عالية الإنتاجية الجر قوة الفحص المجهري باستخدام PDMS يكشف عن الآثار التي تعتمد على الجرعة من تحويل عامل النمو-β على الانتقال الظهاري إلى Mesenchymal

Summary

نحن نقدم عالية الإنتاجية الجر قوة الجر تسرب ملفقة مع مطاط السيليكون (PDMS). هذا الفحص الجديد هو مناسبة لدراسة التغيرات المادية في انقباض الخلايا خلال مختلف العمليات البيولوجية والطبية الحيوية والأمراض. نحن نبين فائدة هذه الطريقة عن طريق قياس زيادة تعتمد على TGF-β في الانقباض خلال الانتقال الظهاري إلى mesenchymal.

Abstract

إن الانقباض الخلوي ضروري في جوانب متنوعة من البيولوجيا، وعمليات القيادة التي تتراوح بين الحركة والانقسام، وتقلص الأنسجة والاستقرار الميكانيكي، وتمثل عنصرا أساسيا في الحياة الحيوانية متعددة الخلايا. في الخلايا الملتصقة ، ينظر إلى تقلص الacto-myosin في قوى الجر التي تمارس الخلايا على الركيزة الخاصة بهم. يظهر خلل تنظيم الانقباض الخلوي في عدد لا يحصى من الأمراض، مما يجعل الانقباض هدفا واعدا في نُهج التشخيص المتنوعة باستخدام الفيزياء الحيوية كمقياس. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستند الاستراتيجيات العلاجية الجديدة على تصحيح الخلل الواضح في انقباض الخلايا. غير أن هذه التطبيقات تتطلب تحديدا ً كمياً مباشراً لهذه القوات.

لقد قمنا بتطوير مجهرية قوة الجر القائمة على الاستومر سيليكون (TFM) في شكل مواز متعدد الآبار. إن استخدامنا لمطاط السيليكون، وعلى وجه التحديد بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS)، بدلاً من مادة هيدروجيل بوليأكريلاميد (PAA) المستخدمة عادة ً، يمكننا من تقديم ركائز قوية وخاملة مع حياة الجرف غير المحدودة التي لا تتطلب أي ظروف تخزين متخصصة. وعلى عكس النهج المستندة إلى نظام إدارة الأداء المستندة إلى أعمدة والتي لها معامل في نطاق GPa، فإن نظام إدارة الأداء المستخدم هنا متوافق جداً، حيث يتراوح بين 0.4 كيلوباسكال تقريباً و100 كيلوباسكال. نحن ننشئ منصة عالية الإنتاجية لTFM عن طريق تقسيم هذه الركائز متجانسة كبيرة مكانيا في الآبار المستقلة كيميائيا، وخلق منصة متعددة الآبار لفحص قوة الجر التي تتوافق مع النظم القائمة متعددة الآبار.

في هذه المخطوطة، نستخدم نظام قوة الجر متعدد الآبار لفحص الفترة الظهارية إلى الانتقال Mesenchymal (EMT)؛ نحن نحث EMT في خلايا NMuMG عن طريق تعريضها لTGF-β، وتحديد التغيرات البيوفيزيائية خلال EMT. نحن نقيس الانقباض كدالة للتركيز ومدة التعرض TGF-β. النتائج التي توصلنا إليها هنا تبين فائدة TFM موازية في سياق الفيزياء الحيوية المرض.

Introduction

إنقباض Acto-myosin هو عنصر أساسي في ميكانيكا الخلايا النشطة، مما يؤثر على سلوكيات الخلايا من الحركة والانتشار إلى تمايز الخلايا الجذعية. في الأنسجة، الانقباض يدفع النشاط من الفصل القطبي في تكوين الأجنة، إلى انقباض مجرى الهواء والنشاط القلبي. بشكل حاسم، لتوليد التوتر، يجب أن تلتزم الخلايا أولا ً ببيئتها خارج الخلية. في القيام بذلك، وهذا الانقباض يولد قوى الجر على محيطهم. وقد ظهرت مجهرية قوة الجر (TFM) في العديد من الأشكال كوسيلة لتحديد كمية هذه القوى من خلايا متنوعة في ظل ظروف مختلفة.

وقد شهد مجال TFM اتساعا ً استثنائياً للابتكار والتطبيق، وقد مهدت النتائج الطريق لآفاق جديدة في علم الأحياء، والتي تتضمن الميكانيكا والقوى المادية. بدءا من ركائز سيليكونالتجاعيد 1، وقد طبق الباحثون تقنيات مختلفة لقياس قوى الجر الخلية. وقد تحسنت هذه النهج باستمرار ووصلت الآن إلى مستوى من القرار بشأن ترتيب عدة ميكرون². ومع ذلك، ظهرت مشكلة رئيسية واحدة، وهي صعوبة في خلق ركائز من معامل منخفض بشكل مناسب باستخدام السيليكون المتاحة. للتحايل على هذه المشكلة، تم اعتماد polyacrylamide كبديل بسبب سهولة إنشاء ركائز على ترتيب 1-20 كيلوباسكال³. نفذنا مؤخرا السيليكون متوافقةجدا في TFM 4، مما يسمح لنا لتلفيق نفس مجموعة من معامل كما polyacrylamide، ولكن مع مزايا السيليكون خاملة وقوية.

وقد مكنت نُهج TFM من الاكتشافات الميكانو البيولوجية القيمة، ومع ذلك، فإن القصور المستمر هو تعقيدها، وغالباً ما تقصر استخدامها على الباحثين في تخصصات الهندسة أو العلوم الفيزيائية. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى المعايرة التفصيلية والحسابات الصعبة المطلوبة لتحديد مقدار الانقباض. وثمة تحد هام آخر يتمثل في أن أساليب TFM منخفضة الإنتاجية إلى حد كبير، وبالتالي فهي غير مناسبة لدراسة العديد من الظروف أو السكان المختلفة في وقت واحد⁵. وقد شكل ذلك اختناقا، مما أعاق نقل TFM من إعداد الفيزياء الأحيائية المتخصصة إلى تطبيقات بيولوجية ودوائية أوسع نطاقا.

لقد قمنا مؤخرًا بتطوير لوحة TFM متعددة الآبار، والتي تسمح للباحثين بموازاة قياسات TFM الخاصة بهم من أجل تحديد كمية أسرع لمقاييس الانقباض، مع استكشاف تأثير المركبات المختلفة وأيضًا باستخدام الكواشف الأقل⁴ . ولهذه المنهجية فائدة واسعة في مختلف الدراسات الآلية، من تقييم آثار المركبات على النشاط الخلوي، إلى التحديد الكمي للتغيرات العقدية في التمايز أو المرض.

أحد مجالات البحوث الطبية الحيوية التي سوف تستفيد كثيرا من TFM هو دراسة كيفية تأثير العظة المادية على الأنماط الظاهرية الخبيثة للخلايا السرطانية. يتميز الانبثاث، المسؤول عن 90٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان، بالخلايا السرطانية التي تغادر موقع الورم الأصلي واستعمار موقع ثانوي. للخلايا للهجرة من خلال الأنسجة وتمرير داخل وخارج نظام الأوعية الدموية، يجب أن تغير جذري أشكالها للضغط من خلال هذه الحواجز المادية في حين توليد قوى كبيرة لسحب طريقها على طول مصفوفة خارج الخلية أو التحرك بين غيرها من الخلايا. يتم نقل هذه القوى إلى الركيزة من خلالتفاعلات التصاق بؤري 2،^3،ويمكن قياسها كميا باستخدام TFM. وفي حين أن السرطانات متنوعة من الناحية البيوكيميائية بشكل استثنائي، مع اتساع نطاق الطفرات المعروفة وتغيرات البروتين، فقد لوحظت بعض التغيرات الفيزيائية الشائعة؛ في مجموعة متنوعة من السرطانات، بما في ذلك سرطان الثدي والبروستاتا والرئة، وقد ثبت الخلايا النقيلية لممارسة 2-3 مرات قوى الجر من الخلايا غير النقيلية^6،7،8. وتشير هذه النتائج إلى أنه قد يكون هناك ارتباط قوي بين التقدم النقيلي وقوى الجر التي تمارسها الخلايا. ومع ذلك، من الصعب دراسة التغييرات التفصيلية التي تعتمد على الوقت في الانقباض.

الانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) هو عملية حيث الخلايا تقليل الالتصاق الخلايا المجانبة- وضيق تقاطع بوساطة الخلية، وتصبح أكثر هجرة والغازية. بالإضافة إلى الوظائف الفسيولوجية التي تشمل التئام الجروح والعمليات التنموية، EMT هو أيضا عملية استغلالها خلال الانبثاث، مما يجعلها نموذجا مفيدا لدراسة هذه العملية. باستخدام TGF-β، يمكننا حث EMT في الخلايا الظهارية الثديية murine (NMuMG)⁹ لتحديد التغيرات المادية مباشرة خلال هذا التحول، وتميز الوقت والآثار المعتمدة على الجرعة من TGF-β على EMT وتقلص الخلايا. في هذه المقالة، نقوم بتوضيح فائدة هذا النهج عن طريق قياس التغيرات في الانقباض أثناء EMT المستحثة.

Protocol

ملاحظة: سيقوم البروتوكول التالي بتوجيه الباحثين في تصنيع واستخدام طبق TFM متعدد الآبار الموضح في الشكل 1.

1. إعداد ركائز سيليكون PDMS

1. إعداد خليط مطاط السيليكون PDMS على أساس خليط مركب من اثنين من مجموعات المتاحة تجاريا.
   1. إضافة الجزء ألف والجزء باء من مجموعة PDMS (على سبيل المثال، GEL-8100، انظر جدولالمواد) في نسبة الوزن 1:1 في أنبوب 50 مل.
      ملاحظة: يتم خلط الخليط على الدوار بسرعة بطيئة بما فيه الكفاية لتدفق الخليط ذهابا وإيابا خلال الثورة لضمان الخلط الكامل.
   2. إضافة الكمية المطلوبة من عامل علاج لمعامل المطلوب من الركيزة.
      ملاحظة: كمية عامل المعالجة التي سيتم إضافتها إلى الخليط يعتمد على معامل المطلوب من الركيزة ويمكن أن تتراوح عادة من 0.1٪ إلى 1.8٪. يرجى الرجوع إلى الجدول 1 والشكل 3 للحصول على دليل لتركيزات محددة من الوصلة المتقاطعة ومعامل التضمين الناتج عن ذلك.
   3. خلط صياغة على الدوار لمدة 30-45 دقيقة. ضمان دوران بطيء بما فيه الكفاية لخلط شامل.
2. الطبقة السفلية: طلاء ركائز PDMS على الشريحة الزجاجية
   1. ضع تشاك المبني حسب الطلب الموضح في الشكل 2 على طبقة الدوران. تنظيف الزجاج مع الإيثانول أو isopropanol، وتجف مع مسح ة خالية من الوبر. وضع الشريحة الزجاجية في تشاك وبدوره على فراغ لعقد الشريحة في مكانها.
   2. تطبيق PDMS غير المعالجة حوالي 1 سم من الحواف والعمل في نحو المركز. تطبيق ما يكفي (3-4 مل) PDMS لضمان تغطية السطح كله.
      ملاحظة: للتأكد من أن PDMS ينتشر بالتساوي على سطح الزجاج، قد يكون تلميح ماصة مفيدة لنشر خليط PDMS من المركز إلى الحواف.
   3. تدور الزجاج مع خليط PDMS على معطف تدور مع البروتوكول التالي.
      1. لنشر PDMS غير المعالجة على الشريحة، تسريع في 50 دورة في الدقيقة / ثانية من 0 إلى 200 دورة في الدقيقة. عقد في 200 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
      2. لتحقيق طبقة PDMS سميكة 100 متر، تسريع في 50 دورة في الدقيقة / ثانية إلى 300 دورة في الدقيقة وعقد لمدة 1 دقيقة في 300 دورة في الدقيقة. سوف سمك المطلوب مختلفة غير 100 درجة مئوية تتطلب قيم سرعة محددة.
      3. لإزالة، يتباطأ عند 50 دورة في الدقيقة/ ث إلى 0 دورة في الدقيقة. تعطيل فراغ وإزالة الشريحة المغلفة، مع الحرص على عدم لمس السطح المغلفة.
         ملاحظة: من المهم تضمين خطوات التسارع والتباطؤ لضمان سطح مستمر سلس.
         تحذير: للتأكد من أن العينة لا تطير قبالة تشاك، يجب استخدام حامل حسب الطلب لعقد الشريحة، وليس الاعتماد ببساطة على فراغ وتشاك شقة القائمة. وترد تفاصيل ومواصفات هذا حامل في الشكل2.
   4. ضع العينة المغلفة الدورانفي الفرن في درجة الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة (100 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: يجب أن يكون سطح الفرن حيث يتم وضع العينة صلبة (أي ليس رف سلك) ومستوى السطح لضمان التدفئة موحدة وسمك العينة. لوحة السيراميك أو الصلب يجعل سطح مثالي.
3. أعلى طبقة حبة
   1. إضافة محلول حبة في نسبة مناسبة لخليط PDMS المتبقية.
      ملاحظة: تعتمد هذه النسبة على تركيز محلول حبة الأسهم وكثافة الخرزة المطلوبة على العينة. القيم النهائية النموذجية هي 9.2 × 10¹¹ الخرز / مل و 0.05-0.2 الخرز / ميكروم²، وفائض من الخرز هو عموما أفضل من كمية غير كافية.
   2. اخلط محلول الخرزة مع أجهزة PDMS غير المعالجة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق وضع الأنبوب على الدوار لمدة 30 دقيقة تقريبا، دوامة لمدة 1-2 دقيقة، أو سونيكيشن لمدة 30 دقيقة. ويمكن الجمع بين هذه الأساليب.
      ملاحظة: في تطبيقنا، نجد أن sonication فعالة في كسر المجاميع حبة، والتناوب فعالة في الاختلاط. قد تتجمع الخرزات الائتمانية المركبة في التخزين. قبل استخدامها، قد يتم إعادة تعليقها في الهكهكانات وsonicated. إذا كان هناك مجاميع كبيرة كبيرة، يمكن للمرء تصفية تعليق حبة من خلال مرشح حقنة 5 ميكرومتر. هذه الخطوة الترشيح هو اختياري; فإنه يساعد على معطف العينة مع الخرز monodispersed، ولكن قد تضيع جزء كبير من الخرز في مرشح.
   3. إخراج الشريحة من الفرن، والسماح لتبرد لدرجة حرارة الغرفة، ووضعها على الدوار المغطي.
   4. إضافة 3-4 مل من حبة وخليط PDMS غير المعالجة على سطح العينة المغلفة.
      ملاحظة: الخليط مع الخرز المضافة هو أقل لزجة بسبب الهكهكة. تأكد من عدم لمس سطح الركيزة لأنها قد تضر الركيزة PDMS المغلفة بالفعل. بالإضافة إلى ذلك، قد خليط حبة في البداية لا الرطب السطح. الحرص على أن الخليط لا تتدفق على الفور قبالة سطح PDMS الشفاء.
   5. قم بتدوير العينة مع البروتوكول التالي.
      1. لنشر حبة وخليط PDMS غير المعالجة، وتسريع في 100 دورة في الدقيقة / ثانية من 0 إلى 500 دورة في الدقيقة؛ عقد في 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
      2. لتحقيق طبقة رقيقة من دزجزءا من PDMS (~ 1 ميكرومتر)، وتسريع في 200 دورة في الدقيقة / ثانية من 500 إلى 5000 دورة في الدقيقة؛ عقد في 5000 دورة في الدقيقة لمدة 10 s.
      3. لإزالة، يتباطأ عند 100 دورة في الدقيقة/ ث إلى 0 دورة في الدقيقة. تعطيل فراغ وإزالة الشريحة المغلفة، مع الحرص على عدم لمس السطح المغلفة.
   6. ضع العينة المغلفة الدورانية في الفرن على درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: درجات الحرارة فوق 100 درجة مئوية أو فترات أطول من 1 ساعة يمكن أن تقلل من الفلورة حبة. تأكد من تعيين درجة حرارة الفرن إلى 100 درجة مئوية وليس أعلى.
   7. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. لتخزين العينة، قم بتغطية السطح لتجنب التعرض للغبار والضوء. تأكد من أن لا شيء يمس السطح. العينة هي الجرف مستقرة في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى.
4. تجميع لوحة
   1. إضافة الجزء ألف (قاعدة) والجزء باء (عامل علاج، على سبيل المثال، Sylgard) من مجموعة الاستومر PDMS في نسبة الوزن 10:1 في أنبوب 50 مل.
   2. يُمزج المزيج على الدوار لمدّة 30-45 دقيقة.
      ملاحظة: للوحة واحدة، مزيج 5 مل من قاعدة مع 0.5 مل من عامل علاج. يمكن إضافة ما يصل إلى 1 مل من الهكهكة للحد من لزوجة الخليط.
   3. يوضع الخليط في الجزء السفلي من المقسم ويُوزّع المزيج.
      ملاحظة: يجب وضع الفاصل رأساً على عقب.
   4. وضع الركيزة على مقسم رأسا على عقب.
   5. ضع العينة رأساً على عقب في الفرن عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
   6. إخراج عينات من الفرن وتنظيف الجزء السفلي من الزجاج مع الإيثانول 70٪ أو isopropanol لإزالة أي بقايا PDMS.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. لتخزين العينة، ضع غطاء على الركيزة ولف الجهاز في رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء. العينة هي الجرف مستقرة في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى. الفاصل المستخدم في هذه الطريقة هو في شكل 96 جيدا; ومع ذلك، قد يستخدم الباحثون أشكال أخرى (384-well، 2-well، 4-well، 8-well، وما إلى ذلك) اعتمادا على الإعداد اتّساح التجارب المرغوبة وتوافر الهياكل الفاصلة. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين.

2. وظائف السطح

1. حل 80 ميكرولتر من aliquot Sulfo-SANPAH في 40 مل من 0.1 M HEPES العازلة (درجة الحموضة 7-9).
   ملاحظة: إعداد aliquots Sulfo-SANPAH عن طريق حل 100 ملغ من مسحوق سولفو-سانباه في 2 مل من كبريتيد ثنائي الميثيل المعقمة (DMSO). إعداد 0.1 M HEPES العازلة عن طريق تخفيف 50 مل من HEPES في 450 مل من المياه المعقمة منزوعة الأيونات وتصفية من خلال مرشح المسام 0.22 m.
2. إضافة 200 درجة مئوية من محلول Sulfo-SANPAH المخفف لكل بئر من لوحة 96 جيدا.
3. عرض لوحة للأشعة فوق البنفسجية (300-460nm) ضوء على مسافة مناسبة والمدة.
   ملاحظة: بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، يجب أن يكون لون الحل أغمق. تعتمد مسافة التعرض للأشعة فوق البنفسجية ومدتها على قوة مصباح الأشعة فوق البنفسجية. في تطبيقنا، ونحن فضح لمدة 10-15 دقيقة على مسافة 5 سم.
4. إزالة محلول Sulfo-SANPAH من الآبار وإضافة 200 درجة مئوية من 5 ميكروغرام / مل محلول فيبرونكتين إلى كل بئر.
   ملاحظة: يمكن استخدام البروتين المحدد من قبل الباحث لطلاء السطح. بعض البروتينات شائعة الاستخدام هي الكولاجين, فيبرونيكتين, ولامينين. لقد وجدنا Sulfo-SANPAH لتكون الطريقة الأكثر فعالية، وتنظيف البلازما في حين يتم تثبيط في بعض الأحيان توظيف في PDMS كما أنه يخلق طبقة ثاني أكسيد السيليكون ويضر بشكل واضح على السطح.
5. احتضان لوحة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: طرق حضانة مختلفة يمكن تطبيقها اعتمادا على البروتين المستخدم للطلاء.
6. إزالة محلول الفيبرونكتين وغسل كل بئر مع الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) مرتين.
7. ضع غطاء على العينة.
8. إضافة 200 درجة مئوية من PBS إلى كل بئر.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. يمكن تخزين العينات المغلفة فيبرونيكتين في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.

3. الأشعة فوق البنفسجية التعقيم

1. تعقيم العينة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: قد تؤثر أوقات التعرض للأشعة فوق البنفسجية الأطول بشكل سلبي على الفلورة الخرزة. ويجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في ظل ظروف معقمة.

4. خلية ثقافة

1. إزالة PBS من كل بئر وإضافة 200 μL من الخلايا المعلقة في وسائل الإعلام الثقافة إلى كل بئر.
   1. لوحة الخلايا في كثافة الخلية المطلوبة. تعتمد كثافة الخلايا على التجربة المطلوبة. بالنسبة لدراسات الخلايا الواحدة، يجب أن تكون الخلايا على الأقل 50 ميكرومتر وبصرف النظر عن الخلايا القريبة من حواف نافذة التصوير لا ينبغي أن تدرج في قياس TFM. بالنسبة للخلايا أحادية الطبقة، يجب أن يكون لنافذة التصوير حقل العرض المغطى بطبقة من الخلايا.
   2. إعداد وسائل الإعلام ثقافة النمو الكامل لخلايا NMuMG عن طريق استكمال DMEM مع 5٪ FBS، 10 MM HEPES، 10 ميكروغرام / مل الأنسولين، 1٪ بنسلين-ستربيتوميسين، 1 مليون لام الجلوتامين، و 0.5 ميكروغرام / مل أمفوتيريسين B.
   3. إعداد مخزون الأنسولين عن طريق إعادة تشكيل في المياه الحمضية (2.5 مل من حمض الخليك الجليدي في 130 مل من الماء منزوع الأيونات) إلى تركيز 10 ملغ / مل. تخزين حل الأسهم في 4 درجة مئوية. انتظر حتى يصبح الحل واضحًا، ثم قم بتصفية فلتر المسام بـ 0.22 ميكرومتر.
2. إضافة TGF-β
   1. لإعداد الأسهم TGF-β، حل 2 ميكروغرام من TGF-β في 100 ميكرولتر من 10 مل من حمض الستريك 10 مل (درجة الحموضة 3.0) وتعقيم فلتر مع المسام 0.22 ميكرومتر. دوامة الأنبوب وaliquot في وحدات التخزين المطلوبة. تخزين aliquots في -80 درجة مئوية.
   2. إضافة 1.5 ميكرولتر من TGF-β حل الأسهم إلى 10 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية كاملة لتشكيل وسائل الإعلام ثقافة الخلية مع تركيز TGF-β النهائي من 3 نانوغرام / مل.
      ملاحظة: لجعل 10 مل درجة الحموضة 3.0 حامض الستريك، تخفيف الحمض في الماء وضبط درجة الحموضة إلى 3.0 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك.

5 - الحصول على البيانات

1. لكل موقف، والحصول على صورة واحدة على الأقل من الجسيمات الائتمانية والخلايا. التركيز على طبقة حبة.
   ملاحظة: يجب تحسين حجم البكسل استناداً إلى حجم الجسيمات الائتمانية وطريقة معالجة الصور المستخدمة. في هذا التطبيق، يستخدم المؤلفون هدف NA 10x 0.4، ويتم الحصول على الصور بدقة 1024 × 1024، مع 455 نانومتر/بكسل. بشكل عام، فمن المفيد الاحتفاظ بقرار من ما لا يقل عن 1-5 بكسل لكل حبة. هنا، والخرز هي polydisperse ولها حجم الفردية من 300-500 نانومتر. من الأهمية بمكان أن تكون الخرزات الائتمانية الفلورية في التركيز على الصور لاستخدامها في حسابات TFM. وينبغي إعطاء الأولوية للتركيز ونوعية التصوير من الخرز على تصوير الخلايا نفسها. وينبغي ألا يكون هناك حديث متقاطع بين قنوات مختلفة، ولا سيما أي فلورة لا من الخرز الائتماني الذي يظهر في أطياف التصوير من الخرز.
2. وبمجرد تسجيل جميع المواقف ذات الأهمية، أضف حل مفرزة لكل بئر للحصول على صور مرجعية خالية من القوة للجسيمات الائتمانية.
   1. لإعداد حل مفرزة الخلية، مزيج محلول مائي يحتوي على 2٪ تريتونإكس-100، 50 مليون متر أزيد الصوديوم، و 500 مل هيدروكسيد البوتاسيوم.
      ملاحظة: يتم توفير ما سبق كمثال على حل مفرزة فعالة. ويمكن استخدام حلول مفرزة مختلفة حسب تقدير الباحثين لفصل الخلايا عن سطح الركيزة.

6. تحليل الصور

1. إجراء تحليل الصورة المناسب ة حسب الرغبة.
   ملاحظة: تم تطوير برامج التحليل داخلياً. يمكن إجراء تحليل الصور باستخدام برامج أو برامج مصنوعة خصيصًا على الإنترنت.

7. حبة التوليف

ملاحظة: يستند البروتوكول التالي إلى طريقة التوليف التي وصفها كلاين وآخرون¹⁰.

1. تحت غطاء الدخان، قم بإعداد قارورة ثلاثية الرقبة مع مكثف الجزر المبرد بالماء.
   تحذير: إعداد توليف في غطاء الدخان الكيميائية جيدة التهوية.
2. إضافة 0.5 مل من مثبت PDMS والفلوروفور إلى قارورة.
3. تجهيز عنق واحد مع الحاجز المطاطي مع إبرة مدخل النيتروجين وإبرة منفذ وتجهيز الرقبة الأخرى مع الحاجز المطاطي لإضافة كاشف مع حقنة.
4. أضف 100 مل من الهكهكة اللامائية في 250 مل إلى القارورة وأضف شريط تحريك مغناطيسي صغير.
5. ضع القارورة في حمام الزيت المعدني عند درجة حرارة 75 درجة مئوية وطهرها بغاز النيتروجين لمدة 1 ساعة.
6. أضف 6 مل من ميثيل ميثاكريلات إلى قارورة سفلية مستديرة بـ 25 مل.
7. إضافة 0.100 غرام من 2،2 '-azobisisobutyronitririle (AIBN) إلى قارورة أسفل جولة وتطهير الخليط مع غاز النيتروجين لمدة 1 ساعة.
   ملاحظة: مسح ميثيل أميثاكريلات من خلال عمود معبأة مسبقا لإزالة مثبطات قبل الاستخدام. يُضاف خليط ميثيل اميثاكريلات وAIBN إلى قارورة ثلاثية الرقبة.
8. الحل في البداية يصبح غائما ويتحول حليبي. اسمحوا رد الفعل تشغيل لمدة 3 ح بعد أن يصبح الحل غائم.
9. بعد 3 ساعة، ضع القارورة في حمام ماء جليدي.
10. فراغ تصفية الحل مع ورقة مرشح الخشنة.
11. طرد مركزي فيلترات وإعادة تعليق الجسيمات في الهكهكة.
    ملاحظة: يعتمد حجم الهكهسون الذي سيتم إضافته على التركيز المطلوب لحل الخرزة. سونيكيشن يسهل إعادة تشتت جزيئات حبة في محلول الهكهكة. الخرز التي تنتجها المؤلفين لها أقطار polydisperse من حوالي 300-500nm. بسبب استخدام تتبع نمط الترابط المتبادل لتحديد الإزاحات، لا يلزم الخرز أحادي التشتت.

8- بروتوكول قياس علم الرهيولوجيا

ملاحظة: علم الأنسجة غير مطلوب لكل باحث أو تجربة، ولكن من الضروري تحديد معامل للتركيبات الجديدة من PDMS. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم مقياس القص لقياس آثار كروسلينكر، والتردد، والضغط على معامل عينات PDMS. وتبعاً للأدوات والخبرات المتاحة، يمكن أيضاً قياس معامل الغيرة باستخدام العديد من نُهُج التحليل الميكانيكي الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، قد يختار الباحثون الذين يستخدمون هذا البروتوكول استخدام معاملنا المنشور الوارد في الجدول 1والشكل 3 والشكل 4.

1. استخدام مقياس الرطوبة مع 25 ملم قطرها هندسة لوحة موازية. ويمكن استخدام الجيومتريات الأخرى.
2. تهيئة النظام ومعايرة الجهاز ونظام القياس (لوحة موازية، د = 25 ملم). بعد قياس الفجوة الصفرية، ابدأ في تحميل نموذج PDMS.
3. بمجرد أن تم خلط الاستومر PDMS ووكيل الربط المتبادل، pipet الخليط على لوحة أسفل مقياس الرطوبة.
   1. نقل المغزل إلى أسفل للاتصال تماما الجزء العلوي من عينة PDMS.
   2. تقليم بعناية عينة محملة الزائدة من لوحة أسفل.
4. في اختبار الاجتياح سلالة، وتطبيق سلالات متزايدة لكل تكوين مع كثافة مختلفة عبر الربط لضمان هيكل البوليمر لا يزال في نظام لزج خطي خلال جميع قياسات القص.
   ملاحظة: قيم السلالة ذات الصلة لدراسات الخلايا عادةً في نطاق 0.1-10%. لقد وجدنا PDMS أن تكون خطية تصل إلى ما يقرب من 100٪ سلالة.
5. قياس معامل التخزين القص الديناميكي (G'), ومعامل الخسارة (G′′) من شبكة PDMS في اختبار الاجتياح الوقت مع تردد 1 هرتز وسلالة القص المذبذب من 0.5% في 100 درجة مئوية.
6. لتحديد مرونة لزجة والاعتماد على الوقت من شبكة PDMS النهائي، وتطبيق اختبار الاجتياح التردد مع تردد تتراوح بين 0.1-100 هرتز وسلالة القص المذبذب من 0.5٪.

Results

قبل إضافة TGF-β، طبقة أحادية من الخلايا confluent لديه الحصى مثل الشكل ومعبأة بإحكام. عند العلاج TGF-β، تصبح الخلايا أكثر ممدود في مورفولوجيا، وتوسيع منطقة الخلية والحصول على النمط الظاهري mesenchymal أكثر. باستخدام جهاز متعدد الآبار ملفقة مع elastomers PDMS لينة، تمت دراسة الخصائص الفيزيائية للخلايا في ما مجموعه 17 ظروف مختلفة. وقد عولجت الخلايا بأربع تركيزات مختلفة من TGF-β (0.5 و1 و2 و4 نانوغرام/مل) وأربع أوقات حضانة مختلفة (12 و24 و48 و96 ح)، ويرد موجز لهذه النتائج في

Discussion

لنجاح هذه الطريقة، فمن الأهمية بمكان أن يكون عينة المغلفة بشكل موحد مع سمك ثابت من حوالي 100 ميكرومتر. وينبغي اختيار المعوّل بعناية لدراسة الأهمية المادية للنظام البيولوجي الذي يهمه الأمر. عند تصنيع طبقة أعلى، ينبغي تحسين تركيز جزيئات الفلورسنت fiducial لتحليل دقيق للإزاحة والإجهاد الجر. تحليل الخلايا المفردة المعزولة يتطلب طبقة ائتمانية أكثر كثافة من قياس الطبقات الأحادية المتجانسة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون سطح الركيزة طلاء مستقرة وموحدة من جزيئات التصاق مثل الكولاجين، فيبرونيكتين، ولامينين لضمان المرفق السليم للخل...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<قوي> لوحة< / قوي>
GEL-8100	Nusil Technology	GEL-8100	عازل عالي النقاء ، طقم هلام سيليكون ناعم
داو كورنينج سيلجارد 184 مغلف سيليكون واضح 0.5 كجم كيت	إلسورث مواد لاصقة	184 SIL ELAST KIT 0.5 كجم	عامل معالجة
مخصص مقطوع الزجاج   ؛		Hausser Scientific	Company 109.6mm & plusmn; × 72.8mm & plusmn; × 1 مم سمك
الهدف 2TM نايلون حقنة مرشح	ThermoFisher Scientific	F2513-4
96-well Stripwell Egg Crate Strip حامل	Corning	2572
غطاء دقيق عالمي من البوليسترين مع شق زاوية   ؛	Corning	3099
الكحول الإيثيلي	Greenfield Global	P016EA95	0.95
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	كاشف ACS ، < فئة الخط = "font5">&ge ؛ 99.5٪ < / font >
< قوي > طلاء السطح < / قوي >
Sulfo-SANPAH Crosslinker	Proteochem	c1111-100mg
محلول البلازما البقري Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-1MG	، معقم مفلتر ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا
PBS ، 1X	Wisent	319-005-CL	درجة الحموضة 7.4 ، بدون الكالسيوم والمغنيسيوم
DMSO	سيجما ألدريتش	472301
<قوي>ثقافة الخلايا< / قوي>
DMEM, 1X	Wisent	319-005-CL	4.5g / L جلوكوز, مع L-الجلوتامين وبيروفات الصوديوم والفينول الأحمر
FBS (مصل الأبقار الجنينية)	Wisent	080-150	جودة ممتازة,  السموم الداخلية < 1 ، الهيموجلوبين < ؛ 25
HEPES	Wisent	330-050-EL	1M ، حمض خال
الأنسولين البشري المؤتلف	Wisent	511-016-CM	USP
الصف البنسلين الستربتومايسين محلول	Wisent	450-201-EL	100 X ، معقم مفلتر لزراعة الخلايا
محلول L-Glutamine	Wisent	609-065-EL	200mM ، مفلتر معقم لزراعة الخلايا
أمفوتريسين ب	ويسنت	450-105-QL	250 & mu ; جم / مل ، معقم مفلتر لثقافة الخلية
المؤتلف الإنسان TGF- & بيتا ؛ 1	Peprotech	100-21	HEK293 مشتق
من حمض الخليك	سيجما ألدريتش	537020	جليدي ، & ge ؛ 99.85٪
حمض الستريك	سيجما ألدريتش	251275	كاشف ACS ، & ge 99.5٪
NMuMG	ATCC	CRL-1636	فأر خط خلية الغدة الثديية
أزيد الصوديوم	فيشر سكانتيفيك	AC190385000	99٪ ، نقاء إضافي ، ACROS Organics
هيدروكسيد البوتاسيوم	سيجما ألدريتش	221473	كاشف ACS ، & ge ؛ 85٪ ، الكريات
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X100	مختبر
الصف <قوي > تخليق الخرزة < / قوي >
1،1 & رئيس الوزراء ؛ -ديوكتاديسيل-3،3،3 & رئيس ؛ 3 & -tetramethylindocarbocyanine بيركلورات (DiI)	سيجما - ألدريتش   ؛	468495-100 ملغ	97٪
ميثيل ميثاكريليت	سيجما ألدريتش   ؛	يحتوي M55909-500ML	على & 30  ppm MEHQ كمثبط ، 99٪
مزيل مثبط	Sigma-Aldrich   ؛	306312-1EA	عمود معبأ مسبقا لإزالة الهيدروكينون وأحادي ميثيل الأثير الهيدروكينون
ميثاكريلوكسيل بروبيل منتهي بولي ميثيل سيلوكسان	جيليست	DMS-R31 (25,000 جم / مول) مثبت	بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان ، 25,000 جم / مول ، 1,000 cSt
2,2 & prime ؛ -Azobis (2-methylpropionitrile) (AIBN)	Sigma-Aldrich   ؛	441090-25G	98٪
هكسان	سيجما ألدريتش	296090-2L	اللامائي ، 95٪
الهكسان ، خليط من الأيزومرات	Sigma-Aldrich & nbsp ؛	227064-1L	اللامائية, & ge; 99٪
Whatman  ورق ترشيح نوعي ، الصف 1	Sigma-Aldrich   ؛	WHA1001055	Circles, Diam. 55  مم ،
< قوي > المعدات < / قوي >
لوريل WS-650Mz-23NPPB	Laurell Technologies
UVP مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمول نموذج UVGL-58	VWR	21474-622
الريومتر	أنطون بار	MCR 302 WESP