مقالة منهجية

التفريد الحمض النووي باستخدام أورانج Thiazole بدلاً من اثيديوم بروميد أو الأصباغ البديلة

DOI:

10.3791/59341

⸱

مارس 31, 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Chemistry, Christopher Newport University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكول لاستخدامه thiazole البرتقالي للكشف عن الحمض النووي في جل التجارب التفريد. يسمح استخدام اللون البرتقالي thiazole القضاء اثيديوم بروميد، ويمكن أن يتحقق الأسفار الكشف بالأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحمض النووي جل التفريد استخدام [اغروس] أداة مشتركة في مختبرات البيولوجيا الجزيئية، السماح للفصل بين أجزاء الحمض النووي حسب الحجم. بعد الانفصال، وهو تصور الحمض النووي تلطيخ. يوضح هذا المقالة كيفية استخدام الحمض النووي ثيازولي البرتقالي وصمة عار. أورانج thiazole يقارن إيجابيا لأساليب المصبوغة شيوعاً، حيث أنها حساسة وغير مكلفة ومنفعل مع الضوء الأزرق (لمنع تلف العينة) أو الأشعة فوق البنفسجية وأكثر أماناً من اثيديوم بروميد. يمكنك التبديل مختبرات مجهزة بالفعل لتشغيل تجارب التفريد الحمض النووي باستخدام اثيديوم بروميد عموما الأصباغ مع أية تغييرات إضافية على البروتوكولات القائمة، باستخدام الأشعة فوق البنفسجية للكشف. بالإضافة إلى ذلك يمكن الكشف عن الضوء الأزرق لتجنب الضرر الذي عينة مع عامل تصفية المصدر وانبعاث ضوء أزرق. يمكنك التبديل مختبرات مجهزة بالفعل للكشف عن الضوء الأزرق ببساطة الأصباغ مع أية تغييرات إضافية للبروتوكولات الحالية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والغرض من هذا الأسلوب تحديد الحمض النووي في الهلام [اغروس] استخدام thiazole البرتقالي (إلى) للكشف عن الأسفار. بسبب صورتها السلامة منخفضة التكلفة ومواتية، قد ترى أورانج thiazole فائدة خاصة في مختبرات التدريس الجامعي ومختبرات البحوث أداء البيولوجيا الجزيئية، وبخاصة ليجيشنز والاستنساخ.

ويظل اثيديوم بروميد الصبغة الأكثر شيوعاً للكشف عن الحمض النووي في الهلام [اغروس]. هذا هو في المقام الأول لأنه يمكن الحصول على تكلفة زهيدة جداً ويتطلب فقط الإثارة مع الأشعة فوق البنفسجية للكشف. كلا اثيديوم بروميد و thiazole البرتقالي غير مكلفة، مع الكشف عن انخفاض حدود (1-2 نانوغرام/لين)1. هناك اثنين من العوائق الرئيسية اثيديوم بروميد، بيد أن يحسن أورانج thiazole.

أولاً، هو اثيديوم بروميد مطفر2 مع معالجة خاصة، والشحن، ومتطلبات التخلص منها، بينما thiazole البرتقالي أقل مطفرة (3 – 4 x مطفرة أقل في اختبار ايمز)3،4 ويمكن عموما التخلص منها مع النفايات الكيميائية المشتركة.

ثانيا، يتطلب اثيديوم بروميد ضوء الأشعة فوق البنفسجية للكشف. ثيازولي البرتقالي وبالمثل يمكن استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية إذا رغبت في ذلك، ولكن يمكن أيضا الكشف عن مع الضوء الأزرق. الأشعة فوق البنفسجية، بينما يشيع استخدامها، لديه بعض العيوب البارزة. أولاً، هو يلحق ضررا بجلد الإنسان والعيون. بينما يمكن استخدام الأشعة فوق البنفسجية بأمان من الفنيين المدربين، تلف الجلد أو العين عرضي (مماثلة وظيفيا لحروق الشمس) من الضوء مختبر الأشعة فوق البنفسجية ليست مستغربة خاصة مع العلماء الذين تنقصهم الخبرة. ثانيا، هو الأشعة فوق البنفسجية ضارة للغاية للحمض النووي عينات5، مما يقلل من نجاح تجارب المتلقين للمعلومات (مثل ربط والتحول)1،،من67. يسمح الكشف مع الضوء الأزرق (λالسابقين، ماكس = 510 نانومتر (488 نانومتر و 470 شمال البحر الأبيض المتوسط كما تظهر الإثارة قوية))، الذي لا يسبب تلف الجلد أو تلف الحمض النووي (على الرغم من أن أي ضوء مكثفة قد تضر بالعيون)، إلى حد كبير تقليل المخاطر التي يتعرض لها كل العلماء وفي العينة.

ليس البديل صبغة الفلورسنت فقط اثيديوم بروميد؛ ميزته هي التكلفة. أن اكتشفت في الثمانينات ك وصمة عار خلية شبكية8، وقد وجدت فائدة في عدد الأسفار على أساس الحمض النووي تجارب9،10،11،،من1213. حاليا يباع بالموردين متعددة. لهو مجمع الأصل إضافية، وأكثر تكلفة، والأصباغ التجارية الأزرق الضوء – لا يمكن اكتشافها، ويتصرف على نحو مماثل أثناء التفريد، باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق للكشف عن1. وعلاوة على ذلك، بينما الأصباغ الأخرى أكثر حساسية لتركيزات منخفضة جداً من الحمض النووي من أتبر أو إلى، لتجارب التفريد عامة، مثل هذه الصبغات باهظة في العديد من السياقات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد هلام

ملاحظة: لجل العامة التفريد البروتوكولات، انظر أيضا P.Y. لي، وآخرون. 14.

  1. مزيج [اغروس] (~ 1% w/v، يمكن أن تختلف النسبة المئوية لحجم معين فواصل) في المخزن المؤقت (حوالي 70 مل لجل المصغر (8 × 7 سم)). المخازن المؤقتة هي عادة تاي (تريس-خلات-يدتا، تريس، خلات 20 مم، 40 مم يدتا مم 1، درجة الحموضة حوالي 8.6) أو TBE (تريس-بورات-يدتا، 90 مم تريس، بورات 90 مم، 2 مم يدتا، الأس الهيدروجيني حوالي 8.3)).
  2. إضافة thiazole البرتقالي إلى تركيز نهائي 1.3 ميكروغرام/مل.
    1. حل thiazole البرتقالي في [دمس] لجعل حل أسهم 10,000 x (13 مغ/مل). بينما حساسة لا سيما الخفيفة، تخزين إلى في الظلام عندما لا تكون قيد الاستعمال. هذا الحل مستقر في درجة حرارة الغرفة ل ~ أشهر؛ يمكن تخزين طويل الأجل بتجميد مختبرين ([دمس] سوف تجمد في ثلاجة قياسية). من المؤكد أن تذوب تماما وريسوسبيند حلاً مجمدة قبل الاستخدام.
      ملاحظة: الهلام يمكن أيضا أن تكون ملطخة إلى بعد التفريد (راجع الخطوة 2، 6). وبينما لديه ملف تعريف أمان محسنة عبر اثيديوم بروميد، سلامة مختبر البيولوجيا الجزيئية القياسية ينبغي الحفاظ على الاحتياطات.
  3. الميكروويف الخليط من [اغروس] والمخزن المؤقت thiazole البرتقالي إلى أن يحل [اغروس] (حوالي 60 ثانية). هذه الخطوة هو يشار إلى "ذوبان". دوامة (5 ق) للمساعدة في حل إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: ليمكن أيضا أن تضاف بعد مايكرويف إذا فضلت.
  4. يسمح الحل [اغروس] لتبرد بإيجاز قبل سكب هلام الصب الأجهزة التي تحتوي على مشط مناسبة.
  5. يسمح الحل [اغروس] ترسيخ إلى هلام.

2. تحميل وتشغيل هلام

  1. ضع الجل في جهاز التفريد إذا لم يكن موجوداً بالفعل.
  2. إضافة قيد التشغيل المخزن المؤقت (تاي أو TBE أعلاه) لتغطية سطح الهلام.
  3. تحميل عينات الحمض النووي (عادة 10 ميكروليتر) باستخدام صبغة تحميل. وتشمل سلم تحجيم الحمض النووي للرجوع إليها.
  4. قم بإرفاق الغطاء واقطاب (يجب أن يكون تشغيل الهلام نحو اﻷنود أحمر (الإيجابية)).
  5. تطبيق الجهد (عادة ~ 100 فولت لجل المصغر، على الرغم من أن حجم جل قد تتطلب جهد معدلة لمنع إتلاف الهلام) حتى تحميل صبغ قد سافر على مسافة مناسبة (حوالي 4-7 سم لجل المصغر، على الرغم من أن المسافة قد تختلف اعتماداً على التطبيق الدقيق).
    ملاحظة: مثل اثيديوم بروميد والعديد من الأصباغ الحمض النووي-ملزمة أخرى، اتهم أورانج thiazole إيجابيا. ونتيجة لذلك، سيتم ترحيل هذه الأصباغ في الاتجاه المعاكس من اليكتروفوريسينج الحمض النووي. للعينات التي يتم تشغيل الآن أسفل الهلام لفصل المحسن، في نهاية المطاف سوف منفصلة الصبغ من شظايا أصغر من الحمض النووي، أدى إلى تلطيخ ضعيفة. وفي هذه الحالات، ينبغي أن الملون الجل كما في الخطوة 2، 6. وهذه الحالة ليست فريدة من نوعها إلى، أي إيجابيا يحمل صبغة عكسية يتفاعل مع الحمض النووي سوف يحمل هذا السلوك (بما في ذلك اثيديوم بروميد، إلى، وغيرها).
  6. إذا أن لم يتم إضافة المسبقة لجل الصب (الخطوة 1، 2)، ووصمة عار بغمر الهلام في المخزن المؤقت الذي يحتوي على ثيازولي البرتقالي.
    1. إعداد المخزن المؤقت كافية (تاي أو TBE) التي تحتوي على 1.3 ميكروغرام/مل thiazole البرتقالي تغطية الجل وامتصاص الجل مع الانفعالات لطيف حتى العصابات بشكل كامل تماما الكشف عن (حوالي 20 دقيقة).

3-التصور thiazole البرتقالي [اغروس] هلام (ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية)

  1. إزالة الجل من جهاز التفريد ومكان في ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية.
    تنبيه: هو إلحاق أضرار الأشعة فوق البنفسجية للجلد والعيون. من المؤكد أن ارتداء العين المناسبة (نظارات) وحماية الوجه (الوجه الدرع). يجب أن يكون بين أيدي قفازات ويجب أن تلبس اكمام طويلة.
  2. إذا رغبت في ذلك، المطلوب قص خارج نطاقات الحمض النووي من الجل (لمزيد من الهضم أو ربط، على سبيل المثال). فضح الهلام لضوء الأشعة فوق البنفسجية لأقصر مدة زمنية ممكنة خلال الختان. أضرار الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة (بغض النظر عن صبغ الحمض النووي) الحمض النووي.
  3. استخراج الحمض النووي من شريحة جل استخدام متاحة بطقم أو البروتوكول15.

4-التصور thiazole البرتقالي [اغروس] هلام (ترانسيلوميناتور الضوء الأزرق أو المصباح)

  1. إزالة الجل من جهاز التفريد ومكان في ترانسيلوميناتور الضوء الأزرق (~ 470 الطول الموجي نانومتر الانبعاثات كحد أقصى). بدلاً من ذلك، الصمام أزرق (~ 470 nm) المصباح يمكن أن يكون موجها إلى الهلام (أما من أعلى أو أسفل).
    ملاحظة: أن انخفاض استخدام ترانسيلوميناتور الضوء الأزرق مع اثيديوم بروميد حساسية، فالحمض الخلوي الصبغي الملون مع اثيديوم بروميد يمكن الكشف عن استخدام هذا البروتوكول الضوء الأزرق.
  2. استخدام عامل تصفية انبعاثات العنبر (~ 560 نانومتر الفلترات، أما نظارات أو ساحة) لتصفية الضوء الأزرق، تمكن التصور للأسفار من مجمعات الحمض النووي: thiazole البرتقالي.
    ملاحظة: دون تصفية الانبعاثات العنبر، فإنه من الصعب جداً الكشف عن عصابات الحمض النووي نظراً لكثافة من مصدر الضوء الأزرق الإثارة.
    تنبيه: على الرغم من أن الضوء الأزرق تفتقر إلى القدرة على حدة الضرر الأنسجة (المتناقضة الأشعة فوق البنفسجية)، لفترات طويلة التعرض للضوء الأزرق المكثف يمكن أن تضر العينين ويجب استخدام نظارات الانبعاثات العنبر أو تصفية.
  3. إذا رغبت في ذلك، قطع العصابات الحمض النووي المطلوب من الجل لمزيد من التطبيقات.
    ملاحظة: نظراً للضوء الأزرق لا ضرر الحمض النووي، فإنه لا يلزم سرعة قطع العصابات (مثل عند استخدام الأشعة فوق البنفسجية الإثارة في الخطوة 3، 2).
  4. استخراج الحمض النووي من شريحة جل استخدام متاحة بطقم أو البروتوكول15.

5. التقاط الصورة

  1. حدد الإعدادات المناسبة في الإثارة والانبعاثات في جهاز تصوير جل. الإثارة وانبعاث thiazole البرتقالي (λالسابقين، ماكس = 510 نانومتر (488 نانومتر و 470 شمال البحر الأبيض المتوسط كما تظهر الإثارة القوية، بالإضافة إلى الإثارة القوية في أطوال موجات الأشعة فوق البنفسجية)؛ λم = 527 نانومتر) متطابقة تقريبا إلى تجارية الأزرق الضوء – الاكتشاف المشترك الأصباغ، حيث قد يكون مسبقاً أدوات إعدادات عامل التصفية التي يمكن استخدامها.
    ملاحظة: بعض إعدادات عامل التصفية للأصباغ التجارية الأزرق-الضوء – يمكن كشفها فعلا استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية الضارة للإثارة، لذلك توخي الحذر إذا كان التصوير قبل الاستغناء عن العصابات. استخدام مصدر الضوء الأزرق إثارة إذا أمكن عند عصابات الحمض النووي سوف تكون اقتطعت بعد التصوير.
  2. في غياب نظام التصوير مع عوامل التصفية المناسبة، وضع عامل تصفية العنبر بين الكاميرا ومصدر الإثارة هلام/الزرقاء-الضوء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ثيازولي البرتقالي تمكن من كشف الحمض النووي، دون استخدام اثيديوم بروميد ودون استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية تضر بالحمض النووي. اثيديوم بروميد المعروف جيدا أن تكون مطفرة، حتى القضاء عليه من المعمل قد يكون مفيداً. أضرار الحمض النووي الأشعة فوق البنفسجية ويقلل كفاءة التحويل إلى حد كبير، بينما الضوء الأزرق لا ضرر الحمض النووي. حدود الكشف متشابهة بين اثيديوم بروميد والبرتقال ثيازولي وصبغ الحمض النووي تجارية المشتركة، والأزرق-الضوء – يمكن كشفها (الشكل 1، انظر الجدول للمواد)، مع ح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اثيديوم بروميد أداة قياسية في مختبر البيولوجيا الجزيئية، وعلى الرغم من سمية معروفة منذ أمد بعيد. أنه يعاني أيضا من التي تحتاج إلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية، مما يلحق الضرر الحمض النووي كما أنه يتم اكتشاف. ثيازولي البرتقالي يوفر بديلاً غير مكلفة اثيديوم بروميد، فضلا عن الأصباغ التجارية مفيدة ولكنها مكلفة.

وبالتالي فوائد البرتقال thiazole شقين. أولاً، يمكن ببساطة استخدام أورانج ثيازولي كبديل اثيديوم بروميد. يمكن إعداد المواد الهلامية مطابق تماما أتبر، مع إلى استبداله كوصمة عار (الخطوة 1، 2). حدود...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل أموال بدء التشغيل إلى لجنة من جامعة نيوبورت كريستوفر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-سجل سلم الحمض النووينيو إنجلاند BiolabsN0469S
Agarose (درجة التحليل الجيني)فيشرBP1356-100
مصباح يدوي بالضوء الأزرقWAYLLSHINE (أمازون)WAYLLSHINE أزرق قابل للتطوير LED
ChemiDoc MPBiorad1708280
DMSOSigma-AldrichD8418
إيثيديوم بروميدفيشرBP1302-10للمقارنة ، ليس ضروريا لجهاز جل البروتوكول
(Owl Easy Cast)طقم استخراج جل Thermo ScientificB1A
Qiagen QiaquickQiagen28704
نظارات عرض التصوير الآمنInvitrogenS37103ضروري لاستخدام مصباح يدوي للضوء الأزرق.*
SafeImager 2.0 (مصباح الضوء الأزرق)يمكن استخدام مصباح يدوي بالضوء الأزرقInvitrogenG6600
SYBR SafeInvitrogenS33102للمقارنة ، ليس ضروريا للبروتوكول
TAE (Tris-Acetate-EDTA)Corning46-010-CM
Thiazole orangeSigma-Aldrich390062
* يتم تضمين النظارات أيضا مع Invitrogen G6600
كبديل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
  2. McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
  3. Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
  4. Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. Molecular Probes, Inc. , USA. WO/2005/0333342 (2005).
  5. Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
  6. Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157(1988).
  7. Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
  8. Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
  9. Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
  10. Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
  11. Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
  12. Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
  13. Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
  15. Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة