مقالة منهجية

التصور من المجمعات Mitophagy الذاتية في الموقع في خلايا بيتا البنكرياس البشرية باستخدام القرب الربط اختبار

DOI:

10.3791/59398

⸱

مايو 2, 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2VA Ann Arbor Healthcare System

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول طريقة للتحليل الكمي لتكوين مجمع البروتين الميتوباجي على وجه التحديد في خلايا بيتا من عينات الشُعيل البشرية الأولية. وبالتالي تسمح هذه التقنية بتحليل mitophagy من المواد البيولوجية المحدودة، والتي هي حاسمة في عينات خلايا بيتا البنكرياس البشرية الثمينة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitophagy هو مسار أساسي لمراقبة جودة الميتوكوندريا، وهو أمر بالغ الأهمية للطاقة الحيوية لخلايا بيتا في زيت البنكرياس لتغذية الأنسولين المحفز للجلوكوز. تقييم mitophagy هو التحدي وغالبا ما يتطلب الصحفيين الوراثية أو تقنيات تكميلية متعددة لا تستخدم بسهولة في عينات الأنسجة، مثل الجزر البنكرياس البشرية الأولية. هنا نبرهن على نهج قوي لتصور وتحديد تشكيل المجمعات الانقسامية الذاتية الرئيسية في جزر البنكرياس البشرية الأولية. باستخدام تقنية اختبار الربط القرب الحساسة للكشف عن التفاعل بين المنظمين mitophagy NRDP1 و USP8، ونحن قادرون على تحديد كمية تشكيل المجمعات mitophagy الأساسية في الموقع. من خلال اقتران هذا النهج لمكافحة البقع لعامل النسخ PDX1، يمكننا قياس المجمعات mitophagy، والعوامل التي يمكن أن تضعف mitophagy، وعلى وجه التحديد داخل خلايا بيتا. المنهجية التي نصفها تتغلب على الحاجة إلى كميات كبيرة من المستخلصات الخلوية اللازمة لدراسات التفاعل البروتينالبروتيني الأخرى، مثل الترسيب المناعي (IP) أو قياس الطيف الكتلي، وهي مثالية لعينات جزر الإنسان الثمينة عموما لا المتاحة بكميات كافية لهذه النهج. وعلاوة على ذلك، فإن هذه المنهجية تبطل الحاجة إلى تقنيات فرز التدفق لتنقية خلايا بيتا من مجموعة من الislet غير المتجانسة لتطبيقات البروتين في المصب. وهكذا، فإننا نصف بروتوكول قيمة لتصور mitophagy متوافقة للغاية للاستخدام في مجموعات الخلايا غير متجانسة ومحدودة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتج خلايا بيتا البنكرياس الأنسولين المطلوب للحفاظ على التوازن الجلوكوز الطبيعي، ويؤدي فشلها في تطوير جميع أشكال مرض السكري. تحتفظ خلايا بيتا بقدرة الميتوكوندريا القوية لتوليد الطاقة اللازمة لاقتران استقلاب الجلوكوز بالإفراج عن الأنسولين. في الآونة الأخيرة، أصبح من الواضح أن الحفاظ على كتلةالميتوكوندريا الوظيفية هو من الأهمية المحورية لوظيفة خلية بيتا الأمثل 1،2،3. من أجل الحفاظ على كتلة الميتوكوندريا الوظيفية، تعتمد خلايا بيتا على آليات مراقبة الجودة لإزالة الميتوكوندريا المختلة أو التالفة أو الشيخوخة4. لقد أثبتنا نحن وآخرون في السابق أن خلايا بيتا تعتمد على شكل متخصص من دوران الميتوكوندريا، يسمى الميتوكوندريا أوتوفاجي (أو الميتوثاجي)، للحفاظ على مراقبة جودة الميتوكوندريا في كل من القوارض والجزر الصغيرة البشرية1، 2،5. لسوء الحظ، ومع ذلك، لم يكن هناك طريقة بسيطة للكشف عن mitophagy، أو المكونات mitophagy أعرب عنها داخليا، في خلايا بيتا البنكرياس البشرية.

لقد أظهرنا مؤخرا أن تنظيم المنبع من mitophagy في خلايا بيتا يعتمد على تشكيل مجمع البروتين الذي يتألف من الأربطة E3 CLEC16A وNRDP1 وdeubiquitinase USP81. وقد أظهرت NRDP1 و USP8 بشكل مستقل أن تؤثر على mitophagy من خلال العمل على مفتاح mitophagy البادئ باركين6,7. NRDP1 يستهدف PARKIN لفي كل مكان وتدهور لإيقاف mitophagy6, وUSP8 deubiquitinates K6 المرتبطة باركين لتعزيز نقلها إلى الميتوكوندريا7. وقد تم إجراء تقييم الربط القرب (PLA) التكنولوجيا مؤخرا في مجال تفاعل البروتين البيولوجيا8، مما يسمح التصور من تفاعلات البروتين الذاتية في الموقع في خلايا واحدة ، ولا يحد من المواد عينة نادرة. هذه المنهجية هي تحريضية بشكل خاص لبيولوجيا الخلايا في الislet/beta البشرية، وذلك بسبب التناسل في توافر العينات، إلى جانب الحاجة إلى فهم مجمعات البروتين ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية داخل أنواع الخلايا غير المتجانسة.

الاستفادة من نهج جيش التحرير الشعبى الصينى، ونحن قادرون على مراقبة المجمعات الرئيسية الذاتية mitophagy في خلايا بيتا البنكرياس البشرية الأولية وخطوط الخلايا العصبية، وتبين آثار بيئة شيطانية على مسار mitophagy1. وباختصار، فإن الهدف الشامل لهذا البروتوكول هو تحليل مجمعات بروتين ميتوثاجي محددة في الأنسجة التي تفتقر إلى مواد وفيرة، أو حيث لا يمكن إجراء دراسات تقليدية للتفاعل بين البروتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم استخدام الجزر البنكرياسالبشرية المانحة غير المحددة من خلال إعفاء مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) وامتثالاً لسياسة IRB لجامعة ميشيغان. تم توفير الجزر البنكرياسية البشرية من قبل برنامج توزيع الجزر المتكاملة (IIDP) الذي ترعاه المعاهد القومية للصحة/المعهد الوطني للتنمية البشرية.

1. إعداد عينة من الشهي

  1. تفكك خلية واحدة
    1. ثقافة عينات من إيطاليات الإنسان (4000-6000 islet&10 مل وسائل الإعلام) لمدة يوم واحد على الأقل في 37 درجة مئوية في وسائل الإعلام في زيت البنكرياس (PIM(S)) وسائل الإعلام المكملة مع 1 mM الجلوتامين (PIM(G)), 100 وحدة / مل مضاد حيوي مضاد للخلايا, 1 mM الصوديوم بيروفات و 10% البقرالجنيني المصل (FBS) أو مصل AB الإنسان.
    2. استخدام مجهر ضوء تشريح في التكبير 3X لحساب الجزر البشرية الفردية من الثقافة. اختيار 40 جزيرة لكل علاج / حالة من الفائدة (مثل السمية glucolipo) في أنابيب 1.5 مل في وسائل الإعلام جزيرة.
    3. جزر الطرد المركزي في 400 × ز لمدة دقيقة واحدة في 10 درجة مئوية إلى الرواسب.
    4. غسل العينات، عن طريق انعكاس قصير للأنابيب في درجة حرارة الغرفة، مرتين مع 1 مل الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) تحتوي على 50 μM PR619 (مثبط deubiquitinase؛ للحفاظ على تفاعلات البروتين تعتمد على يوبيكويتين)، مع الطرد المركزي بين كل غسل في 400 x ز لمدة دقيقة واحدة عند 10 درجة مئوية.
    5. تمنفصل الجزر في خلايا واحدة مع 125 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين تحتوي على 50 μM PR619 عن طريق احتضان التربسين prewarmed (37 درجة مئوية) لمدة 3 دقائق مع الكريات جزيرة. تفريق الجزر بلطف خلال هذا الوقت مع الأنابيب لطيف الدوري باستخدام ماصة 200 درجة مئوية.
    6. تبريد التربسين مع 1 مل يسخن (37 درجة مئوية) PIM (S) وسائل الإعلام التي تحتوي على 50 μM PR619، ثم خلايا الرواسب عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 1 دقيقة.
    7. غسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 1 دقيقة، مرتين، مع PBS + 50 درجة مئوية PR619.
    8. وأخيرا، إعادة تعليق الخلايا في 150 μL PBS التي تحتوي على 50 μM PR619.
  2. الالتزام بالخلية الواحدة وتثبيتها
    1. بعد إعادة التعليق، تدور حل الخلية على متجمد، مشحونة، والشرائح المجهر باستخدام الطاردة للخلايا في 28 × ز لمدة 10 دقيقة.
    2. بعد cytocentrifugation، قم بمخطط المنطقة الخلوية مع قلم مضاد للمشاعر (انظر جدولالمواد) لتقليل أحجام محلول الأجسام المضادة/جيش التحرير الشعبي المطلوب. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالدهايد في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      تحذير: PFA خطرة ويجب التعامل معها بعناية.
    3. للحصول على أفضل النتائج، وتنفيذ تلطيخ / جيش التحرير الشعبى الصينى على الفور، أو في غضون 24 ساعة. إذا لزم الأمر، تخزين عينات في PBS في 4 درجة مئوية حتى تلطيخ لمدة لا تزيد عن 48 ساعة.

2. الكيمياء المناعية

  1. حظر
    1. غسل الخلايا مرتين مع 1X PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. كتلة حل الخلية، للقضاء على تلطيخ الخلفية، مع 10٪ مصل الحمار في PBS تحتوي على المنظفات 0.3٪ (انظر جدولالمواد) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. تلطيخ
    1. حضانة الخلايا مع الماوس الأولية أو الأجسام المضادة الأرنب ضد USP8 (1:250) وNRDP1 (1:250) على التوالي (انظر جدولالمواد) المخففة في الفوسفات المخزنة المالحة مع المنظفات (PBT، انظر جدولالمواد)، في 4 °C بين عشية وضحاها، إلى الكشف عن مجمع mitophagy الإشارات عبر جيش التحرير الشعبى الصينى.
    2. حضانة الخلايا المشتركة مع علامة محددة لتحديد خلية بيتا التي لم يتم رفعها في الماوس أو الأرنب حتى لا تتداخل مع إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى. في هذه الحالة حضانة الخلايا مع PDX1 المضادة للماعز (1:500) في PBT. احتضان جميع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، وذلك باستخدام فيلم من البلاستيك على رأس الحل لمنع التبخر.

3. الاقتراب من الربط

  1. جيش التحرير الشعبى الصينى التحقيق ومضادة وصمة
    1. إعداد حل التحقيق جيش التحرير الشعبى الصينى وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، أي جعل 20 درجة مئوية من حل التحقيق لكل عينة عن طريق إعداد تركيز نهائي من 1:5 الحل من كل من المضادة للماوس ومكافحة الأرنب حل التحقيق في PBT، وحضانة لمدة 20 دقيقة في الغرفة درجه الحراره.
    2. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، وغسل الخلايا مرتين مع 1X PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما، على الروك.
    3. قبل الحضانة مع حل التحقيق، إضافة مكافحة الماعز Cy5 الثانوية في تركيز نهائي من 1:600 إلى حل التحقيق (للكشف عن PDX1 الذاتية). إضافة 20 درجة مئوية حل التحقيق لكل حالة الخلية، وتغطي بلطف مع فيلم من البلاستيك وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. الربط
    1. غسل الخلايا مرتين، في درجة حرارة الغرفة، مع العازلة A (انظر جدول المواد للوصفة) لمدة 5 دقائق لكل منهما، على الروك.
    2. إعداد حل الربط (جزء من الكواشف الكشف، انظر جدولالمواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لهذا، تمييع الأسهم الربط (5X) 1:5 في ثنائي إيثيل بايرات (DEPC) المعالجة المياه. مباشرة قبل الحضانة إضافة 0.025 U / مل ligase. إضافة 20 ميكرولتر حل الربط إلى الخلايا. تغطية مع فيلم من البلاستيك وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. التضخيم
    1. غسل الخلايا مرتين في درجة حرارة الغرفة مع العازلة A لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
    2. جعل حل تضخيم (جزء من الكواشف الكشف، انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تمييع التضخيم العازلة (5x) 1:5 في المياه المعالجة DEPC والحفاظ في الظلام حتى استخدامها. إضافة تخفيف 1:80 من البوليمرات (جزء من الكواشف الكشف، انظر جدول المواد) إلى الحل مباشرة قبل إضافة الحل إلى الخلايا.
    3. إضافة 20 درجة مئوية من محلول التضخيم إلى الخلايا. تغطية مع فيلم من البلاستيك ومكان في الظلام في 37 درجة مئوية لمدة تتراوح بين 1 ساعة 40 دقيقة إلى 2 ساعة للإشارة القصوى.
  4. التحضير للتصوير
    1. غسل الخلايا مرتين مع العازلة B (انظر جدول المواد لوصفة) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، على الروك.
    2. وأخيرا، غسل الخلايا مرة واحدة في 0.01x العازلة B، لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك.
    3. جبل العينات عن طريق إضافة قطرة من وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي على 4′,6-دياميديينو-2-فينيليندول (DAPI) ووضع بعناية غطاء على العينات باستخدام شفرة مشرط للضغط على أي فقاعات شكلت. غطاء الختم باستخدام طلاء الأظافر واضحة حول الحواف.
    4. عينات الصور على المجهر قادرة على التقاط طائرات بؤرية متعددة، مثل المجهر البؤري المسح بالليزر، أو مجهر الفلورة المقلوب مع قدرات deconvolution، مع ما لا يقل عن 9 صور طائرة محورية مختلفة.
      1. التقط الصور عند تكبير 100 x، مع ارتفاع مكدس z يبلغ حوالي 0.45 مم. القبض على جيش التحرير الشعبى الصينى في 550 نانومتر الإثارة، 570 نانومتر الانبعاثات؛ مكافحة وصمة عار في 650 نانومتر الإثارة, 670 نانومتر الانبعاثات; وDAPI في 405 نانومتر الإثارة، 450 نانومتر الانبعاثات.
    5. لضمان تقليل إشارات خلفية صورة الفلورة والضوء الضال لتحليل المصب لأحداث جيش التحرير الشعبي (وخاصة على المجاهر واسعة النطاق)، صور عملية باستخدام الإنقوبة ثنائية الأبعاد (أقرب جار) خوارزمية من خلال خوارزمية معيار معالجة الصور البرمجيات المفضلة.
      ملاحظة: لأوليمبوس استخدام CellSens, نيكون استخدام NIS-العناصر, ليكا استخدام LAS X, زايس – زين, ميتامورف, MATLAB, Huygens البرمجيات, فضلا عن العديد من الإضافات المتاحة من خلال صورة-J. للتحليل، يجب تحليل العدد الإجمالي للتفاعلات عبر كافة مكدسات z باستخدام برنامج Image-J، مما يضمن تحليل الخلايا الإيجابية Pdx-1 فقط (القسم 3.5).
  5. التحديد الكمي لتفاعلات جيش التحرير الشعبي
    1. افتح تطبيق برنامج Image-J المجاني، وافتح صورة PLA. تبدأ من أول صورة جيش التحرير الشعبى الصينى بشكل حاد في التركيز.
    2. انقر فوق علامة التبويب صورة، وحدد ضبط، ثم عتبة (الشكل1A). ضبط العتبة لإزالة جميع إشارات جيش التحرير الشعبي غير محددة، وتقديم مذكرة من تعديل عتبة ومحاولة للحفاظ على اتساق طوال التحليل.
    3. انقر فوق علامة التبويب عملية، وحدد ثنائي، ثم جعل ثنائي (الشكل1B). استخدام الصورة الثنائية لقياس الجسيمات، عنطريق النقر على "تحليل" علامة التبويب والضغط تحليل الجسيمات (الشكل1C).
    4. للتحليل تأكد من أن الإعدادات كما يلي: الحجم = 0-اللانهاية، التعميم = 0-1.0، إظهار = المخططات التفصيلية، خانات الاختيار لنتائجالعرض، والنتائج الواضحة (الشكل 1D). انقر فوق موافق. الإحاطة علما ً بعدد الجسيمات التي تم تحليلها في عينة جدول بيانات تدل على، ووضع z-stack.
    5. كرر الخطوات 3.5.2-3.5.4 حتى يتم تحليل كافة مكدسات z في التركيز للعينة. جمع العدد الإجمالي للجسيمات للعينة في جدول البيانات لتحديد العدد الإجمالي للتفاعلات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجرينا تجارب أولية في خط خلية بيتا البنكرياس MIN6 وخط الخلايا العصبية SH-SY5Y SH-SY5Y، لتحسين وتأكيد كل من خصوصية الأجسام المضادة وتفاعلات البروتين المرئي. تم طلاء خلايا MIN6 على الأغطية في 30،000 خلية / مل وتركت للتقيد لمدة 48 ساعة، وخلايا SH-SY5Y كانت مطلية على الأغطية في 15،000 خلية / مل وتركت للتمسك لمدة 24 ساعة. ثم اتبع بروتوكول جيش التحرير الشعبي على النحو الوارد أعلاه، ابتداء من الخطوة 1-2-3. لضمان خصوصية إشارات جيش التحرير الشعبي، قمنا أولاً بتنفيذ هذا النهج في وجود '1' لا الأجسام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقوم بوصف نهج بسيط وفعال لاستخدام NRDP1:USP8 PLA في الأنسجة / الخلايا ذات الأهمية لتحديد تشكيل المجمعات mitophagy المنبع. أكدنا في وقت سابق تشكيل مجمع CLEC16A-NRDP1-USP8 mitophagy في خلايا بيتا البنكرياس ية من خلال عدة منهجيات، بما في ذلك تجارب الترسيب المناعي المشترك، ودراسات التفاعل الخالي من الخلايا، وفي المختبر وكذلك في الخلايا القائمة على في كل مكان الاختبارات، وأظهرت كيف أن هذا المحركات المعقدة ينظم تدفق mitophagic1،15. دراسات جيش التحرير الشعبى الصينى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون بالدعم التمويلي المقدم من JDRF (CDA-2016-189 وSRA-2018-539)، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى، والمعاهد الوطنية للصحة (R01-DK-108921)، وأسرة Brehm، وعائلة أنتوني. وتحظى جائزة التطوير الوظيفي لـ JdRF إلى S.A.S. بدعم جزئي من الأكاديمية الدانمركية للسكري، التي تدعمها مؤسسة نوفو نورديسك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تريبسين-EDTA 1XLife Technologies25200-056
تقنيات المضاداتالحيوية والمضادة للفطريات15240-062
محلول بلوكمحلي الصنعاستخدم 1X PBS ، أضف 10٪ مصل حمار ، و 0.3٪ منظف Triton X-100.
Buffer Aمحلي الصنعلصنع 1 لتر: امزج 8.8 جرام كلوريد الصوديوم ، 1.2 جرام قاعدة تريس ، 500 ميكرولتر توين -20 ، مع 750 مل ddH20. درجة الحموضة إلى 7.5 مع حمض الهيدروكلوريك ، واملأها إلى 1 لتر. قم بتصفية المحلول وتخزينه في 4 درجة مئوية. أحضره إلى RT قبل الاستخدام التجريبي
Buffer Bمحلي الصنعلصنع 1 لتر: امزج 5.84 جم كلوريد الصوديوم ، 4.24 جم قاعدة تريس ، 26 جم تريس حمض الهيدروكلوريك مع 500 مل ddH20. درجة الحموضة إلى 7.5 ، واملأها حتى 1 لتر. قم بتصفية المحلول وتخزينه 4C. أحضره إلى RT قبل الاستخدام التجريبي
Cy5 المترافق AffiniPure الحمار المضاد للماعزJackson Labs705-175-147
كواشف الكشف RedSigma- AldrichDU092008-100RXNKit تحتوي على: مخزون محلول الربط (5X) ، ليجاز ، مخزون محلول التضخيم (5X) والبوليميراز.
مسبار DuoLink PLA مضاد للفأر ناقصسيجما- ألدريتشDU092004-100RXN
DuoLink مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى مضاد للأرانب PLUSسيجما- ألدريتشDU092002-100RXN
مصل
الماعز متعدد النسيلة مضاد ل PDX1 (استنساخ A17)سانتا كروزSC-14664RRID: AB_2162373
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
خط خلايا البنكرياس MIN6هدية من D. Stoffersخط خلايا الورم الأنسولي للفأر ، يستخدم في المقايسات القائمة على الخلايا.
الفأر أحادي النسيلة المضاد للجسم المضاد USP8 (استنساخ US872)Sigma- AldrichSAB200527
Pap-penResearch Products International195505
Parafilmاستخدم لإغلاق محاليل الأجسام المضادة والمسبار على خلاياك لمنع التبخر عند استخدام كميات صغيرة من المحاليل.
PBT (محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع تريتون)محلي الصنعلصنع 50 مل: 43.5 مل LddH2O ، 5 مل 10X PBS ، 0.5 مل 10X BSA (محلول 100 مجم / مل) ، 1 مل 10٪ محلول تريتون X-100 في ddH20)
البنسلين الستربتومايسين (100X)Life Technologies15140-122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، 10Xفيشر ScientificBP399-20
PIM (ABS) مصل AB البشريمختبرات برودولابز PIM-ABS001GMP
PIM (G) (الجلوتامين) ProdoLabsPIM-G001GMP
(S) وسائل الإعلامProdo LabsPIM-S001GMP
PR619Apex BioA812
إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتان مع تقنيات DAPILife (المجسات الجزيئية)P36935
الأرنب متعدد النسيلة المضاد ل FLRF / RNF41 (Nrdp1)مختبرات البيثيلA300-049ARRID: AB_2181251
خلايا SH-SY5Yهدية من L. Satinخط خلايا الورم الأرومي العصبي البشري ، المستخدمة في المقايسات القائمة على الخلايا.
بيروفات الصوديوم (100X)تقنيات الحياة11360-070
تريتون X-100فيشر ScientificBP151-100
توين -20فيشر ScientificBP337-100
ماء لعمل الحمض النووي الريبي (مياه DEPC)فيشر ScientificBP361-1L
بقري الجنين PIM

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
  6. Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
  7. Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
  8. Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701(2015).
  9. Silva Xavier, D. a, G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).
  10. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
  11. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334(2006).
  12. Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
  13. Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
  14. Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
  15. Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
  16. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  17. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  18. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756(2016).
  20. Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
  21. Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
  22. Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
  23. Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  24. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NRDP1 USP8 PDX1 ImageJ

مقالات ذات صلة