الهياكل على المستوى الجزيئي بين الوجهين من البوليمرات والجزيئات الحيوية التي تم الكشف عنها عن طريق التحليل الطيفي الاهتزازي لجيل التردد الكلي

Summary

يجري استخدامها بشكل شامل، مجموع توليد تردد (SFG) التحليل الطيفي الاهتزازي يمكن أن تساعد على الكشف عن سلسلة الترتيب المطابقة والتغيير الهيكلي الثانوي يحدث في البوليمر وواجهات جزيء الحيوي.

Abstract

كمطياف بصري غير خطي من الدرجة الثانية، تم استخدام التحليل الطيفي الاهتزازي لتوليد التردد (SFG) على نطاق واسع في التحقيق في مختلف الأسطح والواجهات. هذه التقنية البصرية غير الغازية يمكن أن توفر المعلومات المحلية على المستوى الجزيئي مع حساسية أحادية الطبقة أو دون طبقة أحادية. نحن هنا نقدم منهجية تجريبية حول كيفية الكشف بشكل انتقائي عن واجهة مدفونة لكل من الجزيئات الكبيرة والجزيئات الحيوية. مع أخذ هذا في الاعتبار، تتم مناقشة الهياكل الثانوية بين الوجهين من الليفية الحريرية وهياكل المياه حول نموذج قصير السلسلة oligonucleotide دوبلكس. الأول يظهر تداخل سلسلة سلسلة أو تأثير الحبس المكاني والثانية يظهر وظيفة الحماية ضد أيونات Ca^{2 +} الناتجة عن البنية الفوقية للعمود الفقري الزقزقة من الماء.

Introduction

تطوير مجموع توليد تردد (SFG) مطيافية الاهتزاز يمكن أن يعود تاريخها إلى العمل الذي قام به شين وآخرون قبل ثلاثين عاما^1،2. إن تفرد الانتقائية البينية وحساسية الطبقة دون أحادية اللون يجعل التحليل الطيفي الاهتزازي SFG يحظى بتقدير عدد كبير من الباحثين في مجالات الفيزياء والكيمياء والبيولوجيا وعلوم المواد، الخ^{3و4 ،5}. حاليا، يتم التحقيق في مجموعة واسعة من القضايا العلمية المتعلقة الأسطح والواجهات باستخدام SFG، وخاصة بالنسبة للواجهات المعقدة فيما يتعلق البوليمرات والجزيئات الحيوية، مثل هياكل السلسلة والاسترخاء الهيكلي في دفن واجهات البوليمر، والهياكل الثانوية البروتين، وهياكلالمياه بين الوجهين 9،^{10،11،12،13،14، 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24،25،26.}

لأسطح البوليمر والواجهات، يتم إعداد عينات رقيقة من الافلام عموما عن طريق الطلاء تدور للحصول على الأسطح أو الواجهات المطلوبة. المشكلة تنشأ بسبب تداخل الإشارة من الواجهات اثنين من الأفلام كما أعدت، مما يؤدي إلى إزعاج لتحليل الأطياف SFG جمع^27،28،29. في معظم الحالات، إشارة الاهتزاز فقط من واجهة واحدة، إما فيلم / الركيزة أو فيلم / وسيلة أخرى، هو مرغوب فيه. في الواقع، فإن حل هذه المشكلة من السهل جدا، وهي، لتحقيق أقصى قدر تجريبيا من حقول الضوء في واجهة مرغوب فيه وتقليل حقول الضوء في واجهة أخرى. وبالتالي، فإن معاملات فريسنل أو معاملات الحقل المحلي تحتاج إلى أن تحسب من خلال نموذجالافلام الرقيقة وللتحقق من صحتها فيما يتعلق بالنتائج التجريبية 3،^{9،10،11، 12،13،14،15،30}.

ومع أخذ الخلفية المذكورة أعلاه في الاعتبار، يمكن التحقيق في بعض الواجهات البوليمرية والبيولوجية من أجل فهم العلوم الأساسية من المستوى الجزيئي. في ما يلي، مع أخذ ثلاث قضايا بين الوجهين على سبيل المثال: التحقيق بولي (2-هيدروكسي إيثيلميثاكريلات) (PHEMA) السطح وواجهة مدفونة مع الركيزة 9، وتشكيل الهياكل الثانوية الليفية الحرير (SF) على سطح البوليسترين (PS) و هياكل المياه المحيطة نموذج قصيرة السلسلة oligonucleotide دوبلكس^16،21، وسوف نعرض كيف أن مطياف SFG الاهتزازي يساعد على الكشف عن هياكل المستوى الجزيئي بين الوجه فيما يتعلق بالعلوم الأساسية.

Protocol

1. SFG التجريبية

1. استخدام نظام بييكونثانية SFG التجارية (جدولالمواد)،والذي يوفر شعاع 1064 نانومتر الأساسية مع عرض نبض من ~ 20 PS وتردد 50 هرتز، استنادا إلى ليزر Nd:YAG.
2. تحويل الأساسية 1064 نانومتر شعاع في شعاع 532 نانومتر وشعاع 355 نانومتر باستخدام وحدات التوافقية الثانية والثالثة. توجيه شعاع 532 نانومتر مباشرة كشعاع ضوء الإدخال وتوليد المدخلات الأخرى منتصف الأشعة تحت الحمراء (IR) شعاع تغطي نطاق التردد من 1000 إلى 4000 سم^-1 من خلال توليد البارامترية البصرية (OPG) / التضخيم البصري البارامتري (OPA)/ عملية توليد تردد الفرق (DFG).
3. تعيين زوايا الحادث من اثنين من الحزم الإدخال لتكون 53 درجة (الأشعة تحت الحمراء) و 64 درجة (مرئية)، على التوالي، مقابل سطح عادي.
4. للكشف عن هياكل البوليمر بين الوجه (إما واجهة الفيلم / الركيزة أو الفيلم / واجهة متوسطة أخرى)، واستخدام ssp (ق الاستقطاب شعاع تردد مجموع، ق الاستقطاب شعاع مرئي وP-الاستقطاب شعاع الأشعة تحت الحمراء) وتركيبات الاستقطاب PPP.
5. للكشف عن الهياكل الثانوية البروتين بين الوجهين والهياكل المائية المحيطة الحمض النووي، إلى جانب Ssp وPPP، تم استخدام spp chiral وPSP تركيبات الاستقطاب.
6. لضمان عدم تلف العينات، السيطرة على الأشعة تحت الحمراء وطاقات النبض المرئية لتكون ~ 70 و ~ 30 mJ، على التوالي. تم عرض مخطط لعملية SFG مع الرسم التخطيطي لمستوى الطاقة في الشكل 1. ويبين الشكل 2 نظام SFG في غرفتنا النظيفة.

2. معاملات فريسنل

1. استخدم المنشور بالزاوية اليمنى كركائز لجميع التجارب التي تمت مناقشتها هنا. هناك اثنين من الواجهات لفيلم البوليمر على الركيزة الصلبة، أي سطح البوليمر في الهواء والبوليمر / واجهة الركيزة. كلاهما يمكن أن تولد إشارات SFG منذ يتم كسر التماثل انعكاس في كلا الواجهات. ولذلك، فإن طيف SFG الذي تم جمعه هو طيف متدخل. ومع ذلك، فإن معاملات الحقل المحلي أو معاملات Fresnel في الواجهات اثنين يمكن أن تكون قابلة للتعديل عن طريق تغيير زوايا الحادث أو سمك الفيلم واحد في وقت واحد أو في وقت واحد^31،32. وهذا يوفر الفرصة لنا للتحقيق في إشارة الاهتزاز SFG من واجهة واحدة فقط. هنا، تم أخذ فيلم PHEMA على المنشور CaF₂ كمثال⁹.
2. كما هو موضح في الشكل3، استخدم هندسة المنشور الزاوية اليمنى للكشف عن إشارات SFG المتولدة من فيلم PHEMA السفلي. يتم التعبير عن كثافة الناتج SFG في وضع ينعكس كما
   (1)
   حيث يشير إلى شد الحساسية غير الخطية الفعالة من الدرجة الثانية.
   يتكون من ثلاثة أجزاء، وهي واجهة المنشور /البوليمر، والواجهة المتوسطة البوليمر/القاع (متوسط أسفل يشمل الغاز، السائل أو الصلبة.) والخلفية غير الرنانة، كما هو مبين في المعادلة التالية.
   (2)
   هنا يمكن أن يكون متوسط أسفل الهواء والماء أو أي شيء آخر. يمثل F معامل فريسنل المقابل المسؤول عن تصحيح الحقل المحلي.
3. تطبيق نموذج رقيقة الفيلم لحساب معاملات فريسنل في هذه الحالة. هنا فقط قصيرة حساب قدّمت إجراءات.
   1. لواجهة المنشور / البوليمر، واستخدام
      (3)
      (4)
      (5)
      ويرد أدناه معنى كل معلمة مبينة.
      1. ω_i يدل على تردد شعاع.
      2. t_p و t_s تدل على معاملات الإرسال الإجمالية ويمكن التعبير عنها على أنها
         (6)
         (7)
      3. t_p12 و t_s12 يشيرإلى معاملات الإرسال الخطي للشعاع الضوئي في واجهة المنشور/البوليمر.
      4. r_p23 و r_s23 يشيران إلى معاملات انعكاس خطية لشعاع الضوء في الواجهة البوليمرية/المتوسطة.
      5. α يمثل الفرق المرحلة بين شعاع عاكس وشعاع عاكس الثانوية بعد أن ينتشر عبر البوليمر رقيقة الفيلم ومن ثم يعكس مرة أخرى، والتي يمكن التعبير عنها كما
         (8)
      6. يمثل الطول الموجي للشعاع الضوئي وd هو سمك فيلم البوليمر.
      7. Φ₁ وΦ ₂ تمثل زوايا الحادث في واجهة المنشور / البوليمر والبوليمر / واجهة متوسطة على التوالي.
      8. ن₁ و ن₂ تمثل مؤشرات الانكسار من المنشور والبوليمر الفيلم على التوالي.
      9. n₁₂ يمثل المؤشرات الانكسارية للطبقات البوليمرية بين الوجهين للمنشور/ البوليمر.
   2. للبوليمر / واجهة متوسطة، واستخدام
      (9)
      (10)
      (11)
      1. يمثل Δ الفرق المرحلة من الحقول الكهربائية الخفيفة في اثنين من الواجهات.
      2. نظرًا لأن عرض النبض لعوارض الإدخال لدينا هو ~20 رطل، يمكن إهمال الخطأ من تأخير الوقت المرتبط بتأثير التشتت.
      3. التعبير عن هذا الفرق المرحلة للإخراج SFG، يمكن كتابة المدخلات المرئية والحزم الأشعة تحت الحمراء المدخلات بشكل منفصل كما
         (12)
         (13)
         (14)
          
4. من المناقشة أعلاه، لنظام المنشور البوليمر فيلم المتوسطة (1-2-3)، والتعبير عن مجموع معاملات فريسنل للالمنشور / البوليمر والبوليمر / واجهات متوسطة كما المعادلات التالية، لSSP وPPP مجموعات الاستقطاب . وبطبيعة الحال، تعتبر كل من الواجهات السمتية متساوي ة.
   1. بالنسبة لواجهة المنشور/البوليمر، يتم عرض تعبيرات معاملات الفريسنل الإجمالية لكل من تركيبات الاستقطاب Ssp وPPP على النحو التالي.
      1. بالنسبة لـ ssp، فإن المعادلة هي
         (15)
      2. وبالنسبة لـ PPP، فإن المعادلة
         (16)
         (17)
         (18)
         (19)
          
      3. t₁₀ و t₀₁ يشيران إلى معاملات الإرسال الخطية في الهواء/المنشور والمنشور/الهواء على التوالي.
   2. بالنسبة للواجهة البوليمرية/المتوسطة، يتم وصف تعبيرات معاملات الفريسنل الإجمالية لكل من تركيبات الاستقطاب Ssp وPPP على النحو التالي.
      1. بالنسبة لـ ssp، فإن المعادلة هي
         (20)
      2. بالنسبة لـ PPP، تكون المعادلات
         (21)
         (22)
         (23)
         (24)
            
          
5. بعد حساب معاملات فريسنل باستخدام النموذج الساندويتشي، رسمها كدالة لسمك الفيلم، كما هو موضح في الشكل 4.
   ملاحظة: في هذه الحالة، هناك نطاق سمك لجمع إشارة SFG من CaF₂ المنشور / PHEMA واجهة مع مساهمة مهملة من واجهة أخرى، وهو حوالي 150 نانومتر. وبالمثل، يمكن اختيار سمك مناسب للكشف عن واجهة PHEMA/أسفل المتوسطة مع مساهمة مهملة من CaF₂ المنشور / PHEMA واجهة.

3. Cهيرال SFG مزيج الاستقطاب

1. للواجهة achiral العادية، عادة، استخدم C_-v التماثل من حيث متوسط الفرقة^33،34. مع عملية التماثل انعكاس، يمكن استنتاج غير صفري من الدرجة الثانية غير الخطية حساسية الشد المكونات، والتي هي ج_xxz،ج_xzx،ج_zxx،ج_yyz،ج_yzy،ج_زي و ج_zzz (و يمكن تقليل المصطلحات الموجودة بشكل أكبر إذا تم افتراض وجود واجهة متساوية، مما يعني أن x وy متشابهان). ومع ذلك، بالنسبة للواجهة chiral، فإن الوضع سيكون مختلفا. واجهة تشيرال تمتلك التماثل C، يسمح فقط عملية التماثل دوران. في هذه الحالة، إلى جانب المصطلحات الشيرال العادية، فإن أكثر من الدرجة الثانية غير الخطية حساسية تكون غير صفرية، والتي يمكن أن تسمى المصطلحات chiral، وهي ج_zyx،ج_zxy و c_yzx تحت النظر في غير الإلكترونية صدي. لذلك، باستخدام PSP، PPS وتركيبات الاستقطاب SPP، يمكن جمع الأطياف SFG chiral^33،34.

4. إعداد عينة

1. إعداد فيلم PHEMA
   1. حل مسحوق PHEMA (انظر جدولالمواد) في الإيثانول اللامائية لإعداد الحل مع 2 الوزن٪ و 4 الوزن٪ على التوالي.
   2. قبل ترسب أفلام PHEMA، نقع CaF₂ المنشور الزاوية اليمنى في المذيبات التولوين أولا ثم غسلها مع الإيثانول والماء النقي جدا (18.2 MΩ·cm).
   3. بعد ذلك، قم بتعريض الركائز (CaF₂ المنشور بالزاوية اليمنى) لبلازما الأكسجين لإزالة الملوثات العضوية المحتملة بواسطة منظف البلازما (انظر جدولالمواد).
      1. تشغيل أولا على منظف البلازما ووضع الركائز في ذلك.
      2. ثم تشغيل مضخة فراغ لفراغ المكنسة. إدخال الأكسجين في ذلك.
      3. وأخيرا تعيين 4 دقائق للتنظيف. بعد ذلك، الحفاظ على ركائز نظيفة لإعداد الفيلم PHEMA متتابعة.
      4. ثم إعداد الأفلام PHEMA على المنشور CaF₂ من قبل معطف تدور (انظر جدول المواد). ضبط سمك الفيلم من قبل تركيز الحل وسرعة الدوران.
         1. تعطيل المنشور CaF₂ على قرص مص من تدور المغطي.
         2. إسقاط قطرة واحدة من محلول PHEMA أعدت من قبل على ركائز نظيفة في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة (سمك الفيلم 2 wt٪ ل 100 نانومتر و 4 wt٪ ل 200 نانومتر).
      5. أنيال جميع الأفلام PHEMA أعدت في فرن فراغ في 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
2. إعداد الليفية الحريرية (SF)
   ملاحظة: اعتُمد البروتوكول الذي اقترحه كابلان وآخرون^35.
   1. ضع 7.5 غرام من شرنقة الحرير من B. موري في كربونات الصوديوم الغليان (Na₂CO_3,0.02 M) محلول مائي (3 لتر) لمدة 30 دقيقة.
   2. اغسل SF الليفي الذي تم الحصول عليه بالماء منزوع الأيونات ثلاث مرات تحت التحريك من أجل إزالة جزيئات السيريسين وترك جزيئات SF فقط في العينة الليفية.
   3. جفّف عينة SF الليفية في فرن فراغ عند 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   4. بعد ذلك، حل عينة SF الليفية degummed في بروميد الليثيوم (LiBr، 9.3 M) حل مائي (1 غرام من SF تم حلها في ~ 4 مل من محلول LiBr.) وحضانة في 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة تحت التحريك.
   5. دياليب الحل SF ضد الماء منزوع الأيونات (3500 أكياس غسيل الكلى دا) لمدة 3 أيام لإزالة LiBr المذاب. تغيير المياه منزوعة الأيونات الجديدة ثلاث مرات كل يوم. وأخيرا تخزين الحل SF معالجتها في 4 درجة مئوية لتجارب SFG في وقت لاحق.
3. إعداد سلسلة قصيرة oligonucleotide دوبلكس
   1. طلب عينة oligonucleotide التي تقطعت بها السبل واحدة مع 3'-نهاية المعدلة من الكوليسترول ثلاثي الإيثيلين غليكول (تشول-TEG) (5 '-GCTTCCGAAGGTCGA-3') من شركة تجارية (انظر جدولالمواد) وكذلك واحدة تكميلية. لكل حبلا واحد، حل 10 نمول من مسحوق عينة في 0.5 مل من الماء النقي جدا. ثم مزجها معا لتشكيل حل oligonucleotide دوبلكس (10 نمول / مل).
   2. مزيج 2 ملغ من 1,2-ديبالميتويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوليوكولين (DPPC) و 2 ملغ من DPPC deuterated (د-DPPC) وحلها في 1 مل من الكلوروفورم لإعداد محلول الدهون.
   3. إعداد طبقة أحادية من DPPC وd-DPPC بواسطة حوض لانغموير -Blodgett (LB)
      1. قم بإرفاق المنشور CaF₂ بالزاوية اليمنى إلى حامل عينة محلي الصنع مع وجه منشور واحد مغموس عمودياً في البيئة المائية لحوض LB.
      2. بعد ذلك، حقن محلول الدهون المختلطة التي أعدت قبل على سطح الماء حتى وصل الضغط السطحي قيمة معينة أقل من 34 mN·m⁻¹.
      3. بعد إيقاف مستويات الضغط السطحي، استخدم حاجزين تفلون لضغط الطبقة الأحادية للدهون بنسبة 5 مم/دقيقة حتى يتم التوصل إلى ضغط سطحي قدره 34 منوم·م^−1.
      4. رفع المنشور مع أحادية الدهون من الماء بمعدل 1 ملم / دقيقة عموديا.
   4. إعداد أحادية الدهون الأخرى
      1. لتسهيل تجميع oligonucleotide دوبلكس وجزيئات الدهون عن طريق التفاعل الكاره للماء (الكولسترول وسلسلة الألكيل الدهون)، وخلط حل oligonucleotide دوبلكس مع محلول الدهون في نسبة الأضراس من 1:100 (oligonucleotide إلى الدهون).
      2. حقن الدهون المختلطة ومحلول oligonucleotide دوبلكس على سطح الماء في حاوية تفلون محلية الصنع حتى تم التوصل إلى ضغط سطح 34 mN·m^−1.
   5. وأخيرا، وضع أحادية الدهون في الجزء السفلي من المنشور في اتصال مع أحادية الدهون مع oligonucleotides دوبلكس إدراجها على سطح الماء لتشكيل العينة النهائية لقياس SFG.
4. [لورنتز] معادلة
   1. استخدم معادلة Lorentz لتناسب أطياف SFG لاستخراج المعلومات الاهتزازية لوضع اهتزازي معين.
      (25)
      حيث يمثل كثافة وضع الاهتزاز qth، يمثل تردد رنانة، يدل على عرض نصف في نصف الحد الأقصى (HWHM) ويمثل تردد المسح الضوئي من شعاع الأشعة تحت الحمراء الحادث.

Results

وفي الجزء المتعلق بمعامل فريسنل من قسم المراسم، أظهرنا أنه من الممكن نظرياً الكشف بصورة انتقائية عن واجهة واحدة فقط في وقت واحد. هنا، تجريبيا، أكدنا أن هذه المنهجية صحيحة أساسا، كما هو مبين في الشكل 5 والشكل 6.

يظهر الشكل 5 هيكل PHEMA المدفون بين الوجهين بعد تسرب المياه مع فيلم هيدروجيل PHEMA 150 نانومتر والشكل 6 يظهر الهيكل السطحي في الماء مع فيلم هيدروجيل PHEMA 430 نانومتر~...

Discussion

وللتحقيق في المعلومات الهيكلية من المستوى الجزيئي، تتمتع الحكومة الاتحادية الانتقالية بمزاياها المتأصلة (أي حساسية الطبقة الأحادية أو دون أحادية الطبقة والانتقائية بين الوجهين)، والتي يمكن تطبيقها لدراسة مختلف الواجهات، مثل الواجهات الصلبة/الصلبة والصلبة/ السائل، الصلبة / الغاز، السائل / الغاز، السائل / السائل واجهات. وعلى الرغم من أن صيانة المعدات والمحاذاة البصرية لا تزال انبتعدة للوقت، فإن المردود كبير من حيث أنه يمكن الحصول على المعلومات التفصيلية على المستوى الجزيئي على الأسطح والواجهات.

...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1،2-ديبالميتويل-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	شركة أفانتي القطبية للدهون	850355P-1g
الإيثانول اللامائي	Sinopharm الكاشف الكيميائي المحدودة	100092680	≥ 99.7٪
CaF2 المنشور	تشنغدو YaSi للإلكترونيات الضوئية المحدودة
كلوريد الكالسيوم اللامائي	Sinopharm الكاشف الكيميائي المحدودة	10005817	≥ 96.0٪
DPPC deuterated (d-DPPC) Avanti	Polar Lipids، Inc.	860345P-100mg
فرن كهرومغناطيسي	تشجيانغ سوبور المحدودة	C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) من خلال الحوض	الصغير KSV NIMA المحدودة	KN 2003
بروميد الليثيوم اللامائي	Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd	20056926
نظام التوليف Milli-Q	Millipore		للمياه فائقة النقاء
	تشنغدو Mingheng Science & التكنولوجيا المحدودة	PDC-MG	الأكسجين تنظيف البلازما
بولي (2-هيدروكسي إيثيل ميثاكريلات) (PHEMA)	سيجما ألدريتش المحدودة.	192066 MSDS	Mw = 300 000
شركة البوليسترين	Sigma-Aldrich Co.، LLC.	330345 MSDS	Mw = 48 kDa و Mn = 47 kDa
شرانق			من Bombyx mori
خيط تكميلي واحد من قليل النوكليوتيدات	Nanjing Genscript Biotechnology Co.، Ltd.	H03596	5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'خيط
واحد من قليل النوكليوتيدات	نانجينغ جينسكريبت التكنولوجيا الحيوية المحدودة.	H04936	3 & سنت;-نهاية معدلة بواسطة الكوليسترول ثلاثي إيثيلين جلايكول (Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
كربونات الصوديوم اللامائية	Sinopharm الكاشف الكيميائي المحدودة	10019260	≥ 99.8٪
Spin-coater	للإلكترونيات الدقيقة التابع للأكاديمية الصينية للعلوم	KW-4A	لإعداد أفلام ploymer   ؛
ملف تعريف الخطوة	Veeco	DEKTAK 150	لقياس سمك الفيلم
نظام التحليل الطيفي الاهتزازي لتوليد تردد المجموع (SFG	EKSPLA		نظام بيكو ثانية تجاري SFG