مقالة منهجية

تحديد الإفراط في الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة Codon الغنية

DOI:

10.3791/59331

⸱

يونيو 24, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, School of Life Sciences, Beijing Institute of Technology, 2UCLA Institute for Technology Advancement (Suzhou)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة استراتيجية بديلة للطريقة التقليدية السامة المستندة إلى التناظرية في تحديد الإفراط في الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة الغنية codon لتحقيق الدقة والحساسية، والإنتاجية العالية في وقت واحد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتلبية السوق المتنامية باستمرار للأحماض الأمينية، هناك حاجة إلى سلالات الإنتاج عالية الأداء. يتم تحديد الإفراط في الأحماض الأمينية بشكل تقليدي عن طريق تسخير المسابقات بين الأحماض الأمينية ونظائرها. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة المستندة إلى التناظرية هي من دقة منخفضة، ونظائرها المناسبة للأحماض الأمينية محددة محدودة. هنا، نقدم استراتيجية بديلة تمكن من فحص دقيق وحساس وعالي الإنتاجية للإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية باستخدام علامات نادرة غنية بالكودون. هذه الاستراتيجية مستوحاة من ظاهرة التحيز استخدام codon في ترجمة البروتين، والتي يتم تصنيف codons في تلك الشائعة أو النادرة على أساس ترددات حدوثها في الحمض النووي الترميز. تعتمد ترجمة codons النادرة على نقلها النادر المقابل RNAs (tRNAs)، والتي لا يمكن شحنها بالكامل من قبل الأحماض الأمينية الكونات تحت المجاعة. من الناحية النظرية، يمكن شحن tRNAs نادرة إذا كان هناك فائض من الأحماض الأمينية بعد شحن isoacceptors المشتركة مرادفة. ولذلك، يمكن استعادة الترجمات المتخلفة الناجمة عن codons نادرة عن طريق التغذية أو الإفراط داخل الخلايا من الأحماض الأمينية المقابلة. في ظل هذا الافتراض، يتم إنشاء نظام اختيار أو فحص لتحديد الإفراط في الأحماض الأمينية عن طريق استبدال codons المشتركة من الأحماض الأمينية المستهدفة مع بدائلها النادرة مرادفة في جينات مقاومة المضادات الحيوية أو الجينات ترميز البروتينات الفلورية أو الكروموجينية. نبين أن تعبيرات البروتين يمكن أن تعوق إلى حد كبير من خلال إدراج codons نادرة وأن مستويات البروتينات ترتبط بشكل إيجابي مع تركيزات الأحماض الأمينية. باستخدام هذا النظام، يمكن فحص الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المتعددة بسهولة من مكتبات الطفرات. تتطلب هذه الاستراتيجية المستندة إلى codon النادرة جينًا معدلًا واحدًا فقط، والمضيف أقل احتمالاً للهروب من الاختيار منه في طرق أخرى. ويوفر نهجا بديلا للحصول على الإفراط في الأحماض الأمينية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد الإنتاج الحالي للأحماض الأمينية بشكل كبير على التخمير. ومع ذلك، فإن titers والغلة لمعظم سلالات إنتاج الأحماض الأمينية هي أقل من الطلب المتزايد لسوق الأحماض الأمينية العالمية التي تبلغ قيمتها مليارات الدولارات1،2. الحصول على الإفراط في الأحماض الأمينية عالية الأداء أمر بالغ الأهمية لرفع مستوى صناعة الأحماض الأمينية.

الاستراتيجية التقليدية لتحديد الأحماض الأمينية الإفراط في الشركات يستغل المسابقات بين الأحماض الأمينية ونظائرها في تخليق البروتين3،4. هذه النظيرات قادرة على شحن tRNAs التي تعترف الأحماض الأمينية المقابلة وبالتالي تمنع استطالة سلاسل الببتيد، مما يؤدي إلى النمو القبض أو موت الخلية5. إحدى الطرق لمقاومة الضغوط التناظرية هي زيادة تركيزات الأحماض الأمينية داخل الخلايا. الأحماض الأمينية المخصب سوف تتفوق على النظير لtRNAs محدودة وضمان التوليف الصحيح للبروتينات الوظيفية. ولذلك، يمكن اختيار السلالات التي البقاء على قيد الحياة النظير ومن المرجح أن الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المقابلة.

على الرغم من أن ثبت نجاحها في اختيار الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية مثل L-ليوسين6, الاستراتيجية التناظرية القائمة على يعاني من عيوب شديدة. أحد الشواغل الرئيسية هو المقاومة التناظرية التي نشأت من عملية الطفرات أو من خلال الطفرات العفوية. سلالات مع المقاومة يمكن الهروب من الاختيار عن طريقحظر أو تصدير أو تدهور النظير 5. قلق آخر هو الآثار الجانبية السامة للنظائر على العمليات الخلوية الأخرى7. ونتيجة لذلك, السلالات التي البقاء على قيد الحياة اختيار التناظرية قد لا يكون الإفراط في الأحماض الأمينية, في حين أن الإفراط المطلوب يمكن إبادة زورا بسبب الآثار الجانبية السلبية.

هنا، يتم تقديم استراتيجية جديدة على أساس قانون التحيز codon من أجل تحقيق تحديد دقيق وسريع للإفراط في الأحماض الأمينية. يتم ترميز معظم الأحماض الأمينية من قبل أكثر من ثلاثي النيوكليوتيد الذي يفضل بشكل مختلف من قبل الكائنات الحية المضيفة8،9. ونادرا ً ما يتم استخدام بعض codons في تسلسلات الترميز ويشار إليها باسم codons النادرة. ترجماتها إلى الأحماض الأمينية تعتمد على tRNAs الكونات التي تحمل الأحماض الأمينية المقابلة. ومع ذلك، فإن tRNAs التي تعترف codons نادرة عادة ما يكون وفرة أقل بكثير من tRNAs من codons المشتركة10،11. وبالتالي، فإن هذه الـ tRNAs النادرة أقل احتمالاً لالتقاط الأحماض الأمينية الحرة في المسابقات مع النظائر الأخرى، وتبدأ ترجمات التسلسلات الغنية بالكدون النادرة في التباطؤ أو حتى يتم إنهاؤها عندما تكون كميات الأحماض الأمينية محدودة 10.يمكن استعادة الترجمات، من الناحية النظرية، إذا كان هناك فائض من الأحماض الأمينية بعد شحن tRNAs المشتركة مرادفة بسبب الإفراط في الإنتاج أو التغذية الإضافية من الأحماض الأمينية المقابلة12. إذا كان الجين النادر الغنية codon ترميز مجموعة أو علامة الفرز، يمكن بعد ذلك تحديد سلالات تظهر الأنماط الظاهرية المقابلة ومن المرجح أن تكون الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المستهدفة.

يتم تطبيق الاستراتيجية المذكورة أعلاه لإنشاء نظام اختيار وفحص لتحديد الإفراط في الأحماض الأمينية. يستخدم نظام الاختيار جينات مقاومة المضادات الحيوية (على سبيل المثال، kanR)كعلامات بينما يستخدم نظام الفحص الجينات ترميز الفلورسنت (على سبيل المثال، بروتين الفلورسنت الأخضر [GFP]) أو الكروموجينيك (على سبيل المثال، PrancerPurple) البروتينات. يتم تعديل جينات العلامة في كلا النظامين عن طريق استبدال أرقام محددة من codons المشتركة للحمض الأميني المستهدف مع بديل نادر مرادف لها. يتم اختيار السلالات في مكتبة الطفرة التي تأوي جين العلامة الغنية بالكدون النادر ة أو فحصها في ظروف مناسبة، ويمكن التعرف بسهولة على الإفراط في إنتاج الأحماض الأمينية المستهدفة. يبدأ سير العمل مع بناء نظام الجينات علامة نادرة الغنية codon، تليها الأمثل لظروف العمل، ومن ثم تحديد والتحقق من الإفراط في الأحماض الأمينية. وتستند هذه الاستراتيجية التناظرية المستقلة على العقيدة في ترجمة البروتين، وقد تم التحقق عمليا لتمكين تحديد دقيقة وسريعة من الإفراط في الأحماض الأمينية. من الناحية النظرية، يمكن استخدامه مباشرة إلى الأحماض الأمينية مع codons نادرة وجميع الكائنات الحية الدقيقة. في الكل، فإن الاستراتيجية القائمة على codon نادرة بمثابة بديل فعال للنهج المستندة إلى التناظرية التقليدية عندما النظير السليم للأحماض الأمينية محددة غير متوفرة، أو عندما يكون معدل إيجابي كاذبة عالية هو الشاغل الرئيسي. يستخدم البروتوكول أدناه اللوكين نادرة codon لإثبات هذه الاستراتيجية في تحديد الإشريكية القولونية L-ليوسين الإفراط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء البلازميدات التي تعبر عن الجينات علامة نادرة الغنية codon

  1. حدد جين علامة يحتوي على عدد مناسب من codons المشتركة للحمض الأميني المستهدف.
    ملاحظة: بالنسبة لL-leucine، يستخدم الجين المقاومكاناشين كانR، الذي يحتوي على 29 codons ليوسين ، منها 27 codons المشتركة ، لبناء نظام الاختيار13. يستخدم جين gfp، الذي يحتوي على 17 codons المشتركة من أصل 19 codons ليوسين، أو الأرجواني البروتين ترميز الجينات prancerpurple (ppg)، الذي يأوي 14 codons ليوسين المشتركة، لنظام الفرز (الجدول التكميلي1 ).
  2. استبدل الكدونات الشائعة في جينات العلامة بـ codon النادر ة. لL-ليوسين، استبدال codons في كانR، gfp،أو ppg مع CTA codon نادرة، وتوليد كان R-RCs، gfp-RC،أو ppg-RC،على التوالي13 ( الجدول التكميلي 1
    ملاحظة: سيؤثر تواتر الكودون النادر في جينات العلامة على مرونة نظام الاختيار أو الفحص. بشكل عام، فإن زيادة عدد codons نادرة زيادة الصرامة من نظام الاختيار أو الفرز. لتحقيق الاختيار المناسب أو قوة الفرز، وتصميم سلسلة من الجينات علامة التي تأوي أرقاممختلفة من codons نادرة ومقارنة آثارها.
  3. توليد كتل من الجينات علامة نادرة codon الغنية باستخدام أدوات مثل GeneDesign14 (http://54.235.254.95/gd/) لتركيب الجينات. بدلا من ذلك، طلب الجينات علامة من خدمات تركيب الجينات التجارية.
    1. في صفحة GeneDesign، اختر تصميم كتل الإنشاء (تداخل طول ثابت).
    2. لصق تسلسل جينات العلامة الغنية بالكدون النادرة في مربع التسلسل.
    3. تحديد طول التداخل بين oligos التجميع; نضع في اعتبارنا أن الافتراضي 40 نقطة أساس يعمل بشكل جيد لمعظم التسلسلات.
      ملاحظة: راجع الدليل عبر إنترنت للحصول على مزيد من الإرشادات حول إعدادات المعلمات الأخرى.
    4. انقر فوق الزر تصميم كتل الإنشاء وترتيب oligonucleotides المدرجة على الصفحة.
  4. توليف الجينات النادرة المعدلة codon بواسطة تفاعل سلسلة بوليميراز (PCR) القائم على توليف دقيق15.
  5. Ligate النادرة codon الغنية كان R-RC إلى ناقلات pET-28a، gfp-RC إلى pSB1C3، وppg-RC إلى CPB-37-44116.
    ملاحظة: تتوفر خرائط بلازميد pET-28a وpSB1C3 على قاعدة بيانات البلازميد على الإنترنت (الجدولالتكميلي1)؛ خريطة بلازميد CPB-37-441 متاحة على موقع البروتين الكروموجينيك ATUM.
    1. على الجليد، يضاف المتجه وشظايا العلامة في نسبة مولية من 1:1 إلى 7.5 ميكرولتر من مزيج التجميع (انظر جدولالمواد) إلى حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر. حضانة العينة في 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. تحويل 5 ميكرولتر من منتج التجميع إلى 50 درجة مئوية من الخلايا المختصة (انظر جدولالمواد) عند 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
    3. استعادة الخلايا في SOC (سوبر مرق الأمثل مع قمع catabolite) المتوسطة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، لوحة لهم على LB (مرق lysogeny) أجار المتوسطة، واحتضانلهم في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    4. تلقيح المستعمرة في LB المتوسطة وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعة.
    5. عزل البلازميد باستخدام مجموعة تجارية مفضلة.

2. تحسين شروط الاختيار

  1. جعل سلالة الوالدين المستخدمة للتحول في الخلايا المختصة17.
  2. تحويل 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة مع 1 ميكرولتر من البلازميد الذي يحمل البرية من نوع كان R، وتحويل مجموعة أخرى من الخلايا المختصة مع بلازميد يحتوي على كانR-RC29 مع استبدال جميع codon ليوسين نادرة codon CTA.
  3. إضافة 950 درجة مئوية من SOC المتوسطة واحتضان العينة في شاكر في 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. لوحة 100 μL من ثقافة الخلية على LB أجار المتوسطة التي تحتوي على 50 μg·mL-1 kanamycin، وحضانة في 37 درجة مئوية لحوالي 8 ح حتى تظهر المستعمرات.
  5. اختيار المستعمرات التي تأوي البرية من نوع كانR والليوسين نادرة codon الغنية كان R-RC29 واستخدام كل لتلقيح 5 مل من خمسة أضعاف المخففLB المتوسطة (0.2X LB) التي تحتوي على 50 μg·mL-1 كاناميسين. حضانة العينات في شاكر في 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: الوسيطة حاسمة لنظام التحديد. وينبغي أن تحتوي على ما يكفي من الكربون والنيتروجين للسماح للتعبير عن البروتين المقاومة للمضادات الحيوية من الجين البرية بدلا من المشتقات المعدلة نادرة codon. في هذه الحالة، تركيز L-ليوسين في 1X LB المتوسطة عالية جدا لمنع تماما التعبير البروتين من نادرة codon الغنية كانR. وهكذا، يتم استخدام وسط LB المخفف مع عامل التخفيف مثل 5 لتوليد فرق واضح في تعبيرات البروتين من النوع البري والجينات النادرة الغنية بcodon.
  6. نقل 200 درجة مئوية من كل من الثقافات الخلية إلى لوحة 96 جيدا في ثلاثة أضعاف في نقاط زمنية محددة (على سبيل المثال، 8 ح، 16 ح، و 24 ح). قياس OD600 (الكثافة البصرية في 600 نانومتر) باستخدام قارئ لوحة.
    ملاحظة: إذا كان لا يمكن الكشف عن انخفاض في الخلية OD600 للسلالات التي تأوي الجينات علامة نادرة codon الغنية بالمقارنة مع OD600 من سلالة إيواء الجينات علامة من نوع البرية، في محاولة لزيادة كمية codon نادرة في الجينات علامة أو استخدام وسيلة أكثر تخفيفا.
  7. إجراء فحص تغذية الأحماض الأمينية لاختبار ما إذا كان يمكن استعادة تعبيرات الجينات علامة نادرة codon الغنية (على سبيل المثال، كانR-RC29)عن طريق زيادة تركيز الأحماض الأمينية المستهدفة.
    ملاحظة: لاختيار الإفراط L-ليوسين، يستخدم L-ليوسين للتغذية.
    1. تلقيح السلالات التي تأوي جين علامة كان R-RC29 إلى 5 مل من 0.2x LB (تحتوي على 50 ميكروغرام·mL-1 كانامايسين) مع أو بدون العرض من 1 غرام· L-1 L-ليوسين. تلقيح 5 مل أخرى من 0.2x LB مع سلالات التي تأوي R كان البرية من نوع كعنصر تحكم. حضانة العينات في شاكر في 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية.
    2. قياس OD600 لكل ثقافة في نقاط زمنية محددة (على سبيل المثال، 15 ساعة و17 ساعة و19 ح و22 ساعة).

3. تحسين شروط الفحص

  1. تحويل 50 ميكرولتر من سلالة الوالدين المستخدمة للطفرات مع 1 ميكرولتر من البلازميد (~ 50 ng·μL-1)الذي يحمل gfp من النوع البري أو ppgمن النوع البري . أيضا، تحويل سلالة الأصل مع المشتقات النادرة الغنية codon من الجينات علامة.
  2. إضافة 950 درجة مئوية من SOC المتوسطة واحتضان العينة في شاكر في 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. لوحة 100 درجة مئوية من ثقافة الخلية على وسط أجار LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (25 μg·mL-1 chloramphenicol للبلازميد gfp تحمل علامة R سم، أو 50 μg·mL-1 kanamycin لppg بلازميد تحمل علامة كان R) وحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  4. اختيار مستعمرة واحدة التي تأوي gfp البرية من نوع أو ppg ومستعمرة واحدة التي تأوي المشتقات الغنية النادرة الكدون المقابلة، ونقلها إلى 5 مل من المتوسط LB المخففبشكل صحيح بشكل فردي. حضانة العينات في شاكر في 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: لسلالات القولونية E. التي تأوي اللوجين النادر-codon-rich gfp-RC أو ppg-RC،يمكن استخدام وسط LB غير المخفف (1x LB) لخلق اختلافات كبيرة في التعبيرات من النوع البري وعلامة نادرة الغنية codon الجينات. أيضا، يتم استخدام المروجين اللاتقادر لدفع التعبيرات من الجينات علامة الفرز. بدء الحث عندما تدخل الخلايا المرحلة الأسية لتحقيق تمييز أفضل.
  5. بالنسبة لعلامات الفلورة، قم بنقل 200 ميكرولتر لكل من ثقافات الخلايا إلى لوحة سوداء واضحة القاعدة ذات 96 درجة في ثلاث نقاط زمنية محددة (على سبيل المثال، 2 ساعة و4 ح و6 ح). قياس OD600 والفلورة وحساب كثافة الفلورة (نسبة الفلورة إلى OD600). بالنسبة للعلامات الكروموجينية، قم بقياس تطور لون ثقافات الخلايا.
    ملاحظة: إذا كان لا يمكن الكشف عن كثافة الفلورة أقل للسلالات التي تأوي gfp-RC بالمقارنة مع سلالات إيواء gfpالبرية من النوع ، أو إذا كان لا يمكن الكشف عن لون أخف للخلايا التي تعبر عن البروتين الأرجواني من ppg-RC من الجين البرية من نوع، في محاولة لزيادة عدد من codon نادرة على الجينات علامة أو استخدام وسيلة أكثر تخفيفا.
  6. إجراء تقييم التغذية (انظر الخطوتين 2-7-1 و2-7-2). قياس شدة الفلورة أو تطور اللون عند نقاط زمنية محددة (على سبيل المثال، 12 ساعة و18 ساعة و24 ساعة).

4. تحديد الإفراط في الأحماض الأمينية

  1. تلقيح 100 درجة مئوية من ثقافة المتحولين إلى 5 مل من LB المتوسطة (2٪ V / V) واحتضانه في شاكر في 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية حتى تصل قيم OD600 0.4.
  2. جعل المتحولين إلى الخلايا المختصة17.
  3. تحويل 50 ميكرولتر من الخلايا المتحولة مع 1 ميكرولتر من بلازميد (~ 50 ng·μL-1)تحمل علامة الاختيار كانR-RC29 أو علامات الفرز gfp-RC أو ppg-RC. إضافة 950 درجة مئوية من SOC المتوسطة وتدوير العينة في 37 درجة مئوية شاكر لمدة 1 ساعة.
  4. حدد الإفراط في الأحماض الأمينية.
    1. طرد مركزي في زراعة الخلية في 4000 × ز لمدة 5 دقائق، وتجاهل supernatant وإضافة 5 مل من 0.2X LB المتوسطة التي تحتوي على 50 μg·mL-1 كاناميسين. حضانة العينة في 37 درجة مئوية شاكر بين عشية وضحاها.
    2. لوحة الثقافة بين عشية وضحاها (على سبيل المثال، 100 درجة مئوية، يعتمد على كثافة الخلية من الثقافة) على 0.2x LB أجار المتوسطة التي تحتوي على 50 μg·mL-1 كانامايسين وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
      ملاحظة: المستعمرات المتقدمة هي المرشحين للإفراط في الأحماض الأمينية المستهدفة، وفي هذه الحالة، الإفراط L-ليوسين.
  5. فحص الإفراط في الأحماض الأمينية.
    1. لوحة العدد المناسب من الخلايا (على سبيل المثال، 100 ميكرولتر) التي تأوي علامة الفرز (كما هو موضح في الخطوة 4.3) على وسط أجار LB الذي يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (25 ميكروغرام·mL-1 الكلورامفينيكول لفحصها مع gfp-RC و 50 μg·mL -1 كانامايسين للفحص مع ppg-RC)وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعة.
    2. تلقيح وسط LB الذي يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (انظر الخطوة 4.5.1) مع كل مستعمرة واحدة من اللوحة. حضانة العينات في شاكر في 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية.
    3. قياس OD600 والفلورة وحساب كثافة الفلورة إذا تم استخدام GFP-RC. قياس تطور لون الثقافات الخلية إذا تم استخدام ppg-RC. لاحظ أن السلالات التي تظهر كثافة الفلورة أعلى أو لون أعمق من سلالة الوالدين هي الإفراط في الأحماض الأمينية المرشح، وفي هذه الحالة، الإفراط L-ليوسين.
      ملاحظة: فرز الخلايا المنشطة الفلورية هو أيضا مناسبة لتحديد خلية واحدة عالية المنتجين عندما يتم استخدام جينات البروتين الفلورسنت الغنية بالكدون النادرة لفحص.
  6. تحقق من إنتاج الأحماض الأمينية من سلالات المرشح.
    1. تلقيح 5 مل من LB المتوسطة مع كل من سلالات مرشح والسماح للخلايا تنمو بين عشية وضحاها في شاكر في 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. حصاد الخلايا من 1 مل من ثقافة الخلية عن طريق الطرد المركزي في 4000 × ز لمدة 2 دقيقة.
    3. تلقيح 20 مل من M9 المتوسطة التي تحتوي على الجلوكوز 4٪ مع 200 درجة مئوية من تعليق الخلية وحضانة في شاكر 250 مل في 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    4. الطرد المركزي 1 مل من وسط الثقافة في 4000 × ز لمدة 5 دقائق. نقل 200 درجة مئوية من supernatant إلى أنبوب 1.5 مل نظيفة. إعداد حلول L-ليوسين (HPLC (عالية الأداء اللونية السائلة) الصف) من 0.01، 0.05، 0.1، 0.5، و 1 غرام · L-1 كمعايير.
    5. إضافة 100 درجة مئوية من 1 m triethylamine و 100 درجة مئوية من 1 M فينيل إيزوثيوسيانات إلى supernatant والمعايير، ومزجها بلطف، واحتضانلهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة18.
      تحذير: يمكن أن يسبب ثلاثي إيثيلامين وإيزوثيوسيانات فينيل حروق الجلد الشديدة وتلف العين وضار إذا استنشق. ارتداء القفازات وقناع، وإذا كان ذلك ممكنا، وأداء هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة الدخان.
    6. إضافة 400 ميكرولتر من الهكهكة إلى نفس الأنبوب ودوامة لمدة 10 ثانية. قم بتصفية المرحلة السفلى التي تحتوي على مشتقات الأحماض الأمينية من خلال غشاء بولي تترافلوروإيثيلين 0.2 م.
      تحذير: n-هيكسان يمكن أن يسبب تهيج الجلد. ارتداء القفازات والملابس الواقية. إذا كان يأتي في اتصال مع الجلد، شطف الجلد مع الكثير من الماء.
    7. إعداد المرحلة المتنقلة A عن طريق خلط 0.1 M خلات الصوديوم (الحموضة 6.5) وأسيتانيتريل في نسبة الحجم99.3:0.7. إعداد الأسيتاتونيتريل (80٪ v/v) كمرحلة متنقلة B. تصفية جميع المراحل المتنقلة من خلال 0.2 ميكرومتر أغشية البولي تترافلوروإيثيلين.
      تحذير: Acetonitrile ضار إذا استنشق ويمكن أن يسبب تهيج الجلد والعين. ارتداء القفازات والملابس الواقية وأداء هذه الخطوة في غطاء محرك الدخان.
    8. تشغيل 1 μL من العينة على فائقة HPLC مجهزة عمود C18 وفقا لبرنامج elution في الجدول 1 مع معدل تدفق 0.42 مل · دقيقة-1 ودرجة حرارة عمود من 40 درجة مئوية. الكشف عن الأحماض الأمينية المستهدفة في 254 نانومتر مع كاشف صفيف الصمام الثنائي وحساب تركيزاتها عن طريق رسم خرائط مناطق الذروة إلى منحنى قياسي.
الوقت (دقيقة)المرحلة المتنقلة ألف (بالنسبة المئوية)المرحلة المتنقلة باء (بالنسبة المئوية)
صفر982
3.57030
74357
7.1صفر100
11982

الجدول 1: برنامج الإلوطي للقياس الكمي للأحماض الأمينية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة لنظام الاختيار، ينبغي ملاحظة انخفاض حاد في OD600 للسلالات التي تأوي جين مقاومة المضادات الحيوية الغنية بالكدون النادر ة مقارنة بسلالة إيواء جين مقاومة المضادات الحيوية من النوع البري عند المستزرع في مناسبة متوسطة(الشكل 1أ). في ظل نفس الظروف، يصبح الانخفاض في الخلية OD600 أكثر وضوحا مع زيادة عدد codons نادرة في الجينات مقاومة المضادات الحيوية (الشكل1a). وتجدر الإشارة إلى أن تثبيط codon نادرة على تعبير...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عدد codons نادرة في الجينات علامة ووسيط الاختيار أو الفرز حاسمة لمنع تعبيرات البروتين من الجينات علامة نادرة codon المعدلة. إذا لم يكن من المتمكن الكشف عن فرق كبير بين تعبيرات البروتين من جينات علامات من النوع البري ومشتقاتها، فإن زيادة عدد الكودونات النادرة أو استخدام وسيلة محدودة بالمغذيات قد تزيد من الاختلافات. ومع ذلك، إذا كان تأثير تثبيط قوية جداً، قد لا يتم استرداد تعبيرات البروتين حتى عن طريق التغذية الإضافية من الأحماض الأمينية المقابلة. في هذه الحالة ، يجب تقليل عدد الكودونات النادرة في جينات العلامة لتخفيف جزء ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واشتركت في دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 21676026)، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي الوطني في الصين (المنحة رقم 2017YFD0201400)، والمؤسسة الصينية لعلوم ما بعد الدكتوراه (المنحة رقم 2017M620643). وقد تم دعم الأعمال في معهد النهوض بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (سوتشو) من خلال المنح الداخلية من مقاطعة جيانغسو ومنتزه سوتشو الصناعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AcetonitrileThermo51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep KitTransgenEM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction KitTransgenEG101-01
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
Isopropyl & beta ؛ -D-1-thiogalactopyranosideSolarbioI8070
L-leucineSigmaL8000
قارئ MicroplateBiotekSynergy 2
n-hexaneThermoH3061
فينيل إيزوثيوسياناتسيجماP1034
Prancerالأرجواني CPB-37-441ATUMCPB-37-441
TransStar FastPfu يطير بوليميراز الحمض النوويAP231-01
TriethylamineSigmaT0886
كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداءAgilent1290 Infinity II
Wild type C. glutamicum< / em>ATCC13032
XL10-Gold E. coli < / em> خلية مختصةAgilent200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 العمودAgilent959759-902 ك

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tatsumi, N., Inui, M. Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).
  2. Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).
  3. Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).
  4. Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
  5. Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
  6. Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
  7. Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
  8. Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
  9. Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
  10. Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
  11. Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
  12. Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
  13. Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616(2018).
  14. Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
  15. Xiong, A. -S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
  16. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  18. Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
  19. Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
  20. Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
  21. Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
  22. Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
  23. Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
  24. Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
  25. Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
  26. Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507(2014).
  27. Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
  28. Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
  29. Huo, Y. -X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

600 OD600 HPLC

مقالات ذات صلة