نقدم إجراء طرد محلي محسّن باستخدام ماصة زجاجية صغيرة وطريقة تصوير سريعة من اثنين من الفوتونات، والتي تسمح بقياس دقيق للتغيرات في القطر الشعري والتحقيق في تنظيمه في ثلاثة أبعاد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في فيفو ثلاثي الأبعاد اثنين فوتون المجهري لدراسة الاستجابات الوعائية التي أجريت من قبل طرد ATP المحلية باستخدام الزجاج الماصة الصغيرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الحفاظ على وظيفة الدماغ العادية يتطلب إمدادات كافية وفعالة من الأكسجين والتغذية من قبل شبكة معقدة من السفن. ومع ذلك، فإن تنظيم تدفق الدم الدماغي (CBF) غير مفهوم بشكل كامل، وخاصة على المستوى الشعري. اثنين من الفوتون المجهري هو أداة قوية تستخدم على نطاق واسع لدراسة CBF وتنظيمها. حاليا، هذا المجال محدود بسبب عدم وجود دراسات في الجسم الحي باثنين من الفوتون المجهري دراسة (1) استجابات CBF في ثلاثة أبعاد، (2) الاستجابات الوعائية، (3) التدخلات المحلية داخل شبكة الأوعية الدموية. هنا، ونحن نصف 3D في طريقة الجسم الحي باستخدام مجهرية اثنين فوتون لدراسة الاستجابات الوعائية التي أجريت الناجمة عن طرد المحلية من ATP مع الزجاج الماصة الدقيقة. تستخدم طريقتنا التصوير السريع والمتكرر باثنين من الفوتونات لتوفير قياسات دقيقة للقطر من خلال الإسقاط الكثافة القصوى للصور التي تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، فإننا نظهر أن هذه الطريقة يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة استجابات الكالسيوم الفلكية 3D. كما نناقش مزايا وقيود إدراج الماصة الصغيرة الزجاجية والتصوير باثنين من الفوتونات هايبرستاك.
المقدمة
الدماغ لديه معدل استهلاك الطاقة عالية. حوالي 20٪ من الأكسجين و 25٪ من الجلوكوز المستهلكة من قبل جسم الإنسان مكرسة لوظيفة الدماغ، في حين أن الدماغ لا يحتل سوى 2٪ من كتلة الجسم الإجمالية. الحفاظ على وظيفة الدماغ الطبيعية يتطلب إمدادات كافية وفعالة من الأكسجين والتغذية عن طريق تدفق الدم في شبكة معقدة من الأوعية. يتم الجمع بين نشاط الدماغ المحلي وتدفق الدم الدماغي (CBF) بقوة، اعتمادا على الخصائص الوظيفية للخلايا العصبية، الخلايا النجمية، pericytes، خلايا العضلات الملساء (SMCs) والخلايا البطانية (ECs)1. في الآونة الأخيرة، ظهرت أول عدد قليل من أوامر الشعيراتالدموية المتفرعة من الأرتيريولس اختراق ك 'نقطة ساخنة' 2، مما يدل على ت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وافقت اللجنة الوطنية الدانمركية للأخلاقيات على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وفقاً للمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في اتفاقية المجلس الأوروبي لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة في الأغراض التجريبية وغيرها من الأغراض العلمية. كانت متوافقة مع المبادئ التوجيهية للوصول. هذا هو إجراء المحطة الطرفية مع الفئران يجري القتل الرحيم قبل الانتعاش مخدر.
1. التحضير قبل الجراحة
- تنظيف الجدول الجراحي وجميع المناطق المحيطة بها مع الإيثانول 70٪. تنظيف وتجفيف الأدوات الجراحية قبل الجراحة.
- التخدير ماوس NG2DsRed (Tg (Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J؛ كلا الجنسين؛ 4-8 أشهر من العمر) عن طريق حقن الكيتامين الكليوم + xyla....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وبمجرد الانتهاء من الجراحة، تم نقل الفئران إلى المجهر اثنين من الفوتون (الشكل1A). وأدخلت ماصة زجاجية صغيرة تحتوي على 1 mM ATP على مقربة من الأوعية الدموية الوجهة في الموقع المستهدف (الشكل1باء).
قمنا بإجراء التصوير hyperstack في حين إعطاء نفخة من ATP 1 mM (الشكل 2A، فيديو تكميلي 1). تم تسوية كل كومة صورة إلى صورة واحدة عن طريق الإسقاط كثاف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أحد التحديات التي يواجهها دراسات الأوعية الدموية هو القياس الدقيق لأقطار الأوعية الدموية. الطريقة التي نصفها هنا تستخدم هدف بيزو الآلية لجعل التصوير hyperstack سريعة ومتكررة عن طريق التصوير المجهري اثنين فوتون. أولا، يسمح هذا الأسلوب الفحوصات المتكررة للأرتيريول اختراق، 1st النظام و2 الشعيرات الدموية من أجلالثاني دون فقدان التركيز وأدى إلى اكتشاف استجابات الأوعية الدموية التي أجريت ببطء في الشعيرات الدموية في الجسم الحي. ثانيا، في تركيبة مع تقنية حقن ناقلات الفيروسية، فإنه يمكننا من التحقيق في استجا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد حظيت هذه الدراسة بدعم مؤسسة لوندبيك، ومؤسسة نوفو نورديسك، والمجلس الدانمركي للبحوث المستقلة | العلوم الطبية، ومنحة مؤسسة NORDEA لمركز الشيخوخة الصحية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma– Aldrich | A6138 | يوضع على القشرة المكشوفة للحماية |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | مركب نفخ البقع إلى اللون الفلوري الأحمر |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | موسع للأوعية الدموية ومضيق الأوعية ، مركب النفخ |
| الغراء Cyanoacrylate والمنشط | Loctite | Adhesives و SF7452 | الغراء للقطعة المعدنية والغطاء الزجاجي |
| العين زيوت التشحيم | Neutral Ophtha ، Ophtha A / S ، الدنمارك | حافظ على ترطيب عيون الفأر | |
| FITC-dextern | Sigma-Aldrich | FD500S | صبغة مصل الدم ، لون الفلورسنت الأخضر |
| NG2Dsالفئران الحمراء | مختبر جاكسون | 8241 | تعبر هذه الفئران المعدلة وراثيا عن متغير بروتين فلوري أحمر (DsRed) تحت سيطرة مروج الفأر NG2 (Cspg4) |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | ناقلات فيروسية خاصة بالخلايا النجمية تحمل مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا |
| TRITC-dextaren | Sigma-Aldrich | 52194 | صبغة مصل الدم ، لون الفلورسنت |
| الأحمر <قوي> قائمة المعدات < / قوية > | |||
| مضخة الهواء | WPI | PV830 | إعطاء ضغط الهواء لنفخ الماصة |
| محلل غاز الدم | مقياس الإشعاع | ABL 700 | قياس مستويات غازات الدم |
| جهاز مراقبة ضغط الدم | World Precision Instruments | BP-1 | مراقب ضغط الدم السطحي |
| جهاز التحكم في درجة حرارة الجسم | CWE | موديل TC-1000 | حافظ على درجة حرارة جسم الماوس في النطاق الفسيولوجي |
| Capnograph | Harvard | Device Type 340 | راقب ثاني أكسيد الكربون <ذو الزفير النهائي >2< / sub > من الماوس |
| المحفز الكهربائي | A.M.P.I. | ISO-flex | تطبيق تحفيز وسادة الشعيرات |
| جهاز التنفس | هارفارد جهاز | D-79232 | تهوية الماوس ميكانيكيا في النطاق الفسيولوجي |
| مجتذب الماصات | الدقيقة أداة Sutter Instrument | P-97 | |
| مجهر ثنائي الفوتون | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| strong > قائمة الأدوات الجراحية < / قوي> | |||
| الملقط التشريحي | Lawton | 09-0007 | |
| ملاقط بزاوية ومتوازنة | S & T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| مقص القزحية | لوتون | 05-1450 | |
| مشبك الأوعية الدموية الدقيقة | S & T AG | 462 | |
| قسطرة الأوعية الدموية للفأر | Verutech | 100828 |
المراجع
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
