مقالة منهجية

تخفيض حجم العمليات الجراحية لدراسة قياس النمط الجنيني

DOI:

10.3791/59434

⸱

مايو 3, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقوم بوصف طريقه للحد من حجم الاجنه الزبرده دون تعطيل العمليات التنموية الطبيعية. تمكن هذه التقنية من دراسة قياس النمط ومتانة النمو ضد تغيير الحجم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العملية التنموية ، تظهر الاجنه قدره رائعه علي مطابقه نمط أجسامهم مع حجم أجسامهم. يتم الحفاظ علي نسبه الجسم حتى في الاجنه التي هي أكبر أو أصغر ، في حدود معينه. وعلي الرغم من ان ظاهره التحجيم هذه قد اجتذبت الاهتمام لأكثر من قرن ، فان فهم أليات الاساسيه كان محدودا ، ويعزي ذلك جزئيا إلى عدم وجود وصف كمي لديناميات النمو في الاجنه ذات الاحجام المختلفة. للتغلب علي هذا القيد ، قمنا بتطوير تقنيه جديده للحد جراحيا من حجم الاجنه الزكية ، والتي لها مزايا كبيره للتصوير الحي في الجسم. ونحن نثبت انه بعد الازاله المتوازنة للخلايا والصفار في مرحله الخلايا البدائية في خطوات منفصلة ، يمكن للجنين ان يتعافى بسرعة في ظل الظروف المناسبة ويتطور إلى أجنه أصغر حجما ولكنها طبيعيه. وبما ان هذه التقنية لا تتطلب معدات خاصه ، فانها قابله للتكيف بسهوله ، ويمكن استخدامها لدراسة مجموعه واسعه من مشاكل التحجيم ، بما في ذلك متانة الزخرفة بوساطة مورفجين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد عرف العلماء منذ فتره طويلة ان الاجنه لديها قدره ملحوظة علي تشكيل نسب الجسم ثابته علي الرغم من ان حجم الجنين يمكن ان تختلف اختلافا كبيرا في ظل الظروف الطبيعية والتجريبية1,2,3. وعلي الرغم من عقود من الدراسات النظرية والتجريبية ، فان هذا المتانة لتغيير الحجم ، الذي يطلق عليه التحجيم ، وألياته الاساسيه لا تزال غير معروفه في العديد من الانسجه والأعضاء. من أجل التقاط مباشره ديناميات النظام النامية ، انشانا تقنيه الحد من حجم استنساخه وبسيطه في الزرد4، والتي لديها ميزه كبيره في الحية في التصوير5.

وقد عملت zebrafish كنموذج فقاري الحيوانية لدراسة تخصصات متعددة من علم الاحياء ، بما في ذلك البيولوجيا التنموية. علي وجه الخصوص ، الزرد مثاليه لفي الجسم الحية التصوير6 لان 1) يمكن المضي قدما في التنمية عاده خارج الام وقذيفة البيض ، و 2) الاجنه شفافة. الاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تحمل الاجنه بعض درجات الحرارة والتقلبات البيئية ، والتي تسمح لهم بالدراسة في الظروف المختبرية. أيضا ، بالاضافه إلى التقليدية الجينات التعبير عن الاضطراب من قبل مورفينو والحقن mrna7،8، التطورات الاخيره في تقنيه crispr/كاس 9 جعلت الوراثة العكسية في الزرد كفاءه عاليه9. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيق العديد من التقنيات الكلاسيكية في علم الاجنه ، مثل زرع الخلايا أو جراحه الانسجه4،10،11.

تم تطوير تقنيات الحد من حجم في الأصل في البرمائيات وغيرها من الكائنات غير فقاري12. علي سبيل المثال ، في xenopus لفيس، نموذج آخر فقاري الحيوانية الشعبية ، والميل علي طول محور الحيوانية النباتية في مرحله البدائية يمكن ان تنتج حجم الاجنه المخفضة12،13. ومع ذلك ، في ايدينا يؤدي هذا النهج خطوه واحده في الاجنه البطنية أو البطينية في zebrafish ، من المفترض لان المحددات الظهرية موزعه بشكل غير متساو ولا يمكن للمرء ان يعرف توطينها من المورفولوجية من الاجنه. هنا نظهر تقنيه تقطيع بديله من خطوتين للزبرافين التي تنتج عاده الاجنه النامية ولكن أصغر. مع هذه التقنية ، يتم أزاله الخلايا أولا من قطب الحيوانية ، وهي منطقه من الخلايا الساذجة التي تفتقر إلى نشاط المنظم. لتحقيق التوازن بين كميه صفار البيض والخلايا ، وهو أمر مهم ل epiboly واللاحقة النشاه ، ثم يتم أزاله صفار البيض. هنا ، ونحن بالتفصيل هذا البروتوكول وتقديم مثالين من الثوابت حجم في تشكيل نمط ؛ الجسيده تشكيل والبطنية أنبوب العصبية زخرفه. الاضافه إلى التصوير الكمي ، استخدمنا تقنيه تخفيض الحجم لدراسة كيفيه تاثر احجام الأنابيب العصبية والعصبية في حجم الاجنه المخفضة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد نفذت جميع الإجراءات المتعلقة بالأسماك بموافقه اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الماشية في كليه الطب بجامعه هارفارد.

1. أداه والتحضير الكاشف

  1. جعل حلقه الأسلاك لتقطيع الاجنه
    1. خذ 20 سم من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدا التي هي قاسيه وغير قابله للتاكل مع قطر 40 μm. حلقه السلك من خلال إلى الزجاج الشعرية (1.0 مم القطر الخارجي ، 0.5 مم القطر الداخلي ، لا خيوط) ، مما يجعل حلقه صغيره في الأعلى (طول حلقه هو 1.0 مم)
    2. وضع قطره صغيره من طلاء الأظافر واضحة علي غيض من الزجاج الشعرية بين حلقه الأسلاك لعقد في مكان. دع الجافة. تاكد من عدم الحصول علي اي طلاء الأظافر علي جزء حلقه ، لأنها قد تضر الاجنه.
    3. نعلق الشعرية الزجاج مع حلقه علي عود خشبيه (9 "عيدان الخيزران المتاح مكسوره في نصف) باستخدام الشريط المختبر. ترك حوالي 2.5 سم من الزجاج الشعرية تمتد خارج عود ، بحيث الجزء عود من الاداه لا تراجع في الماء. اضبط هذا الطول علي التفضيل.
  2. بدلا من ذلك ، اصنع ابره زجاجيه لتقطيع الاجنه
    1. قرصه واحده من نهاية الزجاج الماصة باستور مع ملقط ، في حين عقد الجانب الآخر مع اليد. سخني الجزء الرفيع من الماصة فوق مصباح الروح أو موقد Bunsen.
    2. اسحب الماصة الزجاجية باليد. الماصة المثالية كقطر حوالي 30 ميكرومتر ومنحني لطيف (نصف قطر الانحناء = حوالي 5 مم). يتم الحصول علي القطر المناسب وانحناء مع الممارسة وبعض الفرص.
  3. اعداد السليلوز الميثيل
    1. يستخدم ميثيل السليلوز للاحتفاظ بالاجنه اثناء التقطيع. جعل 2 ٪ محلول السليلوز ميثيل في الحل 1/3x الرنين (116 mM NaCl ، 2.9 mM KCl ، 1.8 mM CaCl2، و 5 مم 4-(2-هيدروكسي ايثيل) حمض -1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (hepes ؛ pH 7.2)). يهز مسحوق السليلوز الميثيل في 1/3x الحل الرنين في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
    2. اختياريا ، أضافه ~ 1.5 mL الفينول الأحمر (0.5 ٪ في محلول الأسهم DPBS) إلى 10 مل 2 ٪ محلول ميثيل السليلوز ، حتى الأحمر ، لجعل الحل مرئيا. يهز حتى يصبح اللون موحده.

2. اعداد أجنه الزيبرافيش للحد من الحجم الجراحي

  1. جمع الاجنه
    1. وضع واحد أو اثنين من الذكور وواحد أو اثنين من الإناث الزرد في غرفه التزاوج مليئه بالكثير من الماء. فصل الذكور والإناث باستخدام المفرق البلاستيكية. استخدام خط AB للتصوير الجسيده (القسم 4) وسطر مراسل المحورة وراثيا من زخرفه الأنبوب العصبي (nkx 2.2: mgfp ، dbx1b: gfp، أو Olig2: dsred) للتصوير الأنابيب العصبية. اتركهم في الغرفة بين عشيه وضحيها.
      ملاحظه: اختيار البالغين مهم للحصول علي البيض الذي البقاء علي قيد الحياة جراحه جيدا. عاده ، الإناث الأصحاء الشباب تنتج البيض صحية.
    2. في صباح اليوم التالي ، نقل الغرفة إلى المياه الضحلة ووضع الغرفة مع أماله طفيفه. أزاله المفرق حتى الأسماك يمكن ان تكون زميله.
    3. جمع البيض عن طريق سكب في مصفاه الشاي. نقل البيض إلى طبق بيتري مع ماء البيض (ل 20x بيضه المياه ، 6 غرام ملح البحر الفورية ، 1.5 g CaSO4 و 1 L H2O ؛ استخدام في 1x). لتحسين التدريج ، وجمع البيض الحق بعد التفريخ. ضعي الاجنه في حاضنه 28.5 درجه مئوية.
    4. إذا لزم الأمر ، حقن مورفينو ، mrna ، وما إلى ذلك ، في مراحل خليه 1-4 بعد بروتوكول مشترك7،8. حقن mRNA لتسميه الغشاء الفلورسنت (م-mCherry ، mBFP1، أو ميم-mcitrine) للتصوير بالأنابيب العصبية (القسم 5).
  2. ديتشوريوناتي باستخدام pronase
    1. حول الخلية 128 إلى 256-خليه المرحلة ، نقل الاجنه الصحية إلى طبق من الزجاج 35 ملم مليئه بمياه البيض. أزاله قدر الماء البيض قدر الإمكان من الطبق.
    2. أضافه 1 مل من 20 ملغ/مل pronase. حرك الاجنه برفق عن طريق تحريك الصفيحة وماصه المحلول برفق لاعلي ولأسفل للمساعدة في التقشير باستخدام ماصه زجاجيه.
    3. عندما تبدا المشيمة لإنقاص مرونة (عاده 1-4 دقيقه بعد أضافه pronase ، اعتمادا علي كميه من البيض والماء) ، أضافه الكثير من الماء البيض قدر الإمكان لتمييع pronase. تقييم فقدان مرونة عن طريق لمس المشيماء بلطف مع ملقط. يجب علي المشيماء عقد دنت دون ارتداد علي الفور إلى الوراء. نقل البيض إلى طبق آخر مع ماء البيض باستخدام ماصه الزجاج (في هذه المرحلة ، ومعظم الدعامات ليست مكسوره).
      1. بدلا من ذلك ، اسكب الاجنه برفق من الطبق في كوب زجاجي كبير 400 مل مملوء بماء البيض دون تعريض الاجنه للهواء. ثم ، دع الاجنه تستقر تماما. أماله الكاس للسماح الاجنه تسقط إلى جانب واحد. اجمع هذه الاجنه باستخدام ماصه زجاجيه وانقلها إلى طبق زجاجي جديد 35 ملم مليء بمحلول الرنين 1/3x.
    4. الانتظار لعده دقائق حتى يفقد معظم الدعامات مرونة تماما. أزاله المشيمة المتبقية من الاجنه عن طريق الأنابيب بلطف البيض. أزاله الاجنه التالفة واحتضان الاجنه في حاضنه 28.5 درجه مئوية.

3. تخفيض حجم الجراحية والانتعاش

  1. اعداد واحد نظيفه 35 mm طبق الزجاج. انتشار حوالي 0.5 مل من 2 ٪ ميثيل السليلوز (في 1/3x الحل الرنين ، مع الفينول الأحمر للمساعدة في تصور) بالقرب من مركز الجزء السفلي من الطبق أكبر باستخدام ملعقة من البلاستيك. بشكل رقيق التساوي انتشار السليلوز الميثيل إلى سماكه حوالي 0.5 مم.
  2. صب ما يقرب من 30 مل من محلول الرنين 1/3x إلى جانب الطبق والسماح للانتشار علي بقية الطبق ، وتغطي ميثيل السليلوز.
  3. وضع الاجنه dechorionated في المرحلة 256-خليه-1k-الخلية علي 2 ٪ ميثيل السليلوز. ضبط اتجاه الاجنه علي الجانب لتصور كل من الخلايا وصفار البيض. (الشكل 1)
  4. ختم ما يقرب من 30 ٪-40 ٪ من الخلايا من الأديم النخاعي بالقرب من قطب الحيوانية عن طريق قطع عمودي علي محور الحيوانية النباتية باستخدام حلقه الأسلاك (أو ابره الزجاج) (الشكل 1، لوحات العليا). بعد أزاله الخلايا ، انقر برفق علي الأطراف معا لمساعده الخلايا المتبقية علي التصاق مره أخرى. في غضون دقائق ، الخلايا الميتة يجب ان تقلع عندما يبدا الجنين في الشفاء.
  5. جعل جرح صغير لصفار البيض بالقرب من القطب النباتي بدلا من "تقطيع" صفار البيض (الشكل 1 لوحات الأوسط). جرح الصفار عن طريق خداع غشاء البيضة مع الأسلاك التي شنت. سوف الصفار الخروج لبضع دقائق بعد أصابه ، ومن ثم سوف تلتئم الجرح (الشكل 1 لوحات القاع).
  6. عندما يتوقف الصفار عن الخروج ، حرك الجنين باستخدام ماصه pipet-x خارج ميثيل السليلوز في نفس الطبق للسماح لهم بالتعافي بشكل أفضل.
  7. كرر الخطوات 3-4-3.6 لجميع الاجنه. اترك الطبق مستقرا لمده 30 دقيقه بينما تتعافي الاجنه.
  8. نقل الاجنه إلى طبق جديد مع حل الرنين 1/3x الطازجة ووضعها في 28.5 درجه مئوية حاضنه للسماح لهم للتعافي تماما.
    1. اختياري إذا كانت مرحله الاهتمام هي المرحلة المبكرة ، يمكن احتضان الاجنه عند 20 درجه مئوية بعد احتضانها عند 28.5 درجه مئوية حتى مرحله الدرع ، لضبط توقيت التجريب والتصوير.

4. التصوير الحي لمرض التصلب العصبي الوحشي

  1. اعداد 100 مل من محلول اجنشا 1 ٪ عن طريق أضافه 1 غرام من اجنشا إلى 100 مل من الماء البيض ، والتدفئة حتى يتم حلها تماما الاغاروز. السماح لتبرد لمده 5-10 دقيقه إلى درجه حرارة 62-72 درجه مئوية.
  2. اعداد جبل للتصوير.
    ملاحظه:     تم تطوير هذا الدليل للاستخدام مع المجهر واسعه المجال المقلوب.
    1. صب ~ 15 مل من 1 ٪ اجنشا في إلى 100 مم × 15 مم البلاستيك طبق بيتري.
    2. ضع برفق قالب العفن V1 جبل الظهرية5 علي الجزء السفلي من طبق بتري. الحفاظ علي العفن في الجزء السفلي باستخدام الوزن ، مثل أنبوب 15 مل مع الماء.
      ملاحظه: وهذا هو الحال بحيث تكون الاجنه قريبه من أسفل طبق بيتري قدر الإمكان ، عند استخدام المجهر المقلوب. علي الرغم من ان يتم تركيب الاجنه أفقيا للتصوير الجسيده ، هنا يستخدم الظهرية جبل V15 لأنه يحمل الاجنه أفضل في مراحل مبكرة الجسيده.
    3. دعوانا تبرد حتى يتم وطد تماما. صب في ~ 30 مل من الماء البيض مع 0.01 ٪ tricaine ، وأزاله العفن بعناية عن طريق المتطفلين بلطف قباله مع ملقط.
  3. أجنه الجبل للتصوير المنوم
    1. اعداد 1 ٪ ذوبان منخفضه اجنشا في الحل 1/3x الرنين (أو البيض المياه) والاحتفاظ بها في 42 درجه مئوية. انتظر حتى تصل درجه الحرارة إلى 42 درجه مئوية.
    2. تحت مجهر التشريح ، ضع جنينا واحدا لكل بئر. ماصه ما يقرب من 1 μL من ذوبان منخفضه في البئر لضبط بدقه حجم البئر إلى حجم الاجنه الفردية التي تختلف في الحجم ، وخاصه بين الذين يعانون من وبدون خفض الحجم.
    3. توجيه الاجنه بسرعة قبل ان يتم تدعيم ذوبان منخفضه حتى الاجنه وجها أفقيا تماما إلى الطبق. بعد الاجنه المتصاعدة ، ضع برفق زلة الغطاء في الجبل الذي نشا لحمل الاجنه في مكانها. ويكتسي هذا التوجه اهميه خاصه بالنسبة للتصوير الطويل الأمد لتصوير الاجنه لأنه يجب ان يتم تركيبها أفقيا بالبالضبط لجميع الحدود التي يمكن ان تكون واضحة في مراحل لاحقه.
    4. الدمج بعيدا عن منطقه التركيب والتلاعب 25 مم × 25 مم غطاء الزجاج بحيث يتم أزاحه 45 درجه من اتجاه المسافة البادئة مربع التي ادلي بها العفن. الشريحة كوفيرسليب علي العفن في هذا الاتجاه حتى كل زاوية يستريح من جانب مختلف من العفن.
      ملاحظه: علي الرغم من ان هذا البروتوكول هو لمجهر مقلوب ، وضع الزجاج غطاء علي راس القالب لا تزال مهمة بحيث لا تتحرك الاجنه في حين نقل إلى المجهر.
  4. عمليه تشكيل التصوير المنوم
    1. تسخين المجهر إلى 28 درجه مئوية في حاضنه بنيت مع لوحات foamcore وسخان مجلس الوزراء.
    2. ضع طبق بيتري مع الاجنه المثبتة علي مرحله المجهر. العثور علي الجنين التي شنت في اعلي اليسار جيدا من جبل اجبرز مع عدسه التكبير اقل ، ثم التبديل الهدف إلى 10x.
    3. اعداد اكتساب الصور.
      ملاحظه: هذا التعليم هو لحقل مشرق.
    4. العثور علي شروط للقوه الخفيفة ، والوقت التعرض ، والمكثف بحيث يمكن رؤية الحدود الجسيده بوضوح. باستخدام إعدادات المكدس z تعيين ادني واعلي مستوي التصوير المطلوب. تعيين إجمالي الوقت والفترة الزمنيه. العثور علي وتسجيل المواقع xy من جميع الاجنه التي شنت بحيث يمكن ان تكون الاجنه متعددة العمر في وقت واحد.
  5. قياس أطوال PSM والجسيدات باستخدام فيجي16.

5. تصوير الأنبوب العصبي زخرفه

  1. اعداد 100 مل من محلول اجنشا 1 ٪ عن طريق أضافه 1 غرام من اجنشا إلى 100 مل من الماء البيض ، والتدفئة حتى يتم حلها تماما الاغاروز. السماح لتبرد 5-10 دقيقه إلى 62-72 درجه مئوية. ضبط tricaine إلى 0.01 ٪.
  2. اعداد جبل الظهرية للتصوير.
    ملاحظه:     تم تطوير هذا الدليل للاستخدام مع المجهر مضان تستقيم. لمقلوب المجاهر المجهر الاطباق أسفل ضرورية وتصاعد التوجه في الخطوة 3 انقلبت.
    1. صب في ~ 15 مل من 1 ٪ اجنشا في إلى 100 مم × 15 مم البلاستيك طبق بيتري. تعويم برفق قالب V1 جبل الظهرية علي سطح اجنشا لتجنب إدخال فقاعات الهواء. دعوانا تبرد حتى يتم وطد تماما.
    2. أزاله العفن بعناية مع ملقط أو شفره الحلاقة. ملء الطبق مع ماء البيض مع 0.01 ٪ tricaine وغطاء حتى الاستخدام.
  3. تحميل الاجنه لتصوير الأنابيب العصبية.
    1. السماح الوراثية أو حقن حجم الفلورسنت--خفض والسيطرة علي الاجنه لتطوير حتى المرحلة 20-25 الجسيده (تقريبا 18-22 h بعد الإخصاب). الاجنه التعبير عن التسمية غشاء الفلورسنت (م-mCherry، mBFP1، أو ميم-mcitrine) ومراسل المحورة وراثيا من زخرفه الأنبوب العصبي (nkx 2.2: mgfp، dbx1b: gfp، أو Olig2: dsred) تستخدم للتصوير.
    2. استبدال البيض المياه المتوسطة في جبل الظهرية المعدة مع 0.01 ٪ tricaine حل العمل. ماصه برفق في الاجنه لتكون في الآبار في الجبل الظهري.
    3. التعامل مع الاجنه في الاتجاه الصحيح بحيث يواجه الراس إلى الامام في الجبل والذيل لافتا نحو الخلف مع الجزء الظهري الذي يواجه نحو سطح الماء.
    4. توجيه الجنين بحيث الذيل هو الكذب شقه وليس أشار إلى أسفل نحو الجزء السفلي من الطبق. ومن المفيد في بعض الأحيان للراحة الجزء الخلفي من الذيل علي الحافة الجانبية للتركيب جيدا لمنع الذيل من الغرق والتصوير عن غير قصد الدماغ المؤخر. كرر لكل جنين. جعل معينه مع حجم الاجنه المخفضة التي لا تقع في عمق الآبار ليكون الذين يعانون من النقص.
    5. الدمج بعيدا عن منطقه التركيب والتلاعب 25 مم × 25 مم غطاء الزجاج بحيث يتم أزاحه 45 درجه من اتجاه المسافة البادئة مربع التي ادلي بها العفن. الشريحة كوفيرسليب علي العفن في هذا الاتجاه حتى كل زاوية يستريح من جانب مختلف من العفن.
    6. ببطء تدوير الغطاء حتى انه يسقط برفق إلى منطقه التصاعد. تاكد من ان الاجنه لا تزال مثبته في المواضع والاتجاات الصحيحة. إذا كان الكثير من الحركة الناجمة عن سقوط الغطاء ، وأزاله بلطف وتكرار تصاعد من الخطوة C.
  4. صوره في 3-د الحبل الشوكي النامية.
    1. نقل الطبق الذي يحتوي علي الاجنه المثبتة إلى المجهر البؤري برفق. للتصوير الحي علي المدى الطويل ، تاكد من استخدام المجهر المحتضن. والا فان درجات الحرارة المنخفضة مقبوله.
    2. تحت أضاءه برايت فيلد ، انتقل إلى الجنين للصورة وتوسيط مجال الرؤية علي الموضع الامامي الخلفي المفضل. وللتمكين من اجراء مقارنه مفصله بين الاجنه ، يجب ان يكون هذا الوضع علي كل جنين متسقا.
    3. تعيين المعلمات التصوير لأثاره والتقاط اشاره من البروتينات الفلورية يجري imaged. يمكن ضبط المعلمات بالعين لإنشاء صوره مطلوبه علي العينة الاوليه. لتمكين تناسق القياس ، تطبيق هذه الإعدادات علي جميع الاجنه في مجموعه البيانات. إذا كانت العديد من المكدسات z مطلوبه تحسين إعدادات السرعة.
    4. باستخدام إعدادات المكدس z ، قم بتعيين المستوي الأدنى والأعلى للتصوير المطلوب. للحصول علي جوده الصورة المثلي في المكدس z ، قم بتعيين الدقة z إلى الأعلى الأمثل لاعداد الفتحة. يمكن إنشاء صور جيده مع 1 μm z-تباعد.
  5. تحليل بيانات التصوير بأي طريقه مفضله.
    ملاحظه: في هذه الحالة ، تم اجراء تحليل مع البرامج النصية MATLAB المخصصة التي تمكن تجزئه بسيطه من الأجزاء العصبية من صوره والتقدير الكمي للاشاره التصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انخفاض حجم صفار البيض مهم لمورفولوجية الطبيعية
كما هو موضح مؤخرا في المويدو-كاستيلو وآخرون17، يمكن الحد من حجم الاجنه دون الحد من حجم صفار البيض. للمقارنة مع وبدون خفض حجم صفار البيض ، قمنا بكل من التقطيع علي خطوتين (كل من البدائية والصفار) والتقطيع البدائي فقط (الشكل 2 والفيلم التكميلي 1). وقد أظهرت الاجنه المقطعة من خطوتين الشكل العام الطبيعي بالمقارنة مع الاجنه التي تتحكم فيها (dechorionation فقط) ، بخلاف اختلاف الحجم ، طوال مرا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تاريخيا ، من بين الفقاري الحيوانية ، تم اجراء تخفيض الحجم بشكل رئيسي باستخدام الاجنه البرمائية ، عن طريق إخراج الاجنه علي طول المحور النباتي للحيوانات في المرحلة البدائية12. ومع ذلك ، هناك أساسا اثنين من الاختلافات بين الاجنه الضفدع والزبرافيش عندما كنا شطر الاجنه. أولا ، في المرحلة التي تصبح فيها الاجنه الزكية متسامحة مع الانشقاق (مرحله البدائية) ، يقع المنظم في منطقه محظوره من الهامش البدائي18،19،<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي مصالح متنافسة أو مالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل برنامج الوكالة اليابانية للعلوم والتكنولوجيا (JPMJPR11AA) والمعهد الوطني للمنح الصحية (R01GM107733).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق PYREX Petri 60 ممCORNING  3160-60
Agaroseaffymetrix75817لعمل حامل للتصوير المباشر
Agarose ، درجة حرارة تبلور منخفضة من النوع VII-ASIGMA-ALDRICHA0701-25G
CaCl2< / sub>EMDCX0130-1لحل 1/3 Ringer
CaSO4< / sub>لغطاء ماء البيض
(25 مم × 25 مم ، سمك 1)CORNING2845-25
ملعقة يمكن التخلصمنها VWR & nbsp ؛80081-188
لوح الرغوةELMER'S951300لحاضنة المجهر
Forcept (رقم 55) FST11255-20
ماصة زجاجيةVWR14673-043
HEPESSIGMA Life ScienceH4034لحل 1/3 Ringer
INCUKIT XL لحاضنات الخزانةحاضنة Warehouse.comلحاضنة المجهر
ملح البحر الفوريالمحيطالفوري 138510لمياه البيض
KClSIGMA-ALDRICHP4504ل 1/3 محلول Ringer
ميثيل السليلوزSIGMA-ALDRICHM0387-100G
NaClSIGMA-ALDRICHS7653ل 1/3 محلول Ringer طبق
بتريفالكون351029ل صنع حامل للتصوير الحي
الفينول الأحمرSIGMA Life ScienceP0290
مضخة الماصةBEL-ART PRODUCTSF37898
PronaseEMD Millipore Corp53702-250KU
Tricaine-S (MS222)WESTERN CHEMICAL INC
رقيقة جدا صلبة 316L Dia. 0.035 مم أسلاك نسج الفولاذ المقاومساندراتم الحصول على السلك الذي استخدمناه ~ منذ 20 عاما ولم نتمكن من العثور على نفس السلك بالضبط. يحتوي هذا المنتج على نفس المادة والقطر مثل المنتج الذي نستخدمه.
NC0135573 للصدأ

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
  3. Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
  4. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
  5. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
  6. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217(2009).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  8. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113(2009).
  9. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394(2009).
  11. Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
  12. Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
  13. Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann's organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
  14. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
  15. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  18. Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
  19. Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
  20. Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
  21. Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Zebrafish EmbryosSize Reduction TechniqueBlastula ChoppingYolk WoundingEmbryo RecoverySomite FormationNeural Tube ScalingLive ImagingMethyl CelluloseRinger Solution

مقالات ذات صلة