان أو بعد 14 يوما من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة (الخطوة 5، 1) مع 1 مل يدتا التربسين لمدة 3 دقيقة في 37 درجة مئوية أو مكشطة بلطف.
  4. إضافة 4 مل (نسبة 1:5) للثقافة المتوسطة (الخطوة 2.5) لوقف عمل التربسين وسينتريفوجاتي في 259 x ز لمدة 6 دقائق في الرايت يغسل آخر مرة 2 مع 2 مل من برنامج تلفزيوني في الرايت
  5. فيكس هدبسكس غير المعالجة أو المعالجة مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  6. بيرميبيليزي هدبسكس مع الفاعل غير الأيونية 0.1% (v/v) في برنامج تلفزيوني عن 10 دقيقة إضافية في الرايت
  7. تنفيذ حظر مع الحليب المجفف الخالي 5% في 1 مل من برنامج تلفزيوني عن ح 1 في الرايت
  8. أغسل 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا مع مكافحة--CD105 (1: 100/5 × 10 الخلايا5 )، CD44 مكافحة (1: 100/5 × 10 الخلايا5 ) المضادة-قامت-1 (1: 100/5 × 105 خلايا)، مكافحة--CD90 (1: 100/5 × 10 الخلايا5 )، مكافحة--CD73 (1: 100/5 × 105 الخلايا)، مكافحة β3-Tubulin (1: 100/5 × 105 خلايا)، مكافحة--الشركة (1: 100/5 × 105 خلايا) ومكافحة GAP43 (1: 100/5 × 105 خلايا) ماب ح 1 في الرايت
  9. تغسل الخلايا 3 مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان مع الماوس المضادة PE (01:50/5 × 105 خلايا) أو CY5 أرنب المضادة الإنسان والمحيط الحيوي (01:50/5 × 105 خلايا) ح 1 إضافية في الرايت
  10. استخدام الأجسام المضادة الثانوية النابضة الخلايا إيمونوبوسيتيفي (PE الماوس المضادة أو أرنب المضادة CY5 ماب) وتحليل جميع العينات مع سيتوميتير تدفق والحصول على الأحداث على الأقل 20,000.

7-تقييم التعبير PrPج في هدبسكس بتحليل التدفق الخلوي

  1. الثقافة هدبسكسين 6-جيدا لوحات (2 × 105 خلية/مل) مع 2 مل من الثقافة المتوسطة (الخطوة 2، 5).
  2. فصل هدبسكس في 21 و 28 يوما من فصل لب الأسنان وبعد أيام 7 و/أو 14 مع الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة (الخطوة 5، 1) مع 1 مل من التربسين-يدتا ووقف عمل التربسين كما هو موضح في الخطوة 6، 4. إصلاح العينات مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  3. بيرميبيليزي مع سورفاكتانتين غير الأيونية 0.1% (v/v) برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في إزالة الرايت المادة طافية ووصمة عار الخلايا مع أرنب PrP مكافحة ماب EP1802Y (01:50/5 × 105 خلايا) ماب ح 1 في الرايت إينكوباتي مع أرنب المضادة CY5 (01:50/5 × 105 خلايا) للإنسان والمحيط الحيوي ل ح 1 إضافية في الرايت
  4. تحليل جميع العينات مع سيتوميتير تدفق وتكتسب الأحداث 20,000 على الأقل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إجراءات العزل والفصل هدبسكس من لب الأسنان، التي تم الحصول عليها من المولى الثالث، هي العمليات المعقدة التي يمكن أن تؤدي التغييرات الصغيرة نتيجة مدمرة. في هذه الورقة، ونحن استخدام البروتوكول لآرثر et al. 12 مع العديد من التحسينات. ويرد في الشكل 1مخطط تمثيلي للإجراءات.

هدبسكس يمثل عدد سكان غير متجانسة من الخلايا مع الحيوانات المستنسخة مميزة والاختلافات في القدرات التكا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل، وركزنا على منهجية للعزل والتفريق بين الخلايا العصبية هدبسكس؛ وعلاوة على ذلك، يمكننا تقييم دور الحزب الثوريج في هذه العملية. هناك عدة طرق لعزل والتفريق بين هدبسكس في الخلايا مثل الخلايا العصبية والخطوات الحاسمة خلال العملية. هدبسكس قادرين على التفريق في الأنساب عدة مثل الخلايا العصبية وخلايا الاوستيوبلاستس، تشوندروبلاستس و adipocytes. ونحن في ورقتنا، التحقيق في آليات التمييز بين الخلايا العصبية ووجود الحزب الثوريج. كما نوقش أعلاه، التعبير عن هذه الخلايا نموذجي mesenchymal stromal محددة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل أيده "مؤسسة بروني" ومحور جامعة رييتي "سابينا الجامعي" إلى ماتي فينتشنزو.

الشكل 5 (أ، ب) طبع بإذن الناشر تايلور وفرانسيس المحدودة من: "دور بريون" البروتين-EGFR مجمع مولتيموليكولار خلال تمايز الخلايا العصبية لطب الأسنان المستمدة من اللب الخلايا الجذعية البشرية. مارتيلوكسي، س.، Manganelli ف، جيم سانتاكروس، واو سانتيلي، لام بيكولي، م. سوريسي، وخامساً ماتيي بريون. 4 مارس عام 2018. تايلور وفرانسيس المحدودة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول الأمفوتريسين بسيجما ألدريتشA2942يتم استخدامه لتكملة وسائط زراعة الخلايا ، وهو مضاد حيوي مضاد للفطريات من Streptomyce
Anti-B3tubulinCell Signaling Technology   ؛# 4466واحد من ستة أشكال إسوية B-tubulin ، يتم التعبير عنه بشكل كبير أثناء نمو الجنين وما بعد الولادة ، ويبقى مرتفعا في الجهاز العصبي المحيطي
Anti-CD105   ؛BD Biosciences611314Endoglin (CD105) ، وهو بروتين سكري رئيسي لبطانة الأوعية الدموية البشرية ، هو بروتين غشائي متكامل من النوع الأول مع منطقة كبيرة خارج الخلية ، ومنطقة غشاء كارهة للماء ، وذيل سيتوبلازم قصير
Anti-CD44MilliporeCBL154-20ulالأجسام المضادة لعلامات الخلايا الإيجابية الموجهة ضد الخلايا الجذعية الوسيطة
Anti-CD73   ؛تكنولوجيا إشارات الخلية 13160CD73 عبارة عن 70 كيلو دالتون جليكوزيل فوسفاتيديلينوزيتول مرتبط بالغشاء بروتين سكري مرتبط بالغشاء يحفز التحلل المائي لأحادي فوسفات النيوكليوزيد خارج الخلية إلى نيوكليوسيدات نشطة بيولوجيا
Anti-CD90MilliporeCBL415-20ulالأجسام المضادة لعلامات الخلايا الإيجابية الموجهة ضد الخلايا الجذعية الوسيطة
Anti-GAP43   ؛تكنولوجيا إشارات الخلية # 8945هو بروتين خاص بالجهاز العصبي مرتبط بالنمو في مخاريط النمو ومناطق اللدونة العالية
المضادة للفأر PE & nbsp ؛Abcamab7003هو جسم مضاد يستخدم في قياس التدفق الخلوي أو تحليل FACS
المضاد ل NFH & nbsp ؛تكنولوجيا إشارات الخلية # 2836هو جسم مضاد يكتشف المستويات الذاتية لبروتين الخيوط العصبية الكلية
المضاد للprP mAb EP1802Y Abcamab52604أرنب أحادي النسيلة [EP 1802Y] إلى بروتين Prion PrP
المضاد للأرانب CY5 & nbsp ؛Abcamab6564هو جسم مضاد يستخدم في قياس التدفق الخلوي أو تحليل FACS
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulالأجسام المضادة لعلامات الخلايا الإيجابية الموجهة ضد الخلايا الجذعية الوسيطة
B27 Supp XF CTSGibco بواسطة Life TechnologiesA14867-01B-27   ؛ يمكن استخدامها لدعم تحريض الخلايا الجذعية العصبية البشرية (hNSCs) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) ، وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية متعددة القدرات (PSCs) ، تمايز hNSCs ، والحفاظ على الخلايا العصبية المتمايزة الناضجة في ثقافة
BD Accuri C6 مقياس التدفق الخلوي   ؛BiosciencesAC6531180187مقياس التدفق الخلوي مزود بليزر أزرق (488 نانومتر) وليزر أحمر (640 نانومتر) BD
Accuri C6 Software BD Biosciencesفي نظام مقياس التدفق الخلوي BD Accuri C6 من أجل الحصول على البيانات وتوليد الإحصائيات وتحليل النتائج
bFGFPeproThec ، DBA100-18Bعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية   ؛
جهاز طرد مركزي CL30RTermo fisher Scientific11210908إنه جهاز يستخدم لفصل السوائل أو الغاز أو السائل ، بناء على كثافة
CO2 حاضنة 3541Termo fisher Scientific317527-185يضمن ظروف النمو المثلى والقابلة للتكرار لثقافات الخلايا
كولاجيناز ، النوع الرابع & nbsp ؛Life Technologies17104019Collagenase هو بروتياز يشق الرابطة بين حمض أميني محايد (X) والجلايسين في تسلسل Pro-X-Glyc-Pro ، والذي يوجد بتردد عال في الكولاجين
مشرط يمكن التخلص منه   ؛Swann-Morton501يتم استخدامه لقطع الأنسجة
DMEM-LEurocloneECM0060LDulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose مع L-Glutamine مع Sodium Pyruvate
EGFPeproThec ، DBAAF-100-15عامل نمو البشرة   ؛
مصل الأبقار الجنينيجيبكو من Life Technologies10270-106FBS هو مكمل إعلامي شائع لأنه يوفر مجموعة واسعة من الوظائف في زراعة الخلايا. يوفر FBS العناصر الغذائية وعوامل النمو والتعلق ويحمي الخلايا من التلف التأكسدي وموت الخلايا المبرمج من خلال آليات يصعب إعادة إنتاجها في أنظمة الوسائط الخالية من المصل (SFM)
Filtropur BT50 0.2,500 مل فلتر علوي للزجاجةSarstedt831,823,101إنه جهاز يستخدم لترشيح المحاليل
Flexitube GeneSolution ل PRNPQiagenGS56214 siRNAs لجين Entrez 5621. التسلسل المستهدف N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  حل CAGTGACTATGAGGACCGTTA
هانك 1xGibco بواسطة تقنيات الحياة240200083الوظيفة الأساسية لهانكس & برايم; محلول الملح المتوازن هو الحفاظ على درجة الحموضة وكذلك التوازن الاسموزي. كما أنه يوفر الماء والأيونات غير العضوية الأساسية للخلايا
كاشف التعداء HiPerFect   ؛كاشف التعداء Qiagen301705HiPerFect هو مزيج فريد من الدهون الموجبة والمحايدة التي تمكن من امتصاص الحمض النووي الريبي الفعال والإفراج الفعال عن siRNA داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى ضربة قاضية عالية للجينات حتى عند استخدام تركيزات منخفضة من siRNA
Neurobasal A & nbsp ؛Gibco by life technologies10888022Neurobasal-A Medium هو وسيط قاعدي مصمم للصيانة والنضج على المدى الطويل للخلايا العصبية الدماغية النقية بعد الولادة والبالغين.
بارافورمالدهايدسيجما-ألدريتش30525-89-4استخدام بارافورمالدهيد لتثبيت الخلايا وأقسام الأنسجة أثناء إجراءات تلطيخ
البنسلين / الستربتومايسين   ؛EurocloneECB3001D يتم استخدامه لتكملة وسائط زراعة الخلايا للسيطرة على التلوث البكتيري
محلول ملحي مخزن بالفوسفات   (برنامج تلفزيوني)EurocloneECB4004LX10 PBS هو محلول ملحي متوازن يستخدم للتعامل مع خلايا الثدييات واستزراعها. يستخدم PBS لري خلايا الثدييات وغسلها وتخفيفها. يحافظ التخزين المؤقت للفوسفات على الرقم الهيدروجيني في النطاق الفسيولوجي
TC-Platte 6 جيدا ، الخلية + ، FSarstedt833،920،300إنه سطح نمو للخلايا الملتصقة
قارورة ثقافة الأنسجة T-25 ، الخلية + ، غطاء التهويةSarstedt833،910،302قارورة زراعة الأنسجة T-25 ، البوليسترين ، سطح نمو الخلية + للخلايا الملتصقة الحساسة ، على سبيل المثال الخلايا الأولية ، الرقبة المعلقة ، غطاء التهوية ، الأصفر ، المعقم ، الخالي من البيروجين ، غير السام للخلايا ، 10 قطع / كيس
Triton X-100   ؛Sigma-Aldrich9002-93-1خافض للتوتر السطحي غير أيوني يستخدم على نطاق واسع لاستعادة مكونات الغشاء في ظل ظروف خفيفة غير متغيرة
الطبيعة Trypsin-EDTA EurocloneECB3052D سوف يشق التربسين الببتيدات على الجانب الطرفي C من بقايا اللايسين والأرجينين الأحماض الأمينية. يستخدم التربسين لإزالة الخلايا الملتصقة من سطح الثقافة
أنبوبSarstedt62،554،502أنبوب 15 مل ، 120 مم × 17 مم ، PP
VBH 36 C2 CompactSterilST-003009000يوفر حماية كاملة للبيئة والعامل
ZEISS Axio Vert.A1 & ndash ؛ مقلوب  يوفر مجهرZeiss3849000962ZEISS Axio Vert.A1 سعرا فريدا للمبتدئين ويمكن أن يوفر جميع تقنيات التباين ، بما في ذلك المجال الساطع ، وتباين الطور ، و PlasDIC ، و VAREL ، وتباين تعديل هوفمان المحسن (iHMC) ، و DIC ، والفلورة. قم بدمج إضاءة LED للتصوير اللطيف للخلايا ذات العلامات الفلورية. تم تصميم Axio Vert.A1 هندسيا للعمل الروتيني ومدمج بما يكفي للجلوس داخل شفاطات زراعة الأنسجة.
BD تتحكم تم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
  2. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
  4. Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
  5. Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
  6. Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
  7. Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).
  8. Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).
  9. Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
  10. Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
  11. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
  12. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
  13. Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
  14. Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
  15. Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34(2017).
  16. Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
  17. Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).
  18. Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
  19. Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
  20. Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571(2017).
  21. Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
  22. Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
  23. Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
  24. Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
  25. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
  26. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
  27. Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IV psin EDTA siRNA

مقالات ذات صلة