تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس

Summary

وقد وضعت لعموم lyssavirus النسخ العكسي تفاعل البلمره سلسله للكشف عن جميع الفيروسات المعروفة علي وجه التحديد. وأظهرت المصادقة باستخدام عينات الدماغ من داء المخ للأنواع الحيوانية المختلفة ان هذه الطريقة لها حساسية وخصوصية مكافئه لاختبار الأجسام المضادة الفلورية القياسية الذهبية ويمكن استخدامها للتشخيص الروتيني لداء البشر.

Abstract

للكشف عن فيروس داء البشر والأنواع الأخرى من الأعضاء من جنس lyssavirus داخل الاسره Rhabdoviridae, وقد وضعت لعموم lyssavirus النسخ العكسي تفاعل البلمره سلسله (المتداخلة RT-PCR) للكشف عن المنطقة المحفوظة من الجينات النونوبروتين (N) من الليسيفيروسات. ويطبق الأسلوب النسخ العكسي (RT) باستخدام الحمض النووي الريبي الفيروسي كقالب و اليغو (dT)₁₅ و hexamers عشوائية كما الإشعال لتوليف الفيروسية المتكاملة DNA (cdna). ثم ، يتم استخدام cDNA الفيروسية كقالب لتضخيم 845 bp N الجينات جزء في PCR الجولة الاولي باستخدام الإشعال الخارجي ، تليها الجولة الثانية PCR المتداخلة لتضخيم النهائية 371 bp جزء باستخدام الإشعال الداخلية. هذا الأسلوب يمكن الكشف عن الشقوق الوراثية المختلفة من فيروسات داء القد (RABV). وأظهرت المصادقة ، باستخدام عينات الدماغ 9,624 من ثمانيه أنواع الحيوانية المحلية في 10 سنوات من تشخيص داء البشر السريرية والمراقبة في الصين ، ان الطريقة لديها 100 ٪ حساسية و 99.97 ٪ خصوصية بالمقارنة مع الفلورسنت المباشر اختبار الأجسام المضادة (FAT) ، وهي الطريقة القياسية الذهبية التي أوصت بها منظمه الصحة العالمية والمنظمة العالمية لصحة الماشية. الاضافه إلى ذلك ، فان الطريقة يمكن أيضا تضخيم علي وجه التحديد جزء الجينات N المستهدفة من 15 الأخرى المعتمدة واثنين من الأنواع lyssavirus الرواية في التقرير العاشر للجنة الدولية لتصنيف الفيروسات (ICTV) كما تم تقييمها من قبل الكشف عن تقليد توليف N مورثه البلازميدات من كل [ليسسفيروس]. يوفر الأسلوب بديلا مناسبا للدهون لتشخيص داء السرطان وقد تمت الموافقة عليه كمعيار وطني (GB/T36789) من الصين.

Introduction

داء الإنفلونزا هو مرض حيواني في جميع انحاء العالم تسببه الفيروسات داخل جنس Lyssavirus¹. Lyssavirusesات (الاسره Rhabdoviridae) هي واحده سالبه-التي تقطعت بهم السبل الفيروسات RNA مع ما يقرب من 12 كيلو بايت الجينوم ان ترميز خمسه بروتينات: N, فوسفوبروتين (P), مصفوفة البروتين (M), بروتين سكري (G), والبروتين الكبير أو البوليميريز (L). استنادا إلى متواليات النيوكليوتيد من جين N ، والمسافة الجينية ، وأنماط انتيغينيك ، وقد تم تقسيم الفيروسات إلى 16 نوعا ، والتي تتالف من فيروس الداء الكلاسيكي (RABV) والفيروسات المرتبطة بداء البشر (RRV): فيروس الخفافيش لاغوس (LBV) ، وفيروس Duvenhage ), [موتولا] حمي ([موكف]), اوروبيه خفاش [ليسسفيروس] 1 ([ايبلف-1]), الاوروبيه الخفافيش lyssavirus 2 (EBLV-2), الاستراليه الخفافيش lyssavirus (ABLV), الفيروس Aravan (ARAVAN), فيروس Ikoma (IKOV), Bokeloh بات lyssavirus (BBLV), Gannoruwa بات lyssavirus (GBLV), Irkut الفيروسات (IRKUT), [خوجند] حمي ([خوف]), غربيه قوقازية خفاش حمي ([وكبف]), [شيموني] خفاش حمي ([شبف]), و [ليدا] خفاش [ليسسفيروس] ([ليبف])². وفي الاونه الاخيره ، تم التعرف علي فيروسين إضافيين هما: كوتالاهتي بات ليسسوفيروس (KBLV) معزولة عن مضرب براندت (MyotisBrandistti) في فنلندا في 2017³ وتايوان الخفافيش LYSSAVIRUSES (twblv) معزولة عن بييستوريل اليابانية ( Pipistrellus ابراكوس) في تايوان ، الصين في 2016-2017⁴.

جميع الثدييات عرضه لداء المرض. ومع ذلك ، لا آلافات المرضية الاجماليه أو العلامات السريرية المحددة تسمح بتحديدها ، ويمكن اجراء التشخيص فقط في المختبر⁵. الأسلوب الأكثر استخداما لتشخيص داء السرطان هو الدهون ، والتي تعتبر معيار الذهب من قبل كل من منظمه الصحة الرسمية و^5،6. ومع ذلك ، يمكن ان تنتج FAT نتائج غير موثوق بها علي عينات الانسجه الدماغية المتدهورة/الاوتوزيد. بالاضافه إلى ذلك ، فانه لا يمكن استخدامها لفحص عينات السوائل البيولوجية مثل السائل الدماغي الشوكي ، واللعاب ، والبول ، التالي إلى حد كبير الحيلولة دون توظيفها في التشخيص قبل وفات⁷. الاختبارات التشخيصية التقليدية البديلة ، مثل اختبار العدوى الثقافة الانسجه داء الجلد (رتجيت) واختبار التلقيح الماوس (MIT) ، تتطلب عده أيام⁶، وهو العيب الرئيسي عندما التشخيص السريع أمر ضروري.

الاختبارات التشخيصية الجزيئية المختلفة (علي سبيل المثال ، الكشف عن الحمض الريبي الفيروسي عن طريق RT-PCR ، الفحص المناعي المرتبط بالانزيم PCR [PCR-ELISA] ، في التهجين الموضعي ، وفي الوقت الحقيقي PCR) تستخدم كتقنيات سريعة وحساسة لتشخيص داء السرطان⁸. ويوصي الآن RT-PCR من قبل المعهد البيطري لتشخيص داء السرطان الروتيني ، ويوصف PCR (hn) في دليل الاختبارات التشخيصية واللقاحات للحيوانات البرية للكشف عن جميع الفيروسات المضادة للفيروسات⁵. هنا نحن وصف لعموم lyssavirus المتداخلة RT-PCR ، الذي يسمح الكشف المحددة والحساسة لجميع أنواع الفيروسات الثمانية عشره مقارنه أو تتجاوز التي حصلت عليها FAT. المبدا من الأسلوب [رت] من الهدف [رنا] (يحفظ منطقه من ال [ليسسفيروس] ن مورثه) داخل [كدنا], يتبع بالتضخيم من ال [كدنا] باثنان جولات [بكر]. يخضع cDNA الجولة الاولي PCR مع الإشعال الخارجي لتضخيم جزء bp 845; ثم ، يستخدم PCR الجولة الثانية المنتج PCR الجولة الاولي كقالب لتضخيم جزء bp 371 مع الإشعال الداخلية. الطلقتين من PCR زيادة كبيره في حساسية الفحص.

Protocol

تمت الموافقة علي استخدام الفئران في هذا البروتوكول من قبل اللجنة الاداريه لرعاية الماشية التابعة لمعهد الطب البيطري العسكري ، واكاديميه العلوم الطبية العسكرية ، والصين (ترخيص لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المختبري ، والسماح عدد JSY-DW-2010-02). واتبعت جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية.

1. استخراج RNA

1. استخراج الحمض الريبي النيبالي من الدماغ-يشتبه في انسجه المخ, الخزعات الجلد, اللعاب, أو السائل الدماغي الشوكي أو من الخلايا المصابة RABV الثقافة, باستخدام guanidinium ايزوثيسيانات-الفينول-كلوروفورم-القائم علي طرق الاستخراج أو الفيروسية المتاحة تجاريا مجموعات استخراج. استخدام الجيش الريبي النيبالي استعداد علي الفور أو تخزينه في-80 درجه مئوية حتى المطلوبة.

2. عكس النسخ من RNA الفيروسية

1. أزاله الكواشف RT المدرجة في الجدول 1 من الفريزر ، والاحتفاظ بها علي الجليد ، وذوبان والدوامة لهم قبل الاستخدام.
2. اعداد 12 μL من مزيج رد فعل RT في أنبوب PCR 0.2 mL مع الكواشف المدرجة في الجدول 1. السماح بالتغييرات التي يتم وضعها بالأنابيب من خلال اعداد حجم المزج الرئيسي بحجم تفاعل واحد علي الأقل أكبر من المطلوب.
3. أضافه 8 μL عينه ، السيطرة الايجابيه RNA أو السيطرة السلبية لمزيج رد فعل RT داخل محطه عمل PCR في غرفه قالب. ال [رت] تحكم ايجابيه [رنا] يستخرج من الخلية ثقافة يعدي مع ثابته [ربف] سلاله سيره ذاتية-11 (تحدي حمي معيار-11) ويخزن في-80 [ك.]. السيطرة السلبية يحتوي علي RNase خاليه ddH₂س.
4. خلط محتويات أنابيب RT بواسطة vortexing; ثم ، الطرد المركزي لفتره وجيزة.
5. حمل أنابيب التفاعل إلى التدوير الحراري. اعداد برنامج التوليف cDNA مع الشروط التالية: 42 درجه مئوية ل 90 دقيقه ، 95 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، و 4 درجه مئوية علي الانتظار. تعيين حجم رد الفعل إلى 20 μL. بدء تشغيل RT.

3-الجولة الاولي من PCR

1. الحفاظ علي الكواشف PCR المدرجة في الجدول 2 علي الجليد في غرفه نظيفه حتى استخدام; ثم ، ذوبان والدوامة لهم.
2. اعداد مزيج PCR الجولة الاولي في أنبوب PCR 0.2 mL مع الكواشف المدرجة في الجدول 2.
3. أضافه 2 μl عينه من cdna أو البلازميد في مزيج pcr الجولة الاولي داخل محطه عمل pcr في غرفه قالب. السيطرة الايجابيه PCR هو السيرة الذاتية-11 cDNA أعدت علي النحو المذكور في الخطوة 2.3 لأسلوب RT أعلاه. السيطرة السلبية PCR هو ddH₂O.
4. نقل أنابيب مختومه إلى الدورية الحرارية PCR ودوره باستخدام المعلمات المدرجة في الجدول 3.

4-الجولة الثانية PCR

1. اعداد مزيج PCR الجولة الثانية في أنبوب PCR 0.2 mL باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 4.
2. أضافه 2 μL من المنتج PCR الجولة الاولي في مزيج PCR الجولة الثانية. الاضافه إلى ذلك ، وتشمل ddH₂O كعنصر تحكم سلبي من PCR الجولة الثانية.
3. أداء الدراجات الحرارية PCR باستخدام نفس المعلمات كما هو معطي في الخطوة 3.4.

5. تحليل المنتجات PCR من قبل الكهربائي علي اجبرز الهلام

1. اعداد هلام الاغاروز 1.5 ٪ عن طريق أضافه 1.5 غرام من اجنشا إلى 100 مل من تريس-خلات-أدتا (تاي) وحلها بدقه عن طريق تسخينه في فرن الميكروويف.
2. أضافه بروميد ايثيديوم (EB) (بتركيز نهائي 0.01%) أو بديل آخر للمجلس التنفيذي التجاري. اسكبي الجل في القالب واتركيه ليصلب عند درجه الحرارة المحيطة لمده 30 دقيقه علي الأقل.
3. اعداد عينات التحميل عن طريق خلط 5 μL من كل منتج PCR مع 1 μL من 6x المخزن المؤقت التحميل.
4. تحميل العينات ومناسبه الحمض النووي علامة علي حده في الآبار وتشغيل هلام لحوالي 30-45 دقيقه في 120 V حتى خط صبغ ما يقرب من 75 ٪-80 ٪ أسفل الهلام.
5. إيقاف الطاقة ، وقطع الأقطاب الكهربائية من مصدر الطاقة ، ومن ثم ، بعناية أزاله هلام من مربع هلام.
6. استخدام هلام الاشعه فوق البنفسجية توثيق الجهاز لتصور وتصوير شظايا الحمض النووي.

6. توصيف المتداخلة RT-PCR

1. 6.1 الخصوصية والحساسية للكشف عن 18 lyssaviruses
   1. النظام 18 البلازميدات التجارية التي تحتوي علي جين كامل من كل lyssavirus (16 الأنواع ICTV واثنين من الأنواع الجديدة) لل PCR.
   2. حساب رقم النسخة من البلازميد باستخدام رقم avogadro (N_A) والصيغة التالية.
      [(g/μl البلازميد الحمض النووي)/(بلازميد طول في bp x 660)] × 6.022 × 10²³ = عدد الجزيئات/μl
   3. اعداد حلول الأسهم (2.24 × 10⁹ جزيئات/μl) من جميع البلازميدات 18 في ddh₂O.
   4. أداء البلازميدات التسلسلي اضعاف 9 10 كل 18 في ddh₂س. تمييع 10 μl من كل الأسهم البلازميد مع 90 μl من ddh₂س. دوامه والطرد المركزي لفتره وجيزة.
   5. اجراء تضخيم PCR كما هو موضح في الأقسام 3-5.
   6. تحليل خصوصية وحساسية PCR المتداخلة عن طريق الكشف عن سلسله من البلازميدات lyssavirus.
2. تحديد الرتبة د ايكتيون ل نهائي
   1. ضبط عيار من سلاله فيروس داء السل السيرة الذاتية-11 خليه ثقافة إلى 10^5.5 tcid₅₀/ml (فيروس عيار تحدد وفقا لدليل التربية الحيوانية)⁵.
   2. أداء التخفيفات التسلسلية 5 10 اضعاف من CVS-11 (الحل الأسهم هو 10^5.5 tcid₅₀/ml) كما هو موضح في الخطوة 6.1.4.
   3. اجراء استخراج RNA والمتداخلة RT-PCR إجراءات التضخيم لجميع التخفيفات الفيروسية كما هو موضح في الأقسام 1-5.
3. يقارن ison من ال المتداخلة RT-PCR مع "معيار الذهب" الدهون
   1. اختبار جميع العينات السريرية المتداخلة RT-PCR ، ومن ثم ، تاكيد النتائج مع FAT⁵ و N التسلسل الجيني⁹.
   2. استخدم البيانات التي تم تطبيعها للتحليل الإحصائي مع SAS 9.1. استخدم اختبار كابا واختبار التربيع التربيعي ل McNemar للمقارنة الاحصائيه للاختبارات التشخيصية (الأمر SAS: proc freq; الجدول/الموافقة). حساب الفواصل الزمنيه للثقة علي افتراض التوزيع السري.
4. تقييم الفعالية في اختبار العينات المتدهورة
   1. كشف اثنين من العينات السريرية الدماغ المؤكدة من النقانق المسعورة في 37 درجه مئوية.
   2. فحص عينات اثنين في كل يوم من التعرض في 37 درجه مئوية من قبل المتداخلة RT-PCR ، والدهون ، ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا⁵.

Results

وترد نتائج المتداخلة RT-PCR للكشف عن 18 أنواع lyssavirus في الشكل 1. وأظهرت جميع الضوابط الايجابيه PCR 845 bp المتوقع في الأول-و 371 bp في التكبير الجولة الثانية مع عدم وجود فرقه في السيطرة السلبية. جميع الفيروسات 18 أنتجت المتوقع 845 و/أو العصابات bp 371 ، مشيرا إلى ان المتداخلة RT-PCR الكشف عن جميع الفيروسات 18. وكان سته عشر الفيروسات lyssaviruses التضخيم كفاءه في جولتين من PCR, ولكن اثنين, وهما ARAV و IKOV, وكان التضخيم في اما الاولي أو الثانية الجولة PCR. وتباينت حساسية الأسلوب في الكشف ...

Discussion

وفي الوقت الراهن ، فان الشركة هي أحد الفيروسات الرئيسية المسؤولة عن تقريبا كل داء البشر والحيوانية في الصين ، وكذلك في بلدان أخرى. الاضافه إلى ذلك ، تم التعرف أولا علي متغير من نوع irkv من الخفافيش التي كانت من نوع "اورنا ليوكواستر " في مقاطعه جيلين في شمال شرق الصين في ال2012¹⁰، وأفيد بأنه يتسبب في وفاه الكلبة في مقاطعه لياونينغ في ال2017¹¹. في الاونه الاخيره ، تم التعرف أيضا علي الفيروس الجديد ، TWBLV ، من الخفافيش pipistrelle اليابانية في تايوان ، الصين...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 & مرات TAE	مختلف
مختلف 6 & تحميل العازلة	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright & reg ؛ Inc	A-2015-100g
ddH2O	مختلف
DL 2,000 ماركر	تاكارا	3427A
dNTPs (10 ملم)	TakaRa	4019
dNTPs (2.5 ملم)	TakaRa	4030
نظام الرحلان الكهربائي	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/μ ل)	تصوير جل TakaRa	RR001
	UVITEC	Fire Reader
	الطرد المركزي	النسخ العكسي M-MLV المختلفة
(200 وحدة دولية /& ميكرو ؛ ل)	TakaRa	2641A
NanoDrop 1000 مقياس الطيف	العلمي الحراري	ND1000
Oligo (dT) 15< / sub>	TakaRa	3805
PCR Machine	BIO-RAD	T100
PCR أنابيب	مختلفة
مختلفة من الحمض النووي عالي الدقة متعدد	نيو إنجلاند BioLabs	M0530S
الماصات	مختلف
التمهيدي العشوائي العشوائي	TakaRa	3801
RNase Inhibor (40 وحدة دولية /µ L)	TakaRa	2313A
RNase خال من ddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10 مرات ؛)	نصائح TakaRa	9152A
	مختلفة
خلاط دوامة	مختلفة مختلفة