Method Article

تصور بنية العقدة الليمفاوية وتوطين الخلايا باستخدام الفحص المجهري السابق فيفيفو

DOI:

10.3791/59335

⸱

August 9th, 2019

 ,  ,  , 
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Center for Gastrointestinal Biology, Federal University of Minas Gerais

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تقنية لتصوير مجموعات الخلايا المختلفة في استنزاف الغدد الليمفاوية دون تعديلات في بنية الجهاز.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العقد الليمفاوية (LNs) هي أجهزة منتشرة داخل الجسم، حيث يمكن للاستجابات المناعية الفطرية الاتصال مع المناعة التكيفية. في الواقع، يتم تداخل النفثالينات بشكل استراتيجي في مسار الأوعية اللمفاوية، مما يسمح بالاتصال الحميم لمستضدات الأنسجة مع جميع الخلايا المناعية المقيمة في LN. وهكذا, فهم التكوين الخلوي, توزيع, الموقع والتفاعل باستخدام خارج الجسم الحي كله LN التصوير سوف تضيف إلى المعرفة حول كيفية تنسيق الجسم الاستجابات المناعية المحلية والنظامية. يُظهر هذا البروتوكول استراتيجية تصوير في الجسم الحي بعد إدارة في الجسم الحي للأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلورسنت وتسمح بمنهجية قابلة للاستنساخ وسهلة الأداء باستخدام المجاهر البؤرية التقليدية وكواشف الأسهم. من خلال الحقن تحت الجلد من الأجسام المضادة، فمن الممكن تسمية مجموعات الخلايا المختلفة في استنزاف النفثالينات دون التأثير على هياكل الأنسجة التي يمكن أن تتضرر من قبل تقنية الفحص المجهري المناعي التقليدية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العقد الليمفاوية (LNs) هي أجهزة على شكل فراغ موجودة على نطاق واسع في جميع أنحاء الجسم مع وظيفة حاسمة من سد الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. LNs تصفية الليمفاوية من أجل تحديد الجسيمات الأجنبية والخلايا السرطانية لتركيب استجابة مناعية ضدهم1. مستضد تقديم الخلايا (APCs), الخلايا T والخلايا B تعمل جنبا إلى جنب لتوليد الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد (الحصانة الفكاهية) والخلايا الليمفاوية السامة للخلايا (الحصانة الخلوية) للقضاء على الجسيمات الأجنبية والخلايا السرطانية2. وبالتالي، فإن فهم ديناميات الخلايا المناعية الموجودة في الجهاز اللمفاوي سيكون له آثار هامة على تطوير اللقاح والعلاج المناعي للسرطان.

وقد سمح ظهور المجاهر القوية - بما في ذلك المجاهر الجديدة ذات البؤرة وفائقة الدقة - بتقدم غير عادي في فهم كيفية عمل مختلف مجموعات الخلايا المناعية في بيئتها الأصلية3. فمن الممكن الآن لتصوير العديد من الأنواع الفرعية الخلية في وقت واحد باستخدام مزيج من تحقيقات مع الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية تحت السيطرة على أهداف محددة4،5. في الواقع، كانت التقنيات عالية الأبعاد، بما في ذلك قياس الخلايا الشامل وتحليل التدفق متعدد البارامترية حاسمة لتوسيع معرفتنا حول تجزئة الخلايا المناعية المختلفة والوظائف في الصحة والمرض6، 7.ومع ذلك، لإعداد عينات لهذه التقنيات، والأنسجة تحتاج إلى الهضم ويتم فصل الخلايا من محيطها الطبيعي لتحليلها في تعليق الخلايا. لتجاوز هذه القيود والسماح بترجمة أفضل في علم الأحياء، والهدف من البروتوكول المقترح هنا هو تطبيق منهجية واضحة لصورة العقد الليمفاوية في الجسم الحي كله باستخدام المجاهر البؤر ية الأسهم مع الاستفادة من تحسين السرعة والأنسجة الحفاظ على هيكل، وجدوى الخلية بالمقارنة مع تلطيخ المناعية التقليدية. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على إظهار أن الفئران ناقصة لخلايا T γδ، وهونوع فرعي من الخلايا الليمفاوية T المشاركة في الدفاع المبكر المضيف ضد مسببات الأمراض 4، قد عرضت للخطر بصيلات ومناطق الخلايا T بالمقارنة مع الفئران من النوع البري. هذه النتائج سمحت لنا لمتابعة دراسة التي أظهرنا أن الخلايا T γδ تلعب دورا حاسما في التوازن من الأجهزة اللمفاوية والاستجابة المناعية الفكاهية4. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا البروتوكول مساراً فيزيولوجيا للتحقيقات والأجسام المضادة للوصول إلى العقدة الليمفاوية، حيث أنها تدار تحت الجلد وتتبدد من خلال الدورة الدموية اللمفاوية للأنسجة، استناداً إلى التقارير السابقة التي استخدمت في وضع العلامات في الموقع مع الأجسام المضادة لتصور الهياكل المرتبطة اللمفاوية8،9، ديناميات مركز الإنبات10،11،12، وأهداف يمكن الوصول إليها بسهولة لتدفق الدم13 ،14،15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة الدائمة المعنية بالحيوانات في كلية الطب بجامعة هارفارد ومستشفى بريغام ومستشفى النساء، بروتوكول 2016N000230.

1- الفئران المستخدمة في التجربة

  1. استخدام 8 أسابيع من الذكور والإناث الفئران على خلفية B6 لإدارة مزيج الأجسام المضادة.
  2. استخدام CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT الفئران لتحديد ما إذا كان يمكن أيضا تطبيق التصوير LN كامل الجسم السابق على الفئران مراسل دون إدارة مزيج الأجسام المضادة وكذلك للتحقيق في وجود الخلايا أحادية النواة، بما في ذلك تقديم مستضد الخلايا والخلايا الفيغاسية، وتوزيعها في LN.
    ملاحظة: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT الفئران مراسل لديها بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) والبروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) إدراجها تحت سيطرة المروجين CX3CR1 و CCR2، على التوالي. يمكن استخدام الفئران مراسل مع أو بدون حقن مزيج الأجسام المضادة. يرجى الاطلاع على المرجع4 لحقن مزيج الأجسام المضادة في الماوس مراسل. انتقل إلى الجراحة إذا لم يتم حقن أي جسم مضاد.

2. الأجسام المضادة مزيج التحضير والحقن

ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوات على الفئران الموضحة في الخطوة 1.1.

  1. تخفيف 1:10 من البنفسج اللامع (BV) 421 المضادة للقرص الرابع (GK1.5; 0.2 ملغم/ملاغ/ مل)، 1:10 من الأزرق اللامع (BB) 515 المضادة CD19 (1D3؛ 0.2 ملغ /مل) و 1:20 من phycoerythrin (PE) المضادة لF4/80 (T45-2342؛ 0.2 ملغ / مل) في PBS مع الحجم النهائي المناسب لحقن في الفخذ الداخلي (إلى الفخذ صورة inguinal) أو في وسادة مخلب (لصورة popliteal) الليمفاوية.
    ملاحظة: استخدام كأنواع isotypes: BV421 الماوس IgG2b، ك التحكم Isotype (R35-38؛ 0.2 ملغ / مل)؛ PE Rat IgG2a, י Isotype Control (R35-95; 0.2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, י Isotype Control (R35-95; 0.2 mg/mL). في حالة تغيير الجسم المضاد تلطيخ، استخدم isotype الصحيح.
  2. إلى صورة LN الأربية، حقن 100 درجة مئوية من مزيج الأجسام المضادة تحت الجلد في الفخذ الداخلي (الشكل1A). بدلا من ذلك، حقن 50 ميكرولتر تحت الجلد من مزيج الأجسام المضادة في وسادة مخلب لصورة LN popliteal (الشكل2A). استخدام حساسة 1 مل حقن الأنسولين، (الأنسولين U-100) مع إبرة من حجم 0.30 مم × 13 ملم (30 مقياس × 1/2 بوصة).
    ملاحظة: تأكد من أن حقن تلطيخ LN الأربية تحت الجلد وليس العضل (أي م)، كما لن يتم استنزاف مزيج الأجسام المضادة بشكل صحيح إذا تم تنفيذ إدارة i.m. .
  3. لا تُدّس الحيوانات قبل حقن مزيج الأجسام المضادة.
  4. انتظر ما لا يقل عن 3 ح (dLN الأربية) و 12 ساعة (dLN popliteal) حقن آخر لإزالة الأعضاء.
  5. إذا لم يتم ملاحظة تسمية الخلايا LN تماما باستخدام الأصباغ الفلورية البوليمر كبيرة مثل البنفسجي اللامع أو الأزرق اللامع، واستخدام الفلوروفورالأصغر، بما في ذلك الفلورسين إيزوثيوسيانات (FITC)، PE وallophycocyanin (APC) كبديل.

3. إجراء جراحة لإزالة العقدة الليمفاوية استنزاف الأربية

  1. قتل الفئران باستخدام الاختناق CO2 تليها خلع عنق الرحم.
  2. تعطيل الفئران على خشبة المسرح الاكريليك مع شريط لاصق وتطبيق الزيوت المعدنية مع مسحة القطن على الجلد البطني لمنع ترسب الفراء حول الشق (الشكل1B). إزالة الفراء ليست ضرورية.
  3. إجراء شق خط الوسط باستخدام مقص الجراحة الدقيقة المنحنية (11.5 سم) وملقط الجراحة الدقيقة المنحنية (12.5 سم) في البطن من العانة إلى عملية xiphoid (الشكل1C).
  4. فصل عضلات البطن عن الجلد (الشكل1D).
  5. جعل الشقوق الجلدية الأفقية في الجزء العلوي والسفلي من خط الشق الرأسي لخلق اللوحات الجلد على جانب من الاهتمام (وفقا لجانب حقن مزيج الأجسام المضادة) ورفرف الجلد لتصور العقدة الليمفاوية (الشكل1E).
  6. شريط الجلد رفرف على لوحة الاكريليك (الشكل1F).
  7. إزالة العقدة الليمفاوية الاستنزاف الأربي باستخدام ملقط الجراحة الدقيقة المنحنية (الشكل1F). سوف تظهر العقدة الليمفاوية ككرة متحولة، وعادة ما تكون بيلوبولا، تحت الجلد.

4. إجراء عملية جراحية لإزالة العقدة الليمفاوية استنزاف popliteal

  1. قتل الفئران باستخدام الاختناق CO2 تليها خلع عنق الرحم.
  2. تعطيل الفئران في موقف عرضة على مرحلة الاكريليك مع شريط لاصق وتطبيق الزيوت المعدنية مع مسحة القطن في العجل والركبة (الشكل2A-D).
  3. إجراء شق خط الوسط في الساق من الكعب إلى الركبة (الشكل2E, F).
  4. فصل عضلات الساق عن الجلد (الشكل2F،G).
  5. فضح فوسا البوبليتيال (الشكل2G). سوف تظهر العقدة الليمفاوية البوبليتيك ككرة متحولة في الفوسا البوبليتيال.
  6. إزالة العقدة الليمفاوية popliteal باستخدام ملقط الجراحة الدقيقة المنحنية (الشكل2G).
  7. بدلا من ذلك، بدوره الماوس على موقف supine، والاقتراب من فوسا popliteal بين العضلة ذات الرأسين femoris وsemitendinosus لإزالة LN popliteal عن طريق إجراء شق خط الوسط في الساق من الكعب إلى الركبة تليها تفكك العجل العضلات من الجلد.
    ملاحظة: فوسا البوبليتيال هو الاكتئاب الضحلة تقع في الجزء الخلفي من مفصل الركبة. فتح بعناية لرؤية العقدة الليمفاوية popliteal.

5. إعداد العقدة الليمفاوية

  1. ضع العضو كله في طبق ثقافة مع أسفل زجاجي (35 مم × 10 مم) وإزالة الدهون التي تحيط بالجهاز باستخدام ملقط الجراحة الدقيقة المنحنية (الشكل1G-I والشكل 2H).
  2. مركزية الجهاز في منتصف الطبق (الشكل1J والشكل 2H).
  3. تغطية الجهاز مع جزء من مساحات مهمة حساسة ويبقيه غارقة مع درجة حرارة الغرفة المالحة 0.9٪ أو الفوسفات العازلة الحل (الشكل1K-M والشكل 2H).
    ملاحظة: ليس من الضروري غسل العقد الليمفاوية بعد الإزالة أو إجراء استخراج العقدة الليمفاوية في غطاء محرك السيارة.

6- الفحص المجهري البؤري (التصوير)

  1. وضع طبق بيتري في فتحة المجهر المقلوب (الشكل1N والشكل 2H).
  2. LNs صورة تحت المجهر البؤري (الشكل1O والشكل 2H).
  3. أولا، الحصول على التركيز الصحيح باستخدام الضوء التقليدي من المجهر البؤري مع 4X أو 10X الهدف. ثم تغيير من وظيفة الضوء إلى وضع الليزر.
    ملاحظة: إذا كان المجهر البؤري لا يحتوي على هدف 4X، يمكن الحصول على التركيز بشكل مثالي باستخدام الهدف 10x.
  4. ضبط قوة الليزر، والإزاحة وكسب باستخدام isotype ملطخة، غيرملطخة أو غير الفلورسنت عينة (الجدول 1) لإزالة autofluorescence وتلطيخ غير محددة من الأجسام المضادة الفلورية المسمى مثل تلك المستخدمة في الصور أظهرت في هذا مخطوطة (BV-421 المضادة CD4، BB515 المضادة CD19 وPE المضادة لF4/80).
  5. ضبط مواقف Z و XY، وذلك باستخدام micrometric وعربة، على التوالي، على منطقة الاهتمام في العقدة الليمفاوية.
  6. الحصول على صور تحت أهداف 4X و 10x و 20x مع التركيز على هيكل LN والتوزيع الخلوي. استخدم تعريف 1024 × 1024 بكسل.
    ملاحظة: الحصول على ما لا يقل عن خمس صور في مجالات مختلفة لكل هدف لكل الحيوان.
  7. تحليل الصور باستخدام برنامج صورة لفصل القنوات، وإضافة مقياس وألوان ذات أهمية، وإعادة بناء طريقة العرض ثلاثية الأبعاد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تُظهر هذه المخطوطة تقنيات لإزالة العقد الليمفاوية الأربية والبوغلية دون الإضرار بهيكلها بعد حقن الأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلورسنت لوصم مجموعات خلايا محددة في هذه الأجهزة (الشكل 1 والشكل 2) ).

مزيج قوي من الوسم المناعي لخلايا LN مع BV421 المضادة CD4 و BB515 المضادة CD19 وتحليل التصوير البؤري تعريف توطين الخلايا T (CD4 +) و الخلايا B (CD19 +) في الشبكات الانبية وpopliteal LNs. في كلا الجهازين، كانت محاطة بصيلات الخلايا B من قبل ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد عزز الجمع بين التصوير مع تقنيات أخرى، بما في ذلك البيولوجيا الجزيئية والنماذج المناعية عالية الأبعاد قدرتنا على التحقيق في الخلايا المناعية في سياقها الأصلي. في الواقع، في حين أن النهج الأخرى قد تتطلب هضم الأنسجة وعزل الخلايا - والتي يمكن أن تؤدي إلى فقدان سلامة الأنسجة - استخدام التصوير في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق يمنح ميزة كبيرة في التحقيق في مختلف أنواع الخلايا الفرعية بطريقة جغرافية3 , 16- وليس من المستغرب أن يزداد بسرعة توافر سلالات الفئران المعدل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI43458 إلى H.L.W.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BV421 مضاد CD4BD Horizon562891GK1.5 ؛ 0.2 مجم مل مل < sup > -1 < / sup>
BB515 مضاد CD19BD Horizon5645091D3 ؛ 0.2 مجم مل < سوب>-1< / sup>
BB515 الفئران IgG2a ، & كابا ؛ التحكم في النمط المتشابهBD Horizon564418R35-95 ؛ 0.2 مجم مل < سوپ > -1 < / sup>
BV421 ماوس IgG2b ، K التحكم في النمط المتنظيرBD Horizon562603R35-38 0.2 مجم مل < sup>-1< / sup> طبق
ثقافة CellviewGreiner-Bio62786135 × 10 مم مع قاع زجاجي
محاقن الأنسولينBD Plastipak-InsulinU-100
KimwipesKimtech Science Brand7557مقاس 21 × 20 سم / 100 ورقة لكل صندوق
ملقط منحني بالجراحة المجهريةWEP الأدوات الجراحيةحسب الطلب12.5 سم
مقص منحني للجراحةالمجهرية WEP أدوات جراحيةحسب الطلب11.5 سم
إبرةBD PrecisionGlide-30قياس & frac12 بوصة
نيكون Eclipse Te + A1R رأس متحد البؤرنيكون-محملة بخطوط ليزر رئيسية 4 (405 و 488 و 543 و 647 نانومتر)
PE مضاد F4 / 80BD Pharmigen565410T45-2342 ؛ 0.2 مجم مل < سوب >-1< / sup>
PE الفئران IgG2a ، & كابا ؛ التحكم في النمط المتشابهBD Pharmigen553930R35-95 ؛ 0.2 مجم مل < سوب>-1< / sup>
Zeiss LSM 710 مجهر متحد البؤرZeissمحملبخطوط ليزر رئيسية 4 (405 و 488 و 543 و 647 نانومتر)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
  2. Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
  3. David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
  4. Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151(2018).
  5. Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).
  6. Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
  7. Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
  8. McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
  9. Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
  10. Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
  11. Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
  12. Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
  13. Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
  14. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
  15. Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
  16. Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
  17. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  18. Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
  19. Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lymph Node ImagingEx Vivo Confocal MicroscopyFluorescent Antibody LabelingCellular LocalizationT Cell B Cell VisualizationLymph Node Structure AnalysisSubcutaneous Antibody InjectionMicrosurgery Lymph Node HarvestConfocal Microscopy ImagingImmunolabeling Analysis

Related Articles