هذا البروتوكول تفاصيل الاجراء الذي يتم محول الثقافات العصبية البشرية مع لينتيفيرال ثوابت الترميز لمتحولة تاو الإنسان. الثقافات محوله عرض المجاميع تاو والامراض المرتبطة بها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج في المختبر لدراسة التجميع تاو باستخدام لينتيفيرال-بوساطة الخلايا العصبية البشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التراكم الشاذ من البروتين تاو يشارك بشكل مرضي في عدد من الامراض التنكسية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD). علي الرغم من ان نماذج الفئران من تواعتلال قدمت موردا قيما للتحقيق في أليات العصبية من تاو المجمعة ، فانه أصبح من الواضح علي نحو متزايد انه ، بسبب الاختلافات بين الأنواع في الفيزيولوجيا العصبية ، والدماغ الماوس غير مناسب نمذجة الحالة الانسانيه. التقدم في أساليب ثقافة الخلية جعلت ثقافات الخلايا العصبية البشرية في متناول للاستخدام التجريبي في المختبر وساعدت في تطوير المداواة العصبية. ومع ذلك ، علي الرغم من التكيف مع الثقافات خليه الخلايا العصبية البشرية ، في المختبر نماذج من الاعتلال البشري ليست متاحه علي نطاق واسع حتى الآن. يصف هذا البروتوكول نموذجا خلويا لتجميع تاو الذي يتم فيه توصيل الخلايا العصبية البشرية بالمتجات المشتقة من لينتيفيرال التي تم دمجها بالشفرة المتحولة بشكل باثوجيوكلي مع مراسل البروتين الفلوري الأصفر (YFP). الثقافات المحولة تنتج المجاميع تاو ان وصمه عار إيجابيا لثيوفلافين وعرض علامات السمية العصبية ، مثل انخفاض طول اكسنال وزيادة حجم الليسومال. وقد يكون هذا الاجراء نموذجا مفيدا وفعالا من حيث التكلفة لدراسة الامراض البشرية.
المقدمة
التراكم المرضي من البروتين المرتبط بالبولية الصغيرة تاو هو سمه مميزه للعديد من الامراض التنكسية ، بما في ذلك AD ، الخرف الجبهي الامامي (FTD) ، ومرض البيك ، والشلل التقدمي التقدمي (PSP)1. في حاله غير المريضة ، تاو يربط ويستقر خيوط ميكروتوبولي في محاور الخلايا العصبية2. ومع ذلك ، والمرتبطة بالمرض فرط فوسفونات تاو يعزز تجميع تاو ، التفكك من الأنابيب الدقيقة ، وسميه الخلايا العصبية3. الآثار السامة لل تاو المجمعة قد تنطوي علي تفعيل الشاذة من الكوليني4 ومستقبلات جلوتاميلجيك5 مما ادي إلى خلل في الكالسيوم داخل الخلايا و, في نهاية المطاف, موت الخلية. في النما....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. اعداد وسائل الاعلام والكواشف
- الذوبان في الطابق السفلي غشاء مصفوفة طلاء للوحات الثقافة في 4 درجه مئوية (لا تسمح مصفوفة غشاء الطابق السفلي لتسخين أو انها سوف يصلب). جعل 1 مل قسامات وتخزينها في-20 درجه مئوية أو-70 درجه مئوية.
- أعاده تكوين الخلايا الليفية الاساسيه عامل النمو (bFGF) في معقم الفوسفات-المالحة المخزنة مؤقتا (التلفزيونية الخاصة) في 10 ميكروغرام/مل وجعل 10 μL aliquots. تخزينها في 4 درجه مئوية.
- إلى زجاجه جديده ، غير مفتوحة ، 500 mL من DMEM/F12 مع الجلوتامين ، أضافه B27 (10 مل) ، N2 (5 مل) ، والبنسلين-ستربتوميسين (5 مل). مكان 50 mL من هذه الخلايا الجذعية العصبية (القومي) وسائل الاعلام في أنبوب مخروطي وأضافه 10 μL من 10 ميكروغرام/μL....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم المفتاحية تاو-RDLM-YFP-محول الخلايا العصبية فلوريسسينتلي مع YFP ، والثقافات RDLM-محول عرض المجاميع بعد المحولة. هذه الشوائب الملونة الايجابيه لثيوفلافين (الشكل 1). كما يوضح الشكل 1 ، ينتج هذا البروتوكول ثقافات الخلايا العصبية التي تعرض مجاميع tau الموجبة لثيوفلافين. للتجارب الاوليه ، فمن المستحسن ان يتم تاكيد تمايز الخلايا العصبية عن طريق المناعية علامة الخلايا العصبية الخاصة β-أنابيب الثالث في الثقافات. الأهم من ذلك ، ينبغي ان يكون الأجسام المضادة الثانوية ف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول توليد نموذج في المختبر لاعتلال الأمعاء البشرية الذي يسلك المجاميع الايجابيه للبقع الفضية والتشابك العصبي الليفي ثيوفلافين الإيجابي (NFTs). وعلاوة علي ذلك ، تعرض الخلايا المحولة الامراض التي يسببها تاو مثل العيوب المورفولوجية ، وانخفاض synaptogenesis ، وزيادة حجم الليسومال. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو انه يوفر نموذجا يمكن الوصول اليها وفعاله من حيث التكلفة لاعتلال الخلايا العصبية ، والتي يمكن استخدامها لدراسات فحص المخدرات ، وكذلك لتحليل سميه تاو. هذا النموذج يملا حاجه المادية في البحوث العصبية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتور بيتر ديفيس في كليه البرت اينشتاين للطب لتوريد الأجسام المضادة PHF-1 و CP13 والدكتور مارك دايموند في جامعه تكساس ، جنوب غرب ، لتوفير ثوابت تاو. وقد دعم هذا العمل بمنح من جمعيه الزهايمر (NIRG-14-322164) إلى S.H.Y. ومن معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (TB1-01193) إلى شعبي
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أطباق استزراع 10 سم | Thermofisher | 12556002 | |
| أنابيب 15 مل Biopioneer | CNT-15 | ||
| 16٪ بارافورمالدهيد | ثيرموفيشر | 50-980-487 | |
| 24 لوحة ثقافة بئر | Thermofisher | 930186 | |
| 50 مل أنابيب | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70٪ إيثانول في زجاجة | رذاذمصادر مختلفة | NA | |
| B27 مكمل | Thermofisher | 17504044 | |
| مصفوفة غشاء القاعدية (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| أساسي FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| ألبومين مصل الأبقار | Sigma | A7906 | |
| حاضنة ثقافة الخلايا | مصادر مختلفة | NA | |
| أجهزة الطرد المركزي | مصادر مختلفة | NA | |
| DMEM-F12 وسائط الثقافة مع الجلوتامين | Thermofisher | 10565042 | |
| الإيثانول (تركيز 50٪ أو أعلى) | مصادر مختلفة | NA | |
| الأجسام المضادة الثانوية المسماة | مصادر مختلفة ، تعتمد على التجربة | ||
| الفلوري | مصادر مختلفة | NA | |
| أغطية زجاجية | Thermofisher | 1254581 | |
| شرائح زجاجية | Thermofisher | 12-550-15 | |
| الخلايا الجذعية العصبية البشرية | مصادر مختلفة | NA | |
| ناقلات الفيروسات العدسية | مصادر مختلفة | ترتيب | |
| وسائل الإعلام تصاعد | Thermofisher | P36934 | |
| N2 الملحق | Thermofisher | 17502048 | |
| البنسلين الستربتومايسين | Thermofisher | 15140122 | |
| الفوسفات المحلول | الملحي المخزن Thermofisher | 14190250 | |
| الأجسام المضادة الأولية | مصادر مختلفة ، تعتمد على التجربة | NA | |
| هزاز أو منصة دوارة | مصادر مختلفة | NA | |
| غطاء ثقافة | الخلايا المعقمةمصادر مختلفة | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| حمام مائي | مصادر مختلفة | NA |
المراجع
- Rojas, J. C., Boxer, A. L. Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).
- Kadavath, H., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
