مقالة منهجية

تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا

DOI:

10.3791/59321

⸱

مايو 1, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology Charles Darwin, Sapienza University of Rome, Italy, 2Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, Italy, 3Laboratory of Stem Cell biology and Molecular Embryology, The Rockefeller University, USA, 4Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح هذا البروتوكول بالتحويل السريع والفعال للخلايا الجذعية مستحث المستحثة إلى الخلايا العصبية الحركية ذات الهوية الشوكية أو الجمجمة ، عن طريق التعبير البعيد عن عوامل النسخ من ناقلات الحمل المحبله.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نقدم هنا وصفا لطريقه للحصول علي الخلايا العصبية الحركية العمود الفقري والجمجمة الوظيفية من المستحث البشرية المستحثة (iPSCs). يتم الحصول علي التحويل المباشر إلى الخلايا العصبية الحركية عن طريق التعبير عن الوحدات البديلة لعوامل النسخ ، وهي Ngn2 ، Isl1 و Lhx3 (NIL) أو Ngn2 ، Isl1 و Phox2a (خطه البرامج الخاصة). وتحدد هذه الخطة ، علي التوالي ، هويه الخلايا العصبية للمحركات الشوكية والجمجمة. يبدا البروتوكول الخاص بنا بإنشاء خطوط iPSC المعدلة التي يتم فيها دمج الصفر أو النعناع البشري بشكل ثابت في الجينوم عن طريق ناقل ترانسباك. ثم يتم الحث علي التعبير عن الجينات عبر الدوكسيسيكلين ويؤدي ، في 5 أيام ، إلى تحويل iPSCs إلى المبتدئين MN. النضج اللاحق ، لمده 7 أيام ، يؤدي إلى السكان متجانسة من MNs الشوكي أو القحفيه. طريقتنا يحمل العديد من المزايا علي البروتوكولات السابقة: انها سريعة للغاية ومبسطه. انها لا تتطلب العدوى الفيروسية أو مزيد من العزلة MN; فانه يسمح توليد مختلف السكان الفرعيين MN (العمود الفقري والجمجمة) مع درجه ملحوظة من النضج ، كما يتضح من القدرة علي إطلاق النار القطارات من إمكانات العمل. وعلاوة علي ذلك ، يمكن الحصول علي عدد كبير من الخلايا العصبية الحركية دون تنقيه من السكان المختلطة. ويمكن استخدام الخلايا العصبية المستمدة من iPSC العمود الفقري والجمجمة الحركية في النمذجة في المختبر من التصلب الجانبي الضموري والامراض العصبية الأخرى من الخلايا العصبية الحركية. وقد تمثل الخلايا العصبية الحركية المتجانسة موردا هاما لفحوصات المخدرات الخاصة بنوع الخلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العصبية الحركية (MN) انحطاط يلعب دورا مسببا في الامراض البشرية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) وضمور العضلات الشوكي (SMA). ويعد إنشاء نظم نموذجيه للخلايا المختبرية المناسبة تلخص تعقيدات المليون البشري خطوه هامه نحو وضع نهج علاجيه جديده. الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (ipscs) ، والتي هبت مع خصائص تمايز التعددية الرائعة ، قد تم اشتقاقها الآن من عدد من المرضي المصابين بامراض الخلايا العصبية الحركية1،2. وقد تم توليد خطوط iPSC اضافيه تحمل طفرات المسببة للامراض المرتبطة بامراض MN عن طريق تحرير الجينات ، بدءا من السيطرة "صحية" مستحث الخلايا الجذعية3. وتمثل هذه الخطوط أدوات مفيده لنمذجة الامراض في المختبر وفحص المخدرات ، شريطه توافر الأساليب المناسبة لتمايز iPSC في MNs. والأساس المنطقي وراء تطوير هذه الطريقة هو تزويد المجتمع العلمي المهتم بامراض MN ببروتوكول تفاضلي سريع وفعال يؤدي إلى MNs وظيفية ناضجه. الميزة الاولي لهذا الأسلوب هو الإطار الزمني للتنفيذ. نقطه أخرى ذات صله من قوه ياتي من القضاء علي اي خطوه تنقيه. وأخيرا ، يمكن استخدام البروتوكول لتوليد اثنين من السكان متميزة من الخلايا العصبية الحركية.

امكانيه توليد أنواع فرعيه مختلفه من MNs هي ذات الصلة بشكل خاص لنمذجة امراض MN. ليس كل الأنواع الفرعية MN عرضه بنفس القدر في ALS و SMA وظهور الاعراض في وحدات المحركات المختلفة يؤثر بشكل كبير علي التكهن. في ALS, بداية العمود الفقري مع اعراض بدءا من الأطراف العلوية والسفلية يؤدي إلى الموت في حوالي 3-5 سنوات4. علي العكس من ذلك ، بداية بولبار ، بدءا من انحطاط MNs القحفيه ، لديه اسوا تكهن. وعلاوة علي ذلك ، فان النسبة المئوية لبداية بولبار اعلي بكثير في المرضي الذين يعانون من طفرات في البروتينات الريبية النيبالية ملزمه TDP-43 من الافراد الذين يعانون من طفرات SOD15. يعتمد تقريبا مجموع بروتوكولات التمايز MN البديلة علي نشاط حمض الريتينويك (RA) ، الذي يضفي علي الحرف الفقري التفريق بين ipscs6،7،8. وهذا يحد من امكانيه دراسة العوامل الجوهرية ، التي يمكن ان تكون وقائية في الأنواع الفرعية المحددة من الملايين9،10.

وتمشيا مع العمل السابق في الخلايا الجذعية الجنينية الفئران11, وقد أظهرنا مؤخرا ان في الإنسان ipscs التعبير عن Ngn2, Isl1 و LHX3 (NIL) يدفع هويه العمود الفقري MN, في حين ان Ngn2 و Isl1 زائد Phox2a (الخطة الخاصة) تحديد الجمجمة MNs12. التالي قمنا بتطوير بروتوكول فعال ، مما يؤدي إلى إنتاج MNs البشرية التي وهبها خصائص وظيفية في تحول 12 يوما. والغرض من هذه الطريقة هو الحصول ، في اطار زمني قصير ودون الحاجة إلى تنقيه (علي سبيل المثال ، من قبل FACS) ، والسكان الخلايا المخصبة للغاية ل MNs مع العمود الفقري أو الجمجمة الهوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. صيانة iPSCs البشرية

  1. اعداد لوحات مصفوفة مغلفه
    1. ذوبان واحد 5 مل قارورة من مصفوفة (انظر جدول المواد) في 4 °c بين عشيه وضحيها. المخزونات الاصليه مصفوفة تاتي في تركيزات الأسهم المختلفة ويتم اجراء الارصفه وفقا لعامل التخفيف المشار اليه في ورقه البيانات ، محدده للكثير الفردية. من المهم الحفاظ علي القارورة والأنابيب الباردة الجليد لمنع البيع المبكر للمصفوفة. الاستغناء عن مصفوفة في الارصفه في البرد قبل المبردة علي الجليد. تجميد الارصفه غير المستخدمة عند-20 درجه مئوية.
    2. ضعي واحده علي الثلج لمده 2 ساعة لأذابه الجليد.
    3. تمييع قسامه من مصفوفة مع 20 مل من dmem الباردة/F12 في أنبوب مخروطي 50 ml.
    4. تخلط جيدا والاستغناء 1 مل من مصفوفة المخفف في اطباق 35 مم (تعادل المبالغ لكل مساحة السطح من الاطباق الأخرى).
    5. حافظ علي الاطباق التي تحتوي علي مصفوفة مخففه لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة للسماح بالطلاء.
      ملاحظه: الاطباق ، مختومه مع parafilm ، يمكن تخزينها في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 2 أسابيع.
  2. اعداد حل الأسهم (20 مل) و 1x العمل القسامات من كاشف التفكك الخلية لطيف (انظر جدول المواد).
    1. تذوب مسحوق إلى 10 ملغ/مل في الخدمات التلفزيونية (Ca2 +/mg2 + مجانا).
    2. تصفيه تعقيم من خلال غشاء فلتر 0.22 μm.
    3. اعداد 20 الارصفه (1 مل لكل منهما) وتخزين في-20 درجه مئوية.
    4. قبل الاستخدام ، تمييع قسامه واحده في الخدمات التلفزيونية (Ca2 +/mg2 + مجانا) إلى 1 ملغ/مل (1x العمل قسامه).
      ملاحظه: يمكن تخزين 1x العمل القسامات في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 2 أسابيع.
  3. المرور iPSCs الإنسان.
    1. قبل البدء: إذا تم تخزينها في 4 درجه مئوية ، قبل الحارة مصفوفة المغلفة لوحات في الحاضنة في 37 درجه مئوية لمده 20-30 دقيقه. قبل الحارة في درجه حرارة الغرفة مقدار iPSC الإنسان المتوسطة (انظر جدول المواد) اللازمة. قبل الحارة DMEM/F12.
    2. شفط الثقافة المتوسطة.
    3. شطف iPSCs مع تلفزيوني (Ca2 +/Mg2 + مجانا).
    4. أضافه 1x حل التفكك لطيف (0.5 mL لطبق 35 مم). احتضان في 37 درجه مئوية حتى حواف المستعمرات تبدا في فصل من لوحه ، وعاده ما 3-5 دقيقه.
    5. يستنشق حل التفكك لطيف ، والحرص علي عدم فصل مستعمرات iPSC.
    6. غسل الخلايا مع DMEM/F12 (2 مل لطبق 35 مم) ويستنشق الحرص علي عدم فصل الخلايا. كرر هذه الخطوة مره أخرى.
    7. أضافه الإنسان iPSC المتوسطة (1 مل لصحن 35 mm).
    8. فصل بلطف المستعمرات قباله مع رافع الخلية ونقل إلى أنبوب 15 مل.
    9. كسر كتل الخلايا بلطف عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا مع P1000 pipettor 3-4 مرات.
    10. يستنشق ماده طافي من لوحه (ق) مصفوفة المغلفة.
    11. بذره الخلايا في المناسبة ثقافة حجم من [أبسك] انسانيه متوسطه. يمكن ان تختلف نسبه تقسيم من خط إلى خط وحوالي 1:4-1:8. تغيير المتوسطة يوميا.

2-توليد خطوط iPSC المحفزة لنيل الصفر والنعناع الخاص

  1. الخلية الناقلة.
    1. شطف الخلايا مع الخدمات التلفزيونية (Ca2 +/Mg2 + مجانا).
    2. أضافه كاشف التفكك الخلية (انظر جدول المواد) (0.35 mL لطبق 35 مم) واحتضان في 37 درجه مئوية حتى يتم فصل الخلايا المفردة (5-10 دقيقه).
    3. بلطف إكمال فصل الخلايا عن طريق التعبئة صعودا وهبوطا مع P1000 pipettor 3-4 مرات.
    4. جمع في أنبوب 15 مل وأضافه تلفزيوني (Ca2 +/Mg2 + مجانا) إلى 10 مل. عد الخلايا.
    5. بيليه 106 خلايا وأعاده التعليق في 100 ميكرولتر من R العازلة (المدرجة في الخلية الكهربائية عده ، انظر جدول المواد).
    6. أضافه الحمض النووي البلازميد للتنميل: 4.5 ميكروغرام من ناقلات ترانسسيابل (epb-bsd-tt-النيل أو epb-bsd-tt-الخطة الخاصة12) و 0.5 ميكروغرام من الحشرات ترانسميد البلازما13.
    7. Transfect مع نظام الكهرباء الخلية (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وكما هو موضح سابقا3 مع المعلمات التالية: 1,200 V الجهد ، 30 مللي عرض ، 1 نبض. بذره الخلايا في الإنسان iPSC المتوسطة تستكمل مع 10 μM Y-27632 (المانع روك ، انظر جدول المواد) في طبق المغلفة مصفوفة 6 مم.
  2. اختيار مع المضادات الحيوية.
    1. بعد يومين من التحويل ، أضف 5 ميكروغرام/مل من بلاستيديبين إلى الوسط الثقافي.
    2. معظم الخلايا غير المتحولة سوف يموت في غضون 48 h من الاختيار بلتكيدبين. الحفاظ علي الخلايا في بلاستيديبين لمده لا تقل عن 7-10 يوما لمكافحه-تحديد الخلايا التي لم تدمج الجينات المتحولة في الجينوم.
    3. الحفاظ علي الخلايا المقسمة بشكل ثابت كمجموعه سكانية مختلطة ، تتكون من خلايا ذات عدد مختلف من الجينات المتحولة ومواقع التكامل المختلفة ، أو تعزل المستنسخات المفردة.
    4. اعداد طبق إضافي للتحقق من التعبير الفعال عن الجينات ، علي 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين التعريفي ، بواسطة RT-PCR مع الإشعال الخاصة transgenes لNgn2 (إلى الامام: TATGCACCTCACCTCCCCATAG ؛ العكس: GAAGGGAGGAGGGCTACT) ، كما هو موضح سابقا12.
    5. في هذه المرحلة ، تجميد المخزون من الرواية الصفرية وخطوط النعناع الكتروني في تجميد المتوسطة لل Ipsc البشرية (انظر جدول المواد).

3. الحركية العصبية التمايز

  1. انفصال الخلايا مع كاشف تفكك الخلية كما هو موضح (الخطوات 2-1-1.-2-1-3.). جمع الخلايا المنفصلة في أنبوب 15 مل وتمييع مع 5 مجلدات من DMEM/F12. بيليه الخلايا وأعاده التعليق في الإنسان iPSC المتوسطة تستكمل مع مثبطات الصخور 10 μM. عد الخلايا والبذور علي الاطباق المغلفة مصفوفة في كثافة 62,500 الخلايا/سم2.
  2. في اليوم التالي, استبدال المتوسطة مع DMEM/F12, تكمله 1x مستقره L-الجلوتامين التناظرية, 1x الأحماض الامينيه غير الاساسيه (NEAA) الملحق ثقافة الخلية و 0.5 x البنسلين/ستربتومايسين, وتحتوي علي 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين. هذا اعتبرت بما ان يوم 0 من تمييز. في اليوم 1 ، وتحديث المتوسطة ودوكسيسيكلين.
  3. في اليوم 2 ، تغيير المتوسطة إلى Neurobasal/B27 المتوسطة (المتوسطة العصبية تستكمل مع 1x B27 ، 1x مستقره L-الجلوتامين التناظرية ، 1x NEAA و 0.5 x البنسلين/ستربتومايسين) ، التي تحتوي علي 5 μM DAPT ، 4 μM SU5402 و 1 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين (انظر جدول المواد ). تحديث المتوسطة ودوكسيسيكلين كل يوم حتى اليوم 5.
  4. اليوم الخامس: تفكك الخلايا مع كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد).
    1. شطف الخلايا مع الخدمات التلفزيونية (Ca2 +/Mg2 + مجانا).
    2. أضافه كاشف التفكك الخلية (0.35 mL لطبق 35 مم) واحتضان في 37 درجه مئوية حتى يفصل الخلية بأكملها أحاديه الطبقة من الطبق. لاحظ انه لن يتم فصل الخلايا المفردة اثناء الحضانة.
    3. أضافه 1 مل من DMEM/F12 وجمع الخلايا في أنبوب 15 مل.
    4. بلطف إكمال فصل الخلايا عن طريق التعبئة صعودا وهبوطا مع P1000 pipettor 10-15 مرات.
    5. أضف 4 مل من DMEM/F12 وعد الخلايا.
    6. في هذه المرحلة ، وتجميد الحركية العصبية المولدات في خليه تجميد المتوسطة (انظر جدول المواد) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    7. بيليه الخلايا وأعاده التعليق في المتوسطة العصبية (Neurobasal/B27 المتوسطة تستكمل مع 20 نانوغرام/مل BDNF ، 10 نانوغرام/مل GDNF و 200 ng/mL حمض L-الاسكوربيك ، انظر جدول الموادs) تستكمل مع مثبطات الصخور 10 μM.
    8. بذره الخلايا علي [بولي-اورنيثين]/laminin-أو بدلا من ذلك علي [ماتريكس-كتد] دعامات في الكثافة من 100,000 خلايا/سم2. استخدام μ الشرائح البلاستيكية يدعم مع كوفيرسليب البوليمر (انظر جدول المواد) للتحليل المناعي.
  5. في اليوم 6 ، تغيير المتوسطة مع الخلايا العصبية الطازجة المتوسطة خاليه من المثبط روك. في الأيام التالية ، وتحديث نصف المتوسطة كل 3 أيام. ثقافة متوسطه ينبغي كنت غيرت بعناية جدا [أين وردر تو] منعت مفرزه من السطح.

4. تحليل المناعة

  1. تثبيت الخلية. شطف الخلايا مع تلفزيوني (مع Ca2 +/Mg2 +) واحتضان لمده 15 دقيقه في 4 ٪ بارافورمالدهيد في الخدمات التلفزيونية العامة (مع Ca2 +/Mg2 +) في درجه حرارة الغرفة.
    تحذير: بارافورمالدهيد هو السامة ويشتبه في ان يسبب السرطان. تجنب ملامسه الجلد والعينين والتعامل تحت غطاء الدخان الكيميائي.
  2. بيركابايز مع تلفزيوني (مع Ca2 +/Mg2 +) التي تحتوي علي 0.1 ٪ تريتون X-100 لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
  3. احتضان لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة في حل حظر الأجسام المضادة (ABS: 3 ٪ جيش الصرب البوسنيين في الخدمات التلفزيونية مع Ca2 +/Mg2 +).
  4. احتضان لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الاوليه في ABS: المضادة لTUJ1 (1:1000 ، الأرنب) والمضادة لOct4 (1:200 ؛ الماوس) أو المضادة للدردشة (المضادة للالكولين اسيتيل ؛ 1:150 ؛ الماعز). انظر جدول المواد.
  5. احتضان لمده 45 دقيقه في درجه حرارة الغرفة مع المناسبة الحمار الجسم المضادات الثانوية الزوج في ABS: مكافحه الماوس اليكسا فلور 647 (1:250) ، المضادة لأرنب اليكسا فلور 594 (1:250) ومكافحه الماعز اليكسا فلور 488 (1:250). انظر جدول المواد.
  6. احتضان في 0.4 ميكروغرام/مل DAPI لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة لتسميه نوى.
  7. جبل الخلايا مع تصاعد المتوسطة (انظر جدول المواد) للتصوير في المجهر مضان.

5. توصيف وظيفية عن طريق التصحيح-تسجيلات المشبك

  1. اعداد الحل الخارجي معايرتها (NES) علي النحو التالي: 140 mM كلوريد الصوديوم ، 2.8 mM KCl ، 2 مم CaCl2، 2 مم mgcl2، 10 ملم hepes ، و 10 ملم الجلوكوز. تعيين الاسموليه بين 290-300 mω. ضبط درجه الحموضة إلى 7.3 باستخدام 1N NaOH وتخزين الحل في 4 ° c.
  2. اعداد الحل الداخلي: 140 mM K-غلوكونات ، 2 مم كلوريد الصوديوم ، 5 مم بابتا ، 2 مم MgCl2، 10 مم hepes ، 2 مم MG-ATP ، 0.3 mm NA-gtp. ضبط درجه الحموضة إلى 7.3 مع 1m كوة وتحقق من ان يتم تعيين الاسموليه في حوالي 290 mω. تجميد الحل في-20 درجه مئوية في الارصفه الصغيرة.
  3. قبل تشغيل التجارب ، قبل الحارة حل NES في حمام مائي إلى حوالي 28-30 درجه مئوية.
  4. سحب بعض الأنابيب المجهرية البورسيليكات (ID 0.86 mm; OD 1.5 mm) تحمل المقاومة غيض: 5-6 MΩ وملء مع محلول داخل الخلايا قبل المتصاعدة في حامل ماصه.
    ملاحظه: تذكر لأسلاك الفضة كلوريد من القطب الكهربائي والمرجعي التسجيل في التبييض لمده لا تقل عن 30 دقيقه من أجل تشكيل طبقه موحده من AgCl علي سطح السلك.
  5. نقل طبق بيتري في غرفه التسجيل والسماح للغرفة مع حل NES في 1-2 mL/min. السماح للتدفق يمر عبر سخان مضمنه تعيين في درجه حرارة 30 درجه مئوية من أجل الحفاظ علي الحل الدافئة.
  6. مكان غرفه تسجيل إلكتروفيزيولوجي تحت المجهر تستقيم. سجل تيارات الغشاء مع مكبر للصوت التصحيح المشبك والحصول علي البيانات مع البرامج المناسبة.
  7. فتح برنامج التحكم مكبر للصوت ، وتعيين كسب اشاره في القيمة 1 وتصفيه بسل في 10 كيلوهرتز. تاكد من ان فلتر بسل هو 2.5 مرات اقل من تردد أخذ العينات.
  8. تعيين البروتوكولات التجريبية للجهد المشبك والتجارب الحالية المشبك في برنامج التسجيل.
  9. في اعداد البروتوكول ، حدد وضع التحفيز العرضي واضبط تردد أخذ العينات عند kHz 25. ثم ، انتقل إلى علامة التبويب الموجي واكتب الجهد أو السعه الحالية الخطوة وطول علي النحو التالي.
  10. لتيارات الصوديوم الجهد بوابات, استخدام 15 خطوات الجهد (50 ms مده كل منها) من-100 mV إلى + 40 mV (10 mV الزيادة). تشغيل البروتوكول بعد فرض إلى الخلية مصححه امكانيه عقد من-60 mV من خلال مكبر للصوت. المثل ، يتم اثار تيارات البوتاسيوم الجهد بوابات بخطوات الجهد (250 مللي ثانيه مده كل منهما) من-30 mV إلى + 50 mV (10 mV زيادة) عقد الخلية المسجلة إلى-40 mV.
  11. للتحقيق في خصائص إطلاق النار من الجمجمة المستمدة iPSC والعمود الفقري MNs ، المشبك الخلايا ، في وضع المشبك الحالي ، في قدره الغشاء من-70 mV واستخدام النبضات الحالية 4 (1 s مده كل منها) من زيادة السعه (من + 20 باسكال إلى + 80 pA ؛ 20 pA الزيادة).
  12. الحصول علي كل خليه التيارات النشطة الجهد ، اثار إطلاق النار النشاط وثلاثه خصائص السلبي والسعه الخلية الكاملة (سم) ، ومقاومه غشاء الخلية (Rm) ويستريح غشاء المحتملة (مبردات).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد في الشكل 1وصف تخطيطي لطريقه التفريق. تم نقل iPSCs البشرية (WT I خط3) مع Epb-BSD-tt-النيل أو Epb-BSD-tt-النعناع الخاص ، وتوليد ، بناء علي الاختيار بلاستيبين ، ومستقره والخلايا القابلة للتحويل12، يشار اليها فيما بعد باسم ipscs-NIL و IPSCS-النعناع ، علي التوالي. ميزت خلايا يميز للتعبير من ال [تعدد ماركر] OCT4 وال [ول-كسم] علامة TUJ1. واظهر تحليل المناعية التعبير موحده من OCT4 في جميع الخلايا في اليوم 0 ، في غياب الايجابيه TUJ1 (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح هذا البروتوكول بتحويل iPSCs البشرية بكفاءة إلى الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري والجمجمة بفضل التعبير المنتبائي لعوامل النسخ الخاصة بالنسب. هذه الجينات هي محفزه من قبل الدوكسيسيكلين ومتكاملة بشكل ثابت في الجينوم بفضل ناقلات المستندة إلى ترانسباك. في المجموعات السكانية المختلطة ، سيتم دمج نسخه واحده أو عده نسخ من المتجه الخاص بالخلية بشكل عشوائي في جينوم الخلايا الفردية ، مما يزيد من خطر التغيرات التي تطرا علي سلامه الجينوم. وعلاوة علي ذلك ، فان الانتقاء التدريجي لمستنسخات iPSC قد يحدث علي مر الزمن ، مع ما يم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون ان يشكروا مرفق التصوير في مركز علوم النانو الحياتية ، المعهد الإيطالي لتقنيات التكنولوجيا ، للحصول علي الدعم والمشورة الفنية. ونحن ممتنون لأعضاء مركز العلوم نانو الحياة لمناقشه مفيده. وكان هذا العمل مدعوما جزئيا بمنحه من AriSLA (منحه تجريبية 2016 "ستريسفوس") إلى AR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5-BaptaSigma-AldrichA4926-1Gللمواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية
AccutaseSigma-AldrichA6964-100ML   ؛كاشف تفكك الخلية
مكافحة CHATEMD Millipore AB144Pأستيل ترانسفيراز المضادة للكولين. الجسم المضاد الأولي المستخدم في فحوصات التلوين المناعي. RRID: AB_2079751; رقم الدفعة: 2971003
مضاد للماعز Alexa Fluor 488   ؛ثيرمو فيشر العلمية A11055الجسم المضاد الثانوي المستخدم في فحوصات التألق الأحادي. RRID: AB_2534102; رقم الدفعة: 1915848
المضاد للفأر Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific A31571الجسم المضاد الثانوي المستخدم في فحوصات التألق الأحادي. RRID: AB_162542; رقم الدفعة: 1757130
anti-Oct4 BD Biosciences611202الجسم المضاد الأساسي المستخدم في فحوصات التلوين المناعي. RRID: AB_398736; رقم الدفعة: 5233722
anti-Phox2bSanta Cruz Biotechnology، Inc.sc-376997الجسم المضاد الأولي المستخدم في فحوصات التلوين المناعي. رقم الدفعة: E0117
مضاد للأرانب Alexa Fluor 594   ؛العلوم المناعيةIS-20152-1الجسم المضاد الثانوي المستخدم في فحوصات التألق الأحادي
المضاد ل TUJ1   ؛سيجما ألدريتش T2200الجسم المضاد الأولي المستخدم في فحوصات التلوين المناعي. RRID: AB_262133
B27Miltenyi Biotec130-093-566مكمل غذائي خال من المصل لصيانة الخلايا العصبية
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02وسط تجميد الخلايا ، يستخدم هنا لأسلاف الخلايا العصبية الحركية
BDNFPreproTech450-02عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ
BlasticidinSigma-Aldrich203350مضاد حيوي نيوكليوزيد يمنع تخليق البروتين في بدائيات النوى وحقيقيات النوى
BSASigma-AldrichA2153مصل الأبقار ألبومين. عامل حجب لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة في فحوصات التلوين المناعي
CaCl2< / sub>Sigma-AldrichC3881الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية
برنامج Clampex 10الأجهزة الجزيئيةClampex 10نظام تسجيل التيارات الغشائية
Corning Matrigel hESC المؤهل354277تحضير الغشاء القاعدي المعاد تشكيله من ساركوما الفأر Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). تستخدم لالتصاق iPSC بالبلاستيك والزجاج يدعم
CRYOSTEM ACF FROZEN MEDIAالصناعات البيولوجية05-710-1Eوسط التجميد ل iPSCs البشرية
D-GlucoseSigma-AldrichG5146المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية
مسحوق DAPIRoche102362760014&رئيس ;,6-دياميدينو-2-فينيليندول. صبغة الفلورسنت التي ترتبط بالأدينين & ndash ؛ المناطق الغنية بالثايمين في الحمض النووي المستخدمة في تلطيخ النوى في فحوصات أحادية التألق
DAPTAdipoGenAG-CR1-0016-M005مثبط سيكريتاز جاما
ديسبازجيبكو17105-041كاشف للتفكك اللطيف من iPSCs البشرية
DMEM / F12Sigma-AldrichD6421-500MLالوسط القاعدي لزراعة الخلايا
DoxycyclineSigma-AldrichD9891-1G & نب سب.تستخدم للحث على التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا من نواقل epB-Bsd-TT-NIL و epB-BSD-TT-NIP
DS2U WiCellUWWC1-DS2Uخط iPSC البشري
E.Z.N.A إجمالي RNA Kit  أوميغا بيو تيكR6834-02للاستخراج الكلي للحمض النووي الريبي من الخلايا حقيقية النواة المستزرعة
GDNFPreproTech450-10عامل التغذية العصبية المشتق من الدبقية
جيبكو خط hiPSC العرضيThermo Fisher ScientificA18945خط iPSC البشري التجاري
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050038بديل ل L-glutamine مع زيادة الاستقرار. يحسن صحة الخلايا.
هيبسسيجما-ألدريتشH4034المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية
iScript Reverse Transcription Supermix ل RT-qPCR 1708841Bio-Radلتحليل التعبير الجيني باستخدام qPCR في الوقت الفعلي
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix بيو راد172-5121 مزيج تفاعل رئيسي جاهز للاستخدام محسن لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي القائم على الصبغة (qPCR) على أي أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي
K-GluconateSigma-AldrichG4500للمحاليل الفيزيولوجية الكهربية
KClSigma-AldrichP9333المواد الكيميائية للمحاليل الفيزيولوجية الكهربية
حمض الأسكوربيك L-ascorbicمختبرات LKTA7210تستخدم في زراعة الخلايا كمضاد للأكسدة
LamininSigma-Aldrich11243217001يعزز ارتباط ونمو الخلايا العصبية في المختبر
مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر  أوليمبوس  iX83 FluoView1200مجهر متحد البؤر للحصول على صور تلطيخ المناعة
Mg-ATPSigma-AldrichA9187المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية
MgCl2< / sub>Sigma-AldrichM8266المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية
تصاعد الوسط  Ibidi50001حل التركيب المستخدم في الفحص المجهري متحد البؤر ومقايسات التألق المناعي
مكبر للصوت Multiclampالجزيئات700Bنظام تسجيل التيارات الغشائية
Na-GTPSigma-AldrichG8877المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية
NaClSigma-Aldrich71376المواد الكيميائية للحلول الفيزيولوجية الكهربية
NEAAThermo Fisher Scientific11140035الأحماض الأمينية غير الأساسية. تستخدم كمكمل لوسط زراعة الخلايا ، لزيادة نمو الخلايا وقابليتها للحياة.
نيون 100 مو ؛ L KitThermo Fisher ScientificMPK10096Cell Electroporation
System Neon TransfectionThermo Fisher ScientificMPK5000Cell Electroporation
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Basal Medium مصممة للصيانة طويلة الأجل ونضج مجموعات الخلايا العصبية دون الحاجة إلى طبقة مغذية للخلايا النجمية
NutriStem-XF / FF الصناعات البيولوجية05-100-1Aثقافة iPSC البشرية المتوسطة
المجهر الإلكترونيبارافورمالديهايد157-8تستخدم لتثبيت الخلايا في فحوصات التلوين المناعي
PBSSigma-AldrichD8662-500MLملحي للفوسفات العازلة من Dulbecco ، مع الكالسيوم ، مع المغنيسيوم
PBS Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup> خالمن Sigma-AldrichD8537-500MLملحي عازل للفوسفات من Dulbecco ، بدون كالسيوم ، بدون
بنسلين المغنيسيوم / الستربتومايسين ؛Sigma-AldrichP4333-100MLمحلول البنسلين / الستربتوميسين يستخدم لمنع تلوث زراعة الخلايا من البكتيريا.
بولي أورنيثينسيجما-ألدريتشP4957يعزز ارتباط ونمو الخلايا العصبية في المختبر
SU5402سيجما ألدريتشSML0443-5MGمثبط انتقائي لمستقبلات عامل النمو البطاني الوعائي 2 (VEGFR-2) تريتون
X-100 & nbsp;سيجما ألدريتشT87874- (1،1،3،3-تتراميثيلبوتيل) فينيل بولي إيثيلين جلايكول ،   ؛ t-Octylphenoxypolyethoxyethanol ، بولي إيثيلين جلايكول   ؛ الأثير ثلاثي أوكتيل الفينيل. تستخدم لنفاذية الخلية في فحوصات التلوين المناعي
المجهر المستقيمOlympusBX51VIالمجهر للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي المجهز بكاميرا CoolSnap Myo   ؛
Y-27632  (مثبط الصخور)إنزو لايف ساينسALX-270-333-M005 مثبط انتقائي منفذ للخلية لملف ملفوف مرتبط ب Rho يحتوي على بروتين كيناز (ROCK). يزيد من بقاء iPSC
μ-Slide 8 Well نفس المصدر80826دعم عالية & ndash ؛ نهاية التحليل المجهري للخلايا الثابتة
التجاري مجموعة مجموعة كيماويات جهاز علوم محلول محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).
  2. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
  3. Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
  4. Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
  5. Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
  6. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  7. Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960(2016).
  10. Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
  11. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
  12. De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
  13. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  14. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
  15. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  16. Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
  17. Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  18. Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
  19. Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  20. Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
  21. Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Human iPSCsMotor Neuron DifferentiationPiggyBac VectorsNgn2 Isl1 Lhx3Ngn2 Isl1 Phox2aSpinal Motor NeuronsCranial Motor NeuronsDoxycycline InductionCholine AcetyltransferaseAction Potential Firing

مقالات ذات صلة