تصور بنية العقدة الليمفاوية وتوطين الخلايا باستخدام الفحص المجهري السابق فيفيفو

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية لتصوير مجموعات الخلايا المختلفة في استنزاف الغدد الليمفاوية دون تعديلات في بنية الجهاز.

Abstract

العقد الليمفاوية (LNs) هي أجهزة منتشرة داخل الجسم، حيث يمكن للاستجابات المناعية الفطرية الاتصال مع المناعة التكيفية. في الواقع، يتم تداخل النفثالينات بشكل استراتيجي في مسار الأوعية اللمفاوية، مما يسمح بالاتصال الحميم لمستضدات الأنسجة مع جميع الخلايا المناعية المقيمة في LN. وهكذا, فهم التكوين الخلوي, توزيع, الموقع والتفاعل باستخدام خارج الجسم الحي كله LN التصوير سوف تضيف إلى المعرفة حول كيفية تنسيق الجسم الاستجابات المناعية المحلية والنظامية. يُظهر هذا البروتوكول استراتيجية تصوير في الجسم الحي بعد إدارة في الجسم الحي للأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلورسنت وتسمح بمنهجية قابلة للاستنساخ وسهلة الأداء باستخدام المجاهر البؤرية التقليدية وكواشف الأسهم. من خلال الحقن تحت الجلد من الأجسام المضادة، فمن الممكن تسمية مجموعات الخلايا المختلفة في استنزاف النفثالينات دون التأثير على هياكل الأنسجة التي يمكن أن تتضرر من قبل تقنية الفحص المجهري المناعي التقليدية.

Introduction

العقد الليمفاوية (LNs) هي أجهزة على شكل فراغ موجودة على نطاق واسع في جميع أنحاء الجسم مع وظيفة حاسمة من سد الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. LNs تصفية الليمفاوية من أجل تحديد الجسيمات الأجنبية والخلايا السرطانية لتركيب استجابة مناعية ضدهم^1. مستضد تقديم الخلايا (APCs), الخلايا T والخلايا B تعمل جنبا إلى جنب لتوليد الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد (الحصانة الفكاهية) والخلايا الليمفاوية السامة للخلايا (الحصانة الخلوية) للقضاء على الجسيمات الأجنبية والخلايا السرطانية². وبالتالي، فإن فهم ديناميات الخلايا المناعية الموجودة في الجهاز اللمفاوي سيكون له آثار هامة على تطوير اللقاح والعلاج المناعي للسرطان.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة الدائمة المعنية بالحيوانات في كلية الطب بجامعة هارفارد ومستشفى بريغام ومستشفى النساء، بروتوكول 2016N000230.

1- الفئران المستخدمة في التجربة

1. استخدام 8 أسابيع من الذكور والإناث الفئران على خلفية B6 لإدارة مزيج الأجسام المضادة.
2. استخدام CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT الفئران لتحديد ما إذا كان يمكن أيضا تطبيق التصوير LN كامل الجسم السابق على الفئران مراسل دون إدارة مزيج الأجسام المضادة وكذلك للتحقيق في وجود الخلايا أحادية النواة، بما في ذلك تقديم مستضد الخلايا والخلايا الفيغاسية، وتوزيعها في LN.
   ملاحظة: CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT الفئران مراسل لديها ....

Results

تُظهر هذه المخطوطة تقنيات لإزالة العقد الليمفاوية الأربية والبوغلية دون الإضرار بهيكلها بعد حقن الأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلورسنت لوصم مجموعات خلايا محددة في هذه الأجهزة (الشكل 1 والشكل 2) ).

مزيج قوي من الوسم المناعي لخلايا LN مع BV421 المضادة CD4 و BB515 المضادة CD19 وتحليل التصوير البؤري تعريف توطين الخلايا T (CD4 +) و الخلايا B (CD19 +) في الشبكات الانبية وpopliteal LNs. في كلا الجهازين، كانت محاطة بصيلات الخلايا B من قبل .......

Discussion

وقد عزز الجمع بين التصوير مع تقنيات أخرى، بما في ذلك البيولوجيا الجزيئية والنماذج المناعية عالية الأبعاد قدرتنا على التحقيق في الخلايا المناعية في سياقها الأصلي. في الواقع، في حين أن النهج الأخرى قد تتطلب هضم الأنسجة وعزل الخلايا - والتي يمكن أن تؤدي إلى فقدان سلامة الأنسجة - استخدام التصوير في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق يمنح ميزة كبيرة في التحقيق في مختلف أنواع الخلايا الفرعية بطريقة جغرافية^{3 , 16}- وليس من المستغرب أن يزداد بسرعة توافر سلالات الفئران المعدل.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 مضاد CD4	BD Horizon	562891	GK1.5 ؛ 0.2 مجم مل مل < sup > -1 < / sup>
BB515 مضاد CD19	BD Horizon	564509	1D3 ؛ 0.2 مجم مل < سوب>-1< / sup>
BB515 الفئران IgG2a ، & كابا ؛ التحكم في النمط المتشابه	BD Horizon	564418	R35-95 ؛ 0.2 مجم مل < سوپ > -1 < / sup>
BV421 ماوس IgG2b ، K التحكم في النمط المتنظير	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 مجم مل < sup>-1< / sup> طبق
ثقافة Cellview	Greiner-Bio	627861	35 × 10 مم مع قاع زجاجي
محاقن الأنسولين	BD Plastipak-Insulin		U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	مقاس 21 × 20 سم / 100 ورقة لكل صندوق
ملقط منحني بالجراحة المجهرية	WEP الأدوات الجراحية	حسب الطلب	12.5 سم
مقص منحني للجراحة	المجهرية WEP أدوات جراحية	حسب الطلب	11.5 سم
إبرة	BD PrecisionGlide-30		قياس & frac12 بوصة
نيكون Eclipse Te + A1R رأس متحد البؤر	نيكون	-	محملة بخطوط ليزر رئيسية 4 (405 و 488 و 543 و 647 نانومتر)
PE مضاد F4 / 80	BD Pharmigen	565410	T45-2342 ؛ 0.2 مجم مل < سوب >-1< / sup>
PE الفئران IgG2a ، & كابا ؛ التحكم في النمط المتشابه	BD Pharmigen	553930	R35-95 ؛ 0.2 مجم مل < سوب>-1< / sup>
Zeiss LSM 710 مجهر متحد البؤر	Zeiss	محمل	بخطوط ليزر رئيسية 4 (405 و 488 و 543 و 647 نانومتر)